BÁO CÁO KHOA HỌC: "ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ ĐÁNH DẤU GEN MÙI THƠM TRÊN LÚA" pptx

ỨNG DỤNG MARKER PHÂN TỬ ĐÁNH DẤU GEN
MÙI THƠM TRÊN LÚA

Nguyễn thị Lang & Bùi Chí Bửu
Viện lúa Đồng bằng Sông Cửu Long

I MỞ ĐẦU

Mùi thơm được tách từ nhựa (resine), dầu hương dầu
(baldams) thực vật xem như thành phần của mùi thơm được
đánh dấu bằng một chỉ thị là mùi. Mùi thơm hay còn gọi là
bột thơm khi nấu cơm mùi vị bốc hơi cho thấy một hợp
chất chính của formaldehydes, ammonia và hydrogen
sulfide. Một số nhà nghiên cứu cho rằng có sự gia tăng chất
propanol, pentanal, và hexanal trong thời gian dự trữ. Hơn
100 thành phần chất bột như hydrocarbons, alcohols,
aldehydes, ketones, acids, esters, phenols, pyridines,
pyrazines, và thành phân khác khi nấu cơm .

Chứng minh chất 2-acetyl-1-pyrroline trong giống hai
giống lúa Basmati 370 và Jamine có liên quan đến mùi
thơm. Emmanual 1993 đã báo cáo thông qua đánh HPLC
thông qua cách đánh gía của gạo IR 64, Azucena, và
Basmati, chứng minh pentanol, hexanol, benzaldehyde, va
2-acetyl-1 pyrroline, 2-acetyl-1 pyrroline là thành phần
chính trong mùi thơm của gạo.

Nghiên cứu di truyền của mùi thơm trên lúa cho thấy rằng
gen mùi thơm được kiểm chứng bởi một gen lặn ( Berner v
ctv 1989) . Ahn et al 1992 báo cáo rằng marker ADN liên
kết với gen mùi thơm .Đoạn nhiễm sắc thể từ ( Della)dùng

làm donor được tách bởi kỹ thuật RFLP,thông qua phát
triển dòng đẳng gen ( NILs) . Dùng RFLP cho thấy sự liên
kết đơn gen với RG 28 trên nhiễm sắc thể số 8 ở khoản
cách gần 4.5cM( Ahn va ctv 1992). Mới đây bản đồ fine
mapping được Lang và ctv 2002 thiết kế với khoảng cách
di truyền là 1,8cM .Nhờ marker phân tử liên kết rất chặt với
mùi thơm và từ đó có thể phát hiện đồng hợp tử và dị hợp
tử giai đoạn thế hệ ban đầu, rút ngắn thời gian cải tiến trong
chọn giống Lang và ctv 2002. Trong bài nầy áp dụng
marker để đánh giá các giống có mùi thơm nhầm phục vụ
cho mục tiêu chọn giống luùa có hương vị .

II. VẬT LIỆU & PHƯƠNG PHÁP

II.1. Vật liệu

Sử dụng mẫu giống lúa bản địa từ Ngân Hàng gen của
VLĐBSCL và nhóm lúa cao sản được thu thập bao gồm:
217 giống lúa mùa đa dạng hóa nguồn gen và dùng 7 giống
lúa có phẩm chất ngon để phát triển quần thể (bảng 1)
Bảng 1: Đặc điểm các giống được sử dụng làm vật liệu lai



II.2. Phương pháp

II.2.1. Đánh gía kiểu hình về tính trạng phẩm chất lúa

Đánh giá mùi thơm

Hạt của cây (cá thể của BC
2
F
3
) được bóc võ trấu bằng tay.
Mười hạt của mỗi cá thể BC
2
F
3
được nghiền bằng máy Wil
grinder, tốc độ trung bình. Bột gạo của mỗi hạt được đặt
trong một hộp plastic 5x5 cm. Mỗi hộp, chúng tôi cho vào
500l alkali pha loãng (1,7%) và đậy lại. Mẫu đã xử lý
được đặt trong điều kiện nhiệt độ của phòng thí nghiệm
trong 30 phút. Các hộp được mở ra từng cái theo thứ tự, rồi
đánh giá mùi thơm bằng phương pháp ngữi. Những cá thể
dị hợp tử được ghi nhận trên cơ sở biểu hiện mùi thơm
hoặc không thơm của hạt ở BC
2
F
3
. Chọn 10 hạt của 10 cá
thể BC
2
F
3
individual được xem như đồng hợp đối với tính
trạng thơm. Sự thể hiện mùi thơm và không thơm ở BC
2
F

