BÁO CÁO KHOA HỌC: "XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADN MẠCH VÒNG" pps

XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADN
MẠCH VÒNG

Nguyễn Thị Hồng Hạnh
Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG.

I. MỞ ĐẦU

Các ADN mạch vòng được phát hiện trong nhân của vi
khuẩn, trong ty thể, trong các lục lạp của thực vật cũng như
của động vật [1, 2, 3]. Một ADN vòng có thể là một đơn
thể (1a) hoặc một nhị thể với các cấu hình khác nhau. Các
ADN mạch vòng gồm hai phần hệt nhau có thể được sắp
xếp đối xứng (1b) hoặc không đối xứng (1c).

Trong điện trường của điện di thông thường, các ADN
mạch thẳng và ADN mạch vòng dịch chuyển trên cùng một
quĩ đạo. Tuy nhiên, trong từ trường của điện di xung -
PFGE, dưới ảnh hưởng của các vector không cân xứng với
hiệu điện thế và thời gian tác động khác nhau [4], các ADN
mạch thẳng và mạch vòng dịch chuyển trên các quĩ đạo
hoàn toàn riêng biệt và vì vậy có thể xa rời nhau. Dựa trên
nguyên tắc trên, điện di xung –PFGE không cân xứng đã
được sử dụng để phân biết và phân giải các ADN có các
cấu trúc khác nhau

Hình 1- Các ADN mạch vòng có thể là một đơn phân (a),
nhị phân đối xứng gồm hai nửa giống nhau sắp sếp theo
kiểu đầu - chụm - đuôi (b) hoặc không đối xứng có cấu trúc
đầu - chụm - đầu (c).

Nguyên sinh động vật Leishmania sống ký sinh trong các
đại thực bào của người và động vật. Các bệnh mà ký sinh
trùng gây nên thường khác nhau, do Leishmania có một hệ
genom rất mềm dẻo và luôn thay đổi. Các yếu tố di truyền
mạch vòng có nguồn gốc từ một nhiễm sắc thể mẹ thường
được phát hiện trong nhân của chúng. Các ADN mạch vòng
thường có cấu trúc khác nhau. Mạch vòng CD1 trong L.
Major là một nhị phân có cấu trúc đặc biệt gồm hai nửa
giống nhau nhưng xếp đặt theo kiểu đầu chụm đầu, trong
khi đó mạch vòng CD1 của Leishmania mexicana M379 có
thể là một nhị phân [5]

Trong bài báo này, chúng tôi trình bầy các phương pháp
được sử dụng để xác định phân tử lượng của yếu tố di
truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 của nguyên sinh động vật
Leishmania M379 nói riêng và của các ADN mạch vòng
nói chung. Phương pháp đã được sử dụng có kết quả để xác
định phân tử lượng của một mạch vòng mini trong hệ gen
ty thể của nguyên sinh động vật Leishmania [6].

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.

1. Nguyên liệu

Nguyên sinh động vật Leishmania M379 thuộc chủng
Garnham (G1) được nuôi trên môi trường GLSH có bổ
xung 10% huyết thanh bê [7] ở nhiệt độ 26o C và cấy
chuyển hai lần một tuần.

2. Phương pháp

- Tách chiết ADN.

Nguyên sinh động vật Leishmania được nuôi trong môi
trường GLSH đến giai đoạn log để tách chiết ADN. Ký
sinh trùng được ủ trong dung dịch tan (100 mM Tris pH 9 ,
200 mM EGTA, 2% EDTA và RNA-ase) trong 2 giờ ở
37
o
C. Sau khi bổ xung proteinase K (20g / ml) mẫu được
ủ tiếp trong vài giờ ở 55
o
C. ADN được làm sạch và tách
chiết bằng phenol.

- Cắt ADN của Leishmania

Các men ClaI và Xbal ( Promega) ở các nồng độ khác nhau
được dùng để cắt ADN của Leishmania. Phản ứng cắt được
tiến hành ở 37
o
C trong 2 giờ.

- Chuẩn bị PFGE block

Nguyên sinh động vật Leismania nuôi ở giai đoạn log được
dùng để chuẩn bị PFGE block theo phương pháp của Van
der Ploeg [8]

- Đánh dấu đồng vị phóng xạ

Phân tử mạch vòng CD1 được tách bằng phương pháp điện
di xung PFGE [9]. Chúng được cắt với EcoRI trước khi
được đánh dấu phóng xạ với 32 P theo phương pháp đã
được công bố [10]

- Kỹ thuật điện di xung

Các phân tích PFGE nhằm phân tách các nhiễm sẵc thể
được tiến hành như đã được miêu tả [9]

- Lai Southern và các phép đo đồng vị phóng xạ

Lai Southern được tiến hành theo các phương pháp chuẩn
[10]. Các tín hiệu lai phóng xạ được phát hiện trên phim
Kodak X trong vòng 24 giờ.

