BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH MỘT SỐ GIỐNG TẰM DÂU BẰNG KỸ THUẬT RAPD" doc

NGHIÊN CỨU ĐA HÌNH MỘT SỐ GIỐNG TẰM
DÂU BẰNG KỸ THUẬT RAPD

Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng,Nông Văn
Hải
Viện Công nghệ Sinh học

I. MỞ ĐẦU

Ngày nay, việc sử dụng các chỉ thị phân tử ADN về đa hình
các đoạn ADN nhân ngẫu nhiên-RAPD (Random
Amplified Polymorphic DNA), đa hình độ dài các đoạn cắt
giới hạn-RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism), sự lặp lại các chuỗi đơn giản-SSR (Simple
Sequence Repeats) hay còn gọi là tiểu vệ tinh
(Microsatellite) để phân loại, nghiên cứu đa dạng sinh học
của động vật, thực vật và vi sinh vật ngày càng phổ biến
trên thế giới và ở Việt Nam [4, 5, 7, 8]. So sánh với phương
pháp truyền thống, phân loại và nghiên cứu đa hình bằng
chỉ thị phân tử cho kết quả có độ tin cậy cao [2].

Kỹ thuật RAPD do William và cs, 1990 [8] phát triển trên
cơ sở PCR sử dụng một số đoạn mồi ngẫu nhiên. Kỹ thuật
này đã được ứng dụng kết hợp cùng với một số kỹ thuật
khác để phân loại, nghiên cứu quan hệ di truyền giữa các cá
thể tằm dâu [1, 2, 5, 10,11]. Ở Việt Nam chưa có công trình
nào đề cập tới vấn đề này, mặc dù nghề nuôi tằm là một
trong những nghề truyền thống của đất nước, hiện đang
được đẩy mạnh phát triển, việc phân loại đánh giá đa hình
vẫn dựa vào các đặc điểm sinh học và hình thái, cho nên
còn có những hạn chế nhất định.

Trong bài báo này chúng tôi xin trình bày một số kết quả về
sử dụng kỹ thuật RAPD nghiên cứu đa hình một số giống
tằm dâu nuôi tại Việt Nam.

II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Nguyên liệu

Mẫu nghiên cứu gồm tám giống tằm đang được dùng tại
các tỉnh phía Bắc Việt Nam: TTB, TML, VC, ĐS 1, ĐS 2,
BM, THT, VYD, trong đó có bốn giống được sử dụng
nhiều trong vài năm gần đây, đó là hai giống địa phương
thuộc tập đoàn gốc đa hệ: vàng chấm [VC] và Đồ Sơn [ĐS]
hai giống tằm lưỡng hệ trắng Thái Bình [TTB] và trắng
Mai Lĩnh [TML]. Tất cả các giống tằm trên do Trung Tâm
Nghiên cứu Dâu Tằm Tơ Trung Ương, Xí nghiệp Giống
Tằm Cấp I Mai Lĩnh và Xí nghiệp Giống tằm Thái Bình
cung cấp.

Hoá chất : EDTA, Tris-HCl, SDS, Proteaza K, RNaza,
chloroform, phenol, NaCl, agaroza của các hãng Sigma,
Merck, Amersham Phamacia Biotech, Fermentas Các loại
máy móc chuyên dụng thuộc phòng thí nghiệm trọng điểm
Công nghệ Gen đặt tại Viện Công nghệ Sinh học.

2. Phương pháp nghiên cứu

Tách chiết ADN theo Wiliam và cộng sự, tham khảo thêm
tài liệu của một số tác giả khác [ 8, 9, 10] và cải tiến cho

phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm.

Xác định nồng độ ADN bằng phương pháp đo quang phổ,
kiểm tra ADN trên gel agaroza 0,8% và quan sát dưới ánh
sáng tử ngoại, chụp ảnh ở máy Geldoc hoặc Polaroid.

Nhân gen bằng kỹ thuật PCR với các đoạn mồi do hãng
Genset Singapore Biotech tổng hợp. Tổng thể tích dùng
cho một mẫu là 25 l. Chu trình nhiệt theo tài liệu của
Zhou Zheyang và cộng sự [6]. Sản phẩm PCR kiểm tra trên
gel agaroza 0,8% và 1,3%.