3
cho thấy tính chất dị hợp tử của cá thể nghiên cứu. Do tính
chất quan trọng và mức độ chính xác của đánh giá kiểu
hình, đặc biệt là trong phân tích con lai trồng dồn (bulk
segregants), chúng tôi phân tích thêm 30 hạt cho mỗi kiểu
gen đồng hợp thơm và đồng hợp không thơm. Nó phải đảm
bảo độ chính xác cao trong qui trình MAS.

Do yêu cầu chính xác trong đánh giá kiểu hình phục vụ
trong marker phaân tõ chúng tôi thu thập mẫu lá ở giai
đoạn đẻ nhánh. Mỗi cá thể, chúng tôi thu 10 lá và cắt ra
thừng mẫu có chiều dài 5mm, rồi đặt chúng vào lọ thủy
tinh có nấp đậy, rồi tồn trữ trong điều kiện -20oC trước khi
đánh giá mùi thơm. Mỗi giờ, chúng được cho điểm đối với
từng mẫu lá được ướp lạnh, đặt trong ống nghiệm có nấp
đậy, và trộn với 5ml dung dịch 1.7 % KOH trong 10 phút ở
50oC. Bốn đến năm người cho điểm theo cảm quan bằng
phương pháp ngữi mùi.

II.2.2.Phát triển quần thể

Phương pháp lai : hồi giao (Backcross), từ các tổ hợp lai:
IR64/ Hoa Lài, IR64/Khao Dawk Mali 105,IR64/Nàng
thơm Chợ Đào, IR64/OM 1706, IR64/Jasmine 85

II.2.3.Phương pháp phân tích "PCR-based MAS"

Tách chiết ADN

Phân tử ADN phục vụ cho yêu cầu phân tích PCR được

chuẩn bị theo qui trình simplified miniscale. Một mẫu lá
tươi, non (2 cm) được thu và đặt trong ống nghiệm ly tâm
1,5ml có đánh dấu, trong đá lạnh. Lá được nghiền trong cối
và chày (Spot Test Plate -Thomas Scientific) sau khi đã
thêm vào 400 l dung dịch đệm (50 mM Tris-HCl pH 8.0,
25mM EDTA, 300mM NaCl and 1% SDS). Nghiền mẫu
đến khi dung dịch đệm có màu xanh lá cây. Thêm 400l
dung dịch đệm rồi trộn đều. Chuyển 400 l lysate vào ống
nghiệm có mẫu lá ban đầu. Lysate sẽ kích hoạt phản ứng
tách protein nhờ cho vào 400l chloroform. Vật thể nổi
(supernatant) được chuyển vào ống nghiệm mới (1.5 ml) và
ADN được kết tụ nhờ sử dụng cồn ethanol. Mẫu ADN
được làm khô nhờ gió và ngưng kết trong 50l dung dịch
đệm TE (10mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0).
Chúng tôi sử dụng aliquot 1l cho phân tích PCR. Mẫu
ADN được tồn trữ trong tủ lạnh sâu -20
o
C để sử dụng.

primer

Trình tự của RG28 (Ricegenes) được thiết kế từ RFLP điều
khiển tính trạng mùi thơm (Lang et al 2004)

RG28.F
5'-GATCTCACTCCAAGTAAACTCTGAC-3'

RG28.R
5'-ACTGCCATTGCTTCTGTTCTC-3'

Hơn 31 microsatellite marker t trông Cornel cua Hoa Ky
được sử dụng để phân tích đa dạng nguồn gen