II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Cắt hạn chế và lai Southern để xác định phân tử lượng
của CD1

Nhằm xác định phân tử lượng của yếu tố di truyền ngoài
nhiễm sắc thể CD1, ADN genome của Leishmania, chủng
G1 được cắt hoàn toàn với men ClaI. Các đoạn cắt được
phân giải bởi điện di PFGE trong 7 giờ và lai Souther với
CD1 đánh dấu đồng vị phóng xạ.

Như đã thấy ở hình 2, mạch vòng CD1 dường như có phân

tử lượng khoảng 28 kb, vì khi cắt CD1 với ClaI, bốn đoạn
ADN với phân tử lượng là 3, kb ; 5., 2 kb ; 6 kb và 13 kb
đã được phát hiện như mong đợi.

Hình 2- Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 có trọng
lượng phân tử khoảng 28 kb. Bốn đoạn ADN với kích
thước thứ tự từ trên xuống dưới 1 (13 kb); 2 ( 6 kb); 3 (5,
2kb) và 4 (3, 7 kb) là sản phẩm cắt hoàn toàn của CD1 với
Cla I

Xác định cấu trúc của mạch vòng CD1.


Việc xem xét phân tử lượng của CD1 được khởi xướng khi
rất ngẫu nhiên một đoạn ADN có phân tử lượng  56 kb
được phát hiện trong điện trường cuả điện di không cân
xứng PFGE. Đoạn ADN này lai đặc trưng với CD1 (hình 3)
và không lai với các ADN khác. Chúng tôi giả thiết đoạn
ADN mới phát hiện có thể có nguồn gốc từ CD1 với phân
tử lượng là 56 kb, nó là một nhị nguyên, cấu tạo từ hai nửa
giống nhau theo kiểu đầu – chụm - đuôi.
Các kết quả thực nghiệm cho thấy, khi hàm lượng men ClaI
cao (1g ADN / 1 đơn vị men), CD1 bị cắt hoàn toàn và
cho bốn mảnh ADN với kích thước 13kb ; 6kb ; 5, 2 kb và
3,7 kb (hình 4, hàng 1), còn khi lượng men ClaI bị giảm,
CD1 bị cắt hạn chế và cho các sản phẩm cắt khác với
trường hợp đầu (hình 4, hàng 2, 3, 4, 5). Các đoạn ADN
với kích thước 28 kb, 56 kb, các tín hiệu phóng xạ đi từ
giếng của gel quan sát như dự đoán. Như vậy, CD1 đã là
một nhị nguyên cân xứng có trọng lượng phân tử là 56 kb

với cấu trúc đầu -chụm - đuôi (hình 5).

IV. KẾT LUẬN.

Bằng việc kết hợp các phương pháp khác nhau của sinh học
phân tử như cắt hạn chế, cắt hoàn toàn ADN genomic với
các men cắt thích hợp, phương pháp điện di xung PFGE và
phương pháp lai phân tích Southern , chúng tôi đã xác
định cấu trúc cũng như phân tử lượng của yếu tố di truyền
ngoài nhiễm sắc thể CD1 trong hệ genome của nguyên sinh
động vật Leishmania mexicana M379 thuộc chủng
Garnham. Chúng tôi đã sử dụng phương pháp này để xác
định cấu trúc của một số vòng mini trong hệ gene ty thể của
Leishmania mexicana M379 [4b]. Chúng tôi cho rằng
phương pháp có thể được sử dụng để xác định phân tử
lượng và cấu trúc của bất cứ ADN mạch vòng.

Lời cảm ơn: Công trình nghiên cứu này được thực hiện tại
phòng thí nghiệm của khoa Sinh học Đại cương, viện Sinh
học phân tử và Công nghệ sinh học, trường Đại học Tự do
Brussels, Bỉ. Tác giả cảm ơn sự giúp đỡ của Gs. Ts
Hamers. R và các bạn bè đồng nghiệp.

Hình 3- Một đoạn ADN mạch thẳng có phân tử lượng  56
kb ( mũi tên ) được phát hiện trong điện trường cuả điện di
không cân xứng PFGE.

1: Nhiễm sắc thể của Leishmania mexicana, chủng G1
được phân giải bởi điện di xung không cân xứng PFGE
2: thang chuẩn ADN 49 kb.

B) Các nhiễm sắc thể của gel A được lai với CD1 phóng
xạ.