Công trình được hoàn thành với sự hỗ trợ kinh phí của
nhiệm vụ thường xuyên: đề tài cấp Viện Công nghệ Sinh
học

Phân tích kết quả bằng chương trình phần mềm NTSYS
phiên bản 2.0. Hệ số đồng dạng di truyền được tính theo
công thức của Nei và Li năm 1979 [3].

III. KẾT QUẢ

1. Tách chiết và làm sạch ADN từ mẫu tằm

Mẫu nghiền mịn và hoà tan trong dung dịch đệm, thành tế
bào và màng nhân được phá vỡ, giải phóng ADN. Tiếp
theo bổ sung proteinaza K để phân huỷ hoàn toàn các
protein liên kết . Sau đó, dùng hỗn hợp phenol: chloroform:
isoamylalcohol loại bỏ

Ảnh 1. Điện di ADN
1-5 : ADN của mẫu.
M : ADN /EcoRI+HindIII


các tạp chất và ly tâm thu ADN. Loại ARN bằng RNaza ở
37
o
C. Sản phẩm ADN được chạy điện di kiểm tra, đánh giá
trên gel agaroza 0,8% và đo OD trên máy đo quang phổ,
bảng 1 và hình 1 là kết quả thu được. Kết quả cho thấy, sản
phẩm nhận được cho vạch gọn và có trọng lượng phân tử
lớn hơn 21,6 kb, tỉ lệ OD
260 nm
/OD
280 nm
dao động từ 1,781
đến 2,025 cho biết ADN thu được có đủ độ sạch để làm
nguyên liệu cho PCR hoặc các nghiên cứu tiếp theo. ADN
được bảo quản lạnh trong dung dịch TE.
Bảng 1. Tỷ số OD
260 nm
/OD
280 nm
và nồng độ của ADN



2. PCR với ADN cuả tằm dâu

Chúng tôi đã tìm điều kiện tối ưu cho phản ứng nhân gen
đối với các mồi nghiên cứu [6 ], sàng lọc từ 20 đoạn mồi
ngẫu nhiên để chọn ra 5 đoạn phù hợp cho tằm. Tiếp theo
thực hiện PCR với các giống tằm, kết quả nhận được trình
bày ở bảng 2.
Bảng 2: Kết quả RAPD của các giống tằm nghiên cứu



[ Cột chỉ thị RAPD: chữ cái và số là ký hiệu của đoạn mồi,
tiếp theo là kích thước của băng. Số 1:phân đoạn DNA
được nhân. Số 0: phân đoạn ADN không được nhân. Giống
tằm 1: TTB, 2: TML, 3: VC, 4: ĐS1, 5:ĐS2, 6: BM, 7:
THT, 8: VYD]

Các băng nhân bản được sử dụng như là các chỉ thị RAPD
bao gồm hai loại đơn hình và đa hình. Băng đơn hình có
mặt trong tất cả các giống nghiên cứu, còn băng đa hình
xuất hiện ở giống này nhưng lại vắng mặt ở giống khác.
Trong tổng số 67 băng nhận được có 26 băng đơn hình,
chiếm 38,81% và 41 băng đa hình, chiếm 66,19%, kích cỡ
của các băng từ 100bp đến 3500bp. Trong 8 giống tằm
nghiên cứu có 2 giống lưỡng hệ tương đối xa nhau về quan
hệ di truyền, còn 6 giống đa hệ địa phương có họ hàng khá
gần gũi với nhau, do đó tỷ lệ băng đơn hình ở mức trung
bình thấp, tỷ lệ băng đa hình đạt mức trung bình cao hơn.
Các băng đa hình là cơ sở phân biệt giữa các giống với
nhau, có băng đa hình chỉ xuất hiện ở một giống mà không
xuất hiện ở các giống khác như băng 0P019-1200bp và
0P019-1000bp chỉ thấy ở giống TML, băng 0P019-800bp ở

giống TTB và trong nhóm đa hệ chỉ xuất hiện ở giống BM.
Với mồi 0P016, băng 300bp quan sát thấy ở giống TTB,
còn băng 400bp có ở giống TML và duy nhất ở VC trong