Xét nghiệm microsatellite

Khuếch đại PCR được thực hiện trong 10mM Tris-HCL
(pH 8), 50mM KCl, 1.5mM MgCl
2
.1 đơn vị của TAKARA
Taq, 4 nmol dNTP, 10pmol primer và 50ng ADN hệ gen.
Chu kỳ PCR: tách dây đôi ở 95
o
C trong 5 phút, theo sau là
35 chu kỳ 94
o
C trong 60 giây, 55
o
C trong 30 giây và 72
o
C
trong 60 giây. Qúa trình kéo dài dây sau cùng là 72
o
C trong
5 phút. Cho thêm vào 13l dung dịch đệm (98%
formamide, 10mm EDTA, 0.025% bromophenol blue,
0.025% xylene cyanol) sau khi PCR. Đa hình trong sản
phẩm PCR được phát hiện nhờ thuốc nhuộm ethidium
bromide sau khi điện di trên 5% agarose gel.

Cho điểm microsatellite và phân tích liên kết gen

Marker được cho điểm căn cứ sự có hoặc không có của
băng theo hai băng chuẩn: con lai phân ly (segregant) có
mùi thơm và không có mùi thơmtheo bố mẹ. Những băng
khác nhau như vậy được cho điểm 1 (aroma) hoặc 2 (non-
aroma). Liên kết giữa SSR marker và gen fgr được ước
đoán theo bản đồ liên kết gen trong phần mềm
MAPMARKER (Lander 1989)

Phân cắt sản phẩm PCR với enzym giới hạn tương ứng

Nếu số band hiện trên màn ảnh là đơn hình
(monomorphic) , bắt buộc chúng ta tiếp tục bước tiếp theo
là dùng enzyme để tiêu hóa. Các enzyme có chiều dài từ 4-
8 bp cho thấy kiểu băng đơn hình. Sau khi thử nghiệm với
enzyme tương ứng chúng sẽ biểu hiện đa hình.
Phân tích phông sai kieu hình va he di truyeàn theo Bu va
Lang 2003

III. KếT QUả

III.1 Điều tra nguồn vật liệu

Điều tra nguồn vật liệu cung cấp tính trạng mục tiêu được
chuẩn bị để phục vụ cho công tác lai tạo sau này.

Mẫu giống có tính trạng mùi thơm cấp 2 chiếm tỉ lệ rất thấp
(8%)

III.2. Phân tích đa dạng di truyền :

áp dụng mô hình phân nhóm di truyền và phân tích
khoảng cách di truyền bằng marker phân tử, microsatelite
để phân nhóm di truyền 38 mẫu giống lúa mùa tại 31 loci
khác nhau. Các primer cho nhiều alen là RM180, RM183.
Kết quả ghi nhận có 5 nhóm chính (cluster) và nhiều nhóm
phụ (subclusters). ( bảng 2, hình 2)
Bảng 2: Kết qủa phân nhóm của 38 mẫu giống tại 31 loci



Phân nhóm di truyền

áp dụng phần mềm “PopGene” để phân tích, các nhóm di
truyền được phân chia như sau

- Nhóm 1: bao gồm hai giống ở lane số 31 (Móng chim)
và lane số 32, 34 (Đuôi trâu, Nếp Ba Tập) với khoảng cách
di truyền gần nhau.

- Nhóm 2: Nếp Huyết rồng

- Nhóm 3 có nhiều nhóm phụ. Đặc biệt không có trùng
hợp giữa Nhen số 17 với Nàng Nhen (lane số 5)

- Nhóm 4 chia ra hai nhóm phụ bao gồm các giống lúa
thơm ở ĐBSCL. Trong nhóm này, hai giống có cùng
khoảng cách di truyền là Thơm Sớm và Nàng thơm, chúng
đều biểu hiện tính trạng thơm nhẹ

- Nhóm 5 có hai nhóm phụ, giống lúa thơm Tàu hương
có khoảng cách di truyền rất gần với Nếp Đài Loan .