Hình 4- Sự phối hợp của các phương pháp cho phép xác
định cấu trúc nhị phân của CD1.
A. Các đoạn của ADN bị cắt bởi men Cla I ở các nồng độ
khác nhau ( 1: 1 g ADN /1 đơn vị Cla I; 2: 1 g / 0, 5 đơn
vị Cla I; 3: 1 g/ 0, 25 đơn vị Cla I; 4: 1 g / 0, 125 đơn vị
Cla I và 5: 1 g / 0, 065 đơn vị Cla I )
B. Lai Southern của gel A
Các mũi tên chỉ các phân tử lượng từ trên xuống dưới 56kb;
28 kb; 6 kp; 5,2 kb và 3,7 kb.


Hình 5 - Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể trong nhân
của L. mexicana M379, chủng Garnham CD1 là một nhị
nguyên cân xứng và có trọng lượng phân tử là  56 kb


TÀI LIỆU THAM KHẢO

1- Julian. D and Smith. D. (1978). Plasmid-determine
resistance to antimicrobial agents. Ann. Rev. Microbial. 32
: 469 – 518.
2 - Liu, J; Salina, G; Gạịandran, N; Muithui, D;
Muyderman, S and Hamer, R (1991). DNA recombination
associated with short direct repeat. Mol. Biochem.
Parasitol. 50 : 351 - 355.
3 - Southern. E. M (1975). Detection of specific sequences
among ADN fragments separated by gel electrophoresis. J.

Mol. Biol. 98 : 503 – 517.
4 - Klotz, L. C and Zimm. B. H. (1972) . Macromolecule.
5: 471 - 481.
4a - Liu, J (1992). Thesis submitted for the degree of
Doctor of Science . VUB-Brussels .
4b - Nguyễn Thị Hồng Hạnh và Hammers, R (2002). Tạo
dòng phân tử và giải toàn bộ trình tự một ADN ty thể của
nguyên sinh động vật Leishmania mexicana dòng Evans
(E8). Tạp chí y học dự phòng Tập XI (6) : 22 - 24.
5 - Le Ray, D. (1975). Structure and antigenique de
Trypanosome brucei. Analyse immuno electophoretic et
etude comparative. Ann. Soc. Belge. Med. trop. 55 : 158 -
160.
6 - Van de Ploeg., Giannini, S. H and Cantor, C. R. (1985).
Heat-shock protein gene - regulatory role in parasitic
protozoan. Science. 228 : 1443 - 1449.
7 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh (1999). Molecular analysis of
the karyotype diversity between two clonal lines of
Leishmania mexicana M379, the Garnham line (ITMAP
2167) and the Evanline(ITMAP-2). Doctoral thesis.
submitted for the degree of Doctor of Science. VUB-
Brussel
8 - Feinberg, A. P and Volgelstein, B. (1983). A technique
for radiolabelling DNA restriction endonuclease fragments
to higth specificity. Cell. Biol. 126 : 6 -13.
9 - Nguyễn Thị Hồng Hạnh (2003). Phân biệt các cấu trúc
của ADN bằng phương pháp điện di xung PFGE. Những
vấn đề cơ bản của khoa học sự sống. Tr 887- 888.
10 - Maniatis, T.M., Frisch, E.F and Sambrook, J. (1982).
Molecular clonning. A laboratory Manual Cold Spring

Harbor laboratory Press. Cold Spring Harbor.

SUMMARY

EVALUATION OF THE STRUCTURE AS WELL AS
THE MOLECULAR WEIGHT OF CIRCULAR DNAS

Nguyen Thi Hong Hanh
Institute of Biotechnology, NCST

Living organisms possessed ADNs of linear and circular
structuctures with different linear and circular
configurations. Circular DNAs in the genome of living
organisms could adopt different configurations as well as
different molecular weight. In some case, it is difficult to
determine exactly their molecular weight as well as their
configuration.

The extrachromochomal circular elements CD1 was found
in the genome of Garnham strain G1 of Leishmania
mexicana M379. It seemed to be a dimer with molecular
weight  57 kb with head-to-tail configuration. By using
three methods:

i) limit and complete restring genomic DNA by appropriate
enzymes

ii) Pulsed-Field gel Electrophoresis (PFGE)

iii) Southern blot analysis, we were able to evaluate the real

molecular weight of an extrachromosomal circular DNA,
namely CD1 naturally occurring in the genome of
protozoan Leishmania. As consequence, the dimer structure
of the molecule was determined with expected
organization. The method was applied to determine the
molecular weight and structure of a minicircle class in the
mitochondria genome of Leishmania mexicana M379,
strain E8. We believed, that the methods described above
could be applied to determine the molecular weight of any
circular DNAs.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS Nguyễn Thị
Thanh Bình.