Hình 2: Sản phẩm PCR mồi OP 13 của các giống tằm
nghiên cứu
Giếng M: ADN /EcoRI+HindIII
Các giếng khác: mẫu của các giống tương ứng.
1-TTB 5-TML 6-VC 8-ĐS 1
9-ĐS 2 10-BM 11- THT 13- VYD


nhóm đa hệ. Hiện tượng này còn thấy ở mồi 0P013, băng
550bp ở giống THT, băng 100bp xuất hiện trong giống
TML, còn băng 1600bp chỉ thấy ở TTB. Mồi 101, riêng
giống TTB có băng 100bp và VC duy nhất mang băng
400bp trong nhóm đa hệ. Băng A7-1300bp, 900bp và
300bp không có ở 7 giống khác mà hiển hiện ở TTB. Giống
ĐS1 và ĐS2 cho các băng hệt như nhau trong 4 mồi nghiên
cứu, ở mồi thứ 5 chúng có 2 băng phân biệt. So sánh tất cả
các mồi sử dụng, mồi 0P016 có tỷ lệ băng đa hình cao nhất
11/12, còn mồi 101 có tỷ lệ đa hình thấp nhất 6/15.

Từ các số liệu thu được, chúng tôi phân tích mối tuơng
quan di truyền giữa các giống tằm nghiên cứu bằng chương
trình phần mềm NTSYS phiên bản 2.0 và trình bày ở bảng
3.
Bảng 3. Hệ số đồng dạng di truyền giữa các giống tằm
nghiên cứu

Bảng 3 cho thấy, giống TTB có hệ số đồng dạng di truyền
dao động trong khoảng 0,547 đến 0,703, thấp nhất trong
các giống nghiên cứu, còn ở giống TML chỉ số này cao
hơn, biến đổi từ 0,766 đến 0,906. Các giống trong nhóm đa
hệ có hệ số đồng dạng di truyền thay đổi từ 0,766 đến
0,984. Giống ĐS1 và ĐS2 có chỉ số cao nhất 0,984, có khả
năng đây chỉ là một giống nhưng nuôi ở hai địa phương
khác nhau.

Từ bảng hệ số đồng dạng di truyền, chúng tôi xây dựng cây
phân loại của các giống tằm và biểu diễn bằng hình 3. Dựa
trên sơ đồ hình cây biểu thị đa hình ADN giữa 8 giống tằm
nghiên cứu, chúng tôi nhận thấy các giống tằm khảo sát
được chia thành hai nhóm lớn, cụm lại ở mức độ 0,54,
nhóm thứ nhất chỉ có 1 giống TTB, còn nhóm thứ hai là các
giống còn lại, cụm ở mức độ 0,79 và chia thành hai phân
nhóm bậc I. Phân nhóm bậc I thứ nhất gồm hai giống TML
và VC, cụm lại ở mức 0,90. Phân nhóm bậc I thứ hai là 5
giống thuộc đa hệ và lại chia thành phân nhóm bậc hai
Riêng ĐS1 và ĐS2 ở phân nhóm bậc cao nhất.

Hình 1. Cây phát sinh chủng loại của các giống tằm


IV. KẾT LUẬN

1. Đã phân tích tính đa dạng di truyền của 8 giống tằm
dâu nuôi ở Việt Nam bằng kỹ thuật RAPD với 5 đoạn mồi,

kết quả nhận được 67 băng ADN nhân bản trong đó có 26
(38,8%) băng đơn hình và 41 (61,2%) băng đa hình. Đoạn
mồi 0P016 cho số băng đa hình phong phú nhất, mồi 101
có tỷ lệ băng đa hình thấp nhất.