Hình 2: Phân nhóm di truyền lúa mùa tạ 31 loci khác nhau
của microsattelite
1: Nếp Tàu Hương, 2: Nàng thơm, 3: Thơm Sớm, 4: Nàng
thơm, 5:Nhen, 6: Hai Bông, 7: Nếp Sáp , 8: Cà Đôn, 9: Nếp
Mống Chim, 10: Ba Thiệt , 11: Nếp Cá Rô 12: Năm Lựa8,
13: Nếp Đài Loàn, 14: Nếp Than, 15: Thằng Còn , 16:
Trắng bồ Câu , 17: Nhen, 18: Nếp mùa sơm, 19: Nếp huyết
Hồng , 20:Nếp mỡ, 21: Nếp Lùn , 22: Trắng Tép , 23: Tép
hành , 24: Trắng Phiếu , 25: Trắng Tròn , 26: Lùn Cẩn, 27:
Nàng Gao, 28: Nếp Bồ Câu, 29: Nếp Phú , 30: Thần nông
Lùn, 31: Mống chim Ô, 32: Đuôi châu, 33: Trời Cho, 34:
Nếp Ba Tập , 35:Nếp đỏ , 36: Hoa Lai , 37: IR 64 , 38:
Khao Daw Mali 105


III.3. Lai phân tích và hình thành quần thể BC

Hình 3: Phát triển dòng lai BC tại VLĐBSCL


Giống IR 64 được Viện lúa Quốc tế phát triển năm 1985,
và được công nhận giống quốc gia tại Việt nam năm 1989,
là giống năng suất cao, hàm lượng amylose trung bình (23-
25%), không thơm. Giống Hoa lài là giống mùa địa phương
phát triển ở Tỉnh Đồng Nai, hạt dài, hàm lượng amylose

thấp(16,1%), có mùi thơm (cấp 1). Khaodawk Mali 105: là
giống lúa mùa của Thái Lan, hàm lượng amylose 20-22%,
có mùi thơm (cấp 2). Nàng thơm Chợ Đào: giống lúa thơm
cổ truyền, nguồn gốc từ làng Mỹ Lệ, Long An, có hàm
lượng amylose trung bình (24,0%), mùi thơm cấp 2. Giống
Jasmine 85 có nguồn gốc từ Mỹ, và IRRI, có hàm lượng
amylose trung bình và mùi thơm (cấp 2).

Giống lúa có khả năng làm vật liệu tái tục (recurrent
parent) và amylose trung bình như IR64 được sử dụng để
phát triển quần thể BC
2
F
2
của IR64/ OM1706// IR64, IR
64/ VĐ20// IR64 và IR64/ Jasmine 85 // IR64 .

Một số tổ hợp được quan sát trên quần thể F2 với hai
thông số hệ số di truyền (Hbs) và phương sai kiểu gen (


g
2
) đối với hàm lượng amylose, % protein, độ bền thể gel
(GC), và mui thôm . Kết quả ghi nhận ở bảng 3 cho thấy
hàm lượng amylose của các tổ hợp cho thấy hệ số di truyền
khá cao, chứng tỏ rằng amylose được kiểm soát chủ yếu do
yếu tố di truyền bên trong. Gía trị hệ di truyền thấp được
ghi nhận đối với tính trạng độ bền thể gel, mui thôm . Một
vài tổ hợp ghi nhận hàm lượng protein có hệ số di truyền

thấp . Điều nầy cho thấy ảnh hưởng quan trọng của tương
tác giữa kiểu gen và môi trường (GxE) trong hầu hết các
tính trạng của phẩm chất hạt. Qua bảng 3 cũng khẳng định
rằng nếu đánh gía quần thể trên F2 cho thấy mùi thơm
tương tác với môi trường rất cao trên cà 4 tổ hợp lai .
Bảng 3: Hệ số di truyền và phương sai của vài tổ hợp, phân
tích quần thể F2



III.4. Phân tích di truyền gen điều khiển mùi thơm

Biến thiên kiểu gen

Bản đồ gen điều khiển tính trạng mùi thơm được thiết
lập trên cơ sở marker RG28 (Lang và ctv 2002). Việc thiết
kế các primer, chuyển đổi từ RFLP thành STS để đánh giá
kiểu gen mùi thơm thông qua marker phân tử với chuỗi
trình tự như sau:

RG28FL: GATGGGGTAGACTAGACCAT
RG28RL:CTCCAGTGGTATTAATTGCC
28FB: CTCCAGTGGTATTAATTGCC
RG28RB:GCTGTTACGAGTTACGATG

Dùng marker RG28FB-RB thử trên quần thể IR64/Khao
Dawk Mali 105 cho thấy phản ứng đơn hình. Tuy nhiên,
với cố gắng chọn 20 enzyme phân cắt, kết quả enzyme
EcoRI cho ra hai băng đa hình. Một băng kích thước 1,2kb
tương ứng với IR64 và một băng có kích thước 1kb tương

ứng với Khao Dawk Mali 105. ứng dụng marker này để thử
trên quần thể 90 cây BC
2
F
3
từ tổ hợp IR64/ Khao Dawk
Mali, kết quả phân tích mức độ chính xác khi so sánh giữa
kiểu gen và kiểu hình thấp 60% (Bảng 4) .
Bảng 4: So sánh kiểu hình và kiểu gen trên quần thể BC
2
F
3

của IR64 / KDM105



Do kỹ thuật STS cho đa hình thấp, chúng tôi thiết kế lai
một microsatellite dựa trên cơ sở clone có sằn.

Thiết kế Primer RG28 thông qua kỹ thuật SSR với chuỗi
trình tự sau:

RG28.F 5'-GATCTCACTCCAAGTAAACTCTGAC-3'
RG28.R 5'-ACTGCCATTGCTTCTGTTCTC-3'

Đánh giá mùi thơm

Dùng phương pháp KOH để đánh giá kiểu hình và dùng
SSR primer để đánh gía kiểu gen. Primer RG 28F-R để

dùng thử trên các giống lúa: IR64, OM1490, VĐ20, Khao
Dawk Mali 105, Hoa Lài. Đa hình biểu hiện rất rõ giữa các
giống này vói RG28.

Biến thiên kiểu hình

Quần thể BC
2
F
3
được phát triển từ KhaodawkMali/
OM1490. Khaodawkmali 105 được xem như là giống có
chất lượng cao và mùi thơm. OM1490 là giống cải tiến,
ngắn ngày không thơm.


Khao Dawk Mali, OM1490, Jasmine (thơm), và 250 cá thể
BC
2
F
3
được sử dụng để đánh giá mùi thơm. Phân ly 71
dòng thơm : 179 dòng không thơm ở BC
2
F
3
cho thấy sự
biểu hiện của một gen lặn fgr đáp ứng theo định luật di
truyền Mendel với tỉ lệ 1:3. Trong 250-BC2 F
3

của tổ hợp
lai Khao Dawk Mali x OM1490, có một sự biến thiên khá
lớn về tính trạng mùi thơm. Phân bố tần suất của thơm :
không thơm trong quần thể BC
2
F
3
có tính chất liên tục.
Mùi thơm của Khao Dawk Mali đạt điểm 2, của OM1490
đạt điểm 0. Có khoảng 39.66% cá thể BC
2
F
3
có mùi thơm
như Khao Dawk Mali và 61.30% không có mùi thơm như
OM1490. Điều này cho thấy một sự tái tổ hợp rất tốt về
tính trạng aroma trong quần thể này.

Phân tích hạt của quần thể BC
2
F
3
để kiểm tra độ phân ly
tính trạng thơm và không thơm. Kết quả cho thấy 118 cây
không thơm, 33 cây thơm nhẹ, 37 cây thơm, và 12 rất
thơm. Dựa vào thang điểm không thơm = 1, thơm nhẹ = 2,
thơm = 3 và rất thơm = 4, cho thấy rằng tính chất thơm rất
phức tạp (hình 4)

Hình 4: đánh gía kiểu hình trên quần thể BC

2
F
3

KhadawMali 105 và OM 1490


Đối với STS marker, đa hình giữa giống KhaoDawk Mali
và OM1490 trên RG28 biểu thị khá rõ. Bản đồ gen liên kết
gen của mùi thơm được thiết lập trên hai marker RG28 và
RM223 cho thấy khoảng cách di truyền với gen fgr là
1,8cM và 13,2 cM trên nhiễm sắc thể số 8, theo thứ tự
(Lang va ctv 2003) . Marker RG28 cho đa hình giữa hai
nhóm thơm và không thơm với độ lớn phân tử sau khi chạy
điện di biến động trong quãng 90 và 190bp.