2. Kết quả phân tích NTSYS-SIMUAL cho thấy các
giống tằm nghiên cứu có mối tương đồng di truyền trong
khoảng 0,547 đến 0,984.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Abe H, Kanehara M, Terada T, Ohbayashi F, Shimada
T, Kawai S, Suzuki M, Sugasaki T, Oshiki T, 1998.
Identification of novel random amplified polymorphic
DNAs (RAPDs) on the W chromosome of the domesticated
silkworm, Bombyx mori, and the wild silkworm, B.
mandarina, and their retrotransposable element-related
nucleotide sequences. Genes and Genetic systems,Vol 73,
No. 4, p. 243-254.
2. Li B, Lu C, Zhou ZY, Xiang ZH, 2000. Construction
of silkworm RAPD molecular linkage map. Yi Chuan Xue
Bao; 27(2):127-132.
3. Nei M., Li W.H., 1979. Mathematical model for
studying genetical variation in terms of restriction
endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 5269-5273.
4. Nguyễn Văn Đồng và cs, 1999. Nghiên cứu ứng dụng
công nghệ sinh học trong việc phát triển hệ thống lúa lai.
Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội. Tr. 1243.
5. Nguyễn Đức Thành, Phan Thị Bảy, Lê Hồng Điệp,
1999. Phát triển và ứng dụng các chỉ thị phân tử trong

nghiên cứu đa dạng phân tử ở lúa. Hội nghị Công nghệ
Sinh học toàn quốc, Hà Nội. Tr. 1205.
6. Nonnatus S. Bautista, Renando Solis, Osamu
Kamijima and Takashige Ishii, 2001. RAPD, RFLP, SSLP
analyses of phylogenetic relationships between cultivated
and wild species of rice. Genes and Genetic systems,Vol
76, No. 2, p. 71-79.
7. Zhou Zheyang et al, 1996. On the relationship
between the number of RAPD loci and the information of
molecular variation. International Symposium on
Sericulturral Science. P. 79-82.
8. William J.G.K., Kubelik, K.J. Livak, J.A.F. Rafalski
and S.V. Tingey, 1990. DNA polymorphisms amplified by
arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucle
Acids Res. 18: 6531-6535.
9. Juan Carlos Parejo, José Angel Padilla, Araceli
Rabasco, M Esther Scasinforiano, Margarita Martínez-
Trancón, 2002. Population structure in the endangered
Blanca Cacerena bovine breed demonstrated by RAPD
analyses. Genes and Genetic systems,Vol 77, No. 1, p. 51-
57.
10. Joseph Sambrook, David W. Russell, 2001.
Molecular cloning, third edition, vol. 2.
11. Xia Quingyou et al, 1996. Study on the molecular
genetic diversity of Bombyx mori. International
symposium on sericulturral science. p. 76-79.

SUMMARY

STUDY ON GENETIC DIVERSITY OF SILKWORM

STRAINS IN VIETNAM
BY RAPD MARKERS

Nguyen Thi Thanh Binh,
Hoang Thi Hang,
Nong Van Hai
Institute of Biotechnology

The random amplified polymorphic DNA (RAPD) based
on the polymeraze chain reaction (PCR) detects nucleotide
sequence polymorphism in a DNA amplification based
assay using a single 10-mer of arbitrary nucleotide
sequence. The RAPD technology has quickly gained
widespread acceptance and application because it has
provide a tool for genetic analysis in biological system that
have not previously benefited the use of molecular markers
such as Bombyx mori L.

In this study, the genetic diversity of eight silkworm strains
were investigated using the RAPD method. The genomic
DNA extracted from individuals of every strains by method
of Wiliam J. G K, Kubelik K. J, Livak J. A. F, Rafalski and
S.V.Tingey. Five RAPD 10-mer primers were used to
amplify random sequence from the genomic DNAs of
research silkworm strains. These primers generated total 67
bands out of which 41 bands (61,2%) were polymorphic
and 26 bands (38,8%) were monomorphic with a mean of
13,4 bands per primer. The highest number of polymorphic
bands was observed for primer 0P016-11/12, the primer
101 has a lower polymorphic ratio-6 /15. Difference of

RAPD among strains showed that these polymorphisms
were strain-specific in Bombyx mori L. For example: the
bands 0P0 19- 1200 bp and 1000 bp were found to be
unique to strain TML, band 0P0 19 800 bp- strain TTB,
VC, band 0P0 13 550 bp- TTB. These bands A 7-1300 bp,
900 bp, 300 bp weren’t found from another 7 strains but
appear on strain TTB. RAPD data were used to generate
simple matching coefficients of similarity (SM). The SM
then used to constract a phylogenetic dendrogram by the
NTSY Spc version 2.0 software. The coefficients of genetic
similarity of silkworm strains changed from 0,547 to 0,984.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đinh Duy Kháng.