Đối với KhaoDawkMali 105 (thơm) và OM1490 (không
thơm), kích thước phân tử của KDM là 120bp và của
OM1490 là 60bp (Hình 5)

Hình 5: Sản phẩm PCR quần thể BC2 F3 của KhaoDawk
mali 105/ OM1490, với primer RG 28F-R


Phân tích giá trị dự đoán kết quả so sánh giữa kiểu gen
và kiểu hình để khuyến cáo MAS (marker assited selection)
trong chọn giống lúa có gen thơm với RG28F-R cho kết
qủa rất cao 92% (Bảng 4)

Bảng 4: Ước đoán mức độ chính xác trên quần thể BC2 F3

từ Khao DawMali 105/ OM 1490


IV. Kết luận

Đối với cây lúa, sau mục tiêu năng suất, phẩm chất hạt là
một yêu cầu vô cùng quan trọng, đặc biệt là mùi thơm. Mùi
thơm cũng đáp ứng với thị hiếu của người tiêu dùng trong
một số khu vực trên thế giới. Thị trường gạo thơm là thị
trường gạo cao cấp với giá trị thương mãi rất cao. Mùi
thơm là một tính trạng rất phức tạp trong thể hiện kiểu
hình, bởi vì nó lệ thuộc vào môi trường bên ngoài khá phức
tạp. Chúng ta có thể đã loại bỏ rất nhiều con lai có gen
thơm, nhưng kiểu hình không thể hiện do ảnh hưởng môi
trường do vậy dùng marker phân tử khẳng định lại đánh gía
các tính trạng thông qua kiểu gen và không bị ảnh hưởng
tác động điều kiện môi trường. Thực hiện marker RG 28F-
R cho kết qủa liên kết giữa marker và gen mục tiêu với
khoảng cách di truyền khá gần là trong quần thể
KDM/OM1490, và ước đoán mức độ chính xác là 92%.
Với marker nầy có thể áp dụng chọn lọc và phục vụ chọn
giống lúa mùi thơm.

SUMMARY

APPLY MOLECULAR MARKER EVALUATED FOR
AROMA GENE IN RICE

The genomic clone RG28 , which is tighly linked to frg
gene in rice, provides to perform marker aided selection in

rice breeding program. This study was to apply molecular
marker through using SSR markers linked to fgr gene in
rice. RG28 can be converted by sequencing into SSR and
used as primers for PCR amplification of genomic DNA
from rice varities differing aromatic responsiveness. DNA
marker-assited selection was used to detect fgr gene
through examining the power of identified SSRs in
predicting the phenotype of the fgr locus. Genotypes of F
2

individuals at this locus were determined by performing
progeny testing for fgr in the BC
2
F
3
generations. The
results indicated an accuracy of more than 92% in
identifying aromatic rice plants which were similar to that
using RG28F-R. Germplasm survey was implemented to
become useful for parents selection in breeding program to
aim at transferring the gene from donor to another.

Từ khóa: Aroma, marker-assisted selection (MAS),
microsatellite, SSRs (simple sequence repeats)

Tài liệu tham khảo

Ahn SW, CN Bollich and SD Tanksley. 1992. RFLP
tagging of a gene for aroma in rice. Theor. Appl. Genet.
87:27-32

Berner DK, BJ Hoft. 1986. Inheritance of scent in America
long grain rices. Crop Sci. 26:157-159.
Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang 2003. Giáo trình di
truyền số lượng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp
Nguyen thi Lang and Bui Chi Buu 2002. Identification and
fine mapping of SSR marker linked to fgr gene of rice,
omonrice 10: 16-22.
Nguyễn Thị Lang , Nguyễn Thị Tâm, Trịnh Thị Lũy và Bùi
Chí Bửu , 2004. ứng dụng marker phân tử trong chọn tạo
giống lúa phẩm chất gạo tốt amylose trung bình và mùi
thơm. Báo cáo đề tài cấp Bộ .44 trang
Lander ES, D Botstein. 1989. Mapping Mendelian factors
underlying quantitative traits using RFLP linkage map.
Genetics 121:185-199.

Người thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương