BÁO CÁO KHOA HỌC: "HÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP LIPASE TỪ NƯỚC THẢI VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE CỦA 102 CHỦNG PSEUDOMONAS" docx

HÂN LẬP CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP
LIPASE TỪ NƯỚC THẢI VÀ KHẢO SÁT HOẠT
TÍNH LIPASE CỦA 102 CHỦNG PSEUDOMONAS

Quyền Đình Thi, Nguyễn Thị Bẩy, Mai Thị Thanh,
Nguyễn Thị Thảo, Lê thị Thu Giang,Nguyễn Thị Tuyết
Nhung, Nguyễn Ngọc Dũng
Viện Công nghệ Sinh học

MỞ ĐẦU

Lipase là enzym xúc tác thủy phân triglycerid thành
diglycerid, monoglycerid hoặc glycerol và các axit béo nhờ
hoạt động của nó trên bề mặt phân pha dầu nước. Lipase vi
khuẩn có ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm,
hóa học, mỹ phẩm, thuộc da, trong y dược và xử lý môi
trường [1]. Hàng năm doanh thu lipase đạt hàng trăm triệu
dollar Mỹ trên thị trường enzym công nghiệp [2]. Để sản
xuất lipase công nghiệp, người ta áp dụng kỹ thuật tái tổ
hợp nhằm tạo chủng vi khuẩn có tốc độ sinh trưởng nhanh,
năng suất tổng hợp lipase cao, hoạt tính đặc hiệu cho từng
cơ chất và ổn định trong một thời gian dài dưới các điều
kiện kiềm, nhiệt độ cao [3, 4].

Việt Nam đang hiện đại hóa và công nghiệp hóa đất nước,
ngành công nghiệp thực phẩm, giặt tẩy, hóa chất cần rất
nhiều enzym đặc biệt là lipase, song các chế phẩm lipase
đang sử dụng chủ yếu là nhập khẩu. Do đó việc nghiên cứu
và triển khai sản xuất lipase trong nước đang được quan
tâm [5]. Hơn nữa việc nghiên cứu và sản xuất công nghiệp
lipase trong nước phải mang lại hiệu quả kinh tế, an toàn và

không gây ô nhiễm môi trường. Do nhu cầu về lipase ở
trong nước cao, chúng tôi đã phân lập, nuôi cấy và xác định
hoạt tính lipase một số chủng vi sinh vật từ môi trường.

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Nguyên liệu

Mẫu nước thải. Mẫu nước thải được thu thập từ cống rãnh
các nơi khác nhau như Xí nghiệp Da Mai động, Xí nghiệp
Thủy sản Thanh xuân, hồ Hoàn Kiếm, lò mổ Khương
thượng, và sông Tô lịch.

Hóa chất. Các hóa chất dùng để làm môi trường nuôi cấy
đều mua từ các hãng hóa chất nổi tiếng: Bacto-peptone,
Yeast extract (Difco); Gum arabic (Sigma); agar (Merck).
Các loại dầu dùng làm cơ chất thuộc dầu tinh luyện, chất
lượng cao.

Môi trường. Môi trường nuôi cấy bao gồm NaCl (1,0%),
peptone (1,0%), cao nấm men (0,5%), dầu thực vật (1,0%),
đối với môi trường rắn bổ sung 2% agar.

2. Phương pháp

Phân lập. 1 ml nước thải và cặn bã được khuấy trộn đều và
ly tâm 5.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được pha
loãng 1:102-104 lần với nước cất khử trùng và 100 l dịch
pha loãng được trang trên đĩa thạch bán kính 11 cm. Sau đó
ủ đĩa thạch trong tủ ủ nhiệt độ 28

o
C và sau 24-48 giờ mang
đĩa thạch để đánh giá các khuẩn lạc thu được. Trên đĩa
thạch xuất hiện khuẩn lạc nào có vòng sáng xung quanh thì
khuẩn lạc đó có khả năng sinh tổng hợp lipase. Các khuẩn
lạc sinh tổng hợp lipase được nuôi cấy trong 3 ml môi
trường, nhiệt độ 28
o
C trong 24 giờ. Sau đó pha loãng
1:108-1010, lấy 100 l dịch pha loãng trang trên đĩa thạch
để chọn ra các khuẩn lạc thuần khiết không pha tạp. Tiếp
tục làm cho tới khi trên đĩa thạch chỉ xuất hiện duy nhất
một loại khuẩn lạc. Cuối cùng khuẩn lạc này được nuôi cấy
trong 3 ml qua đêm ở nhiệt độ 28
o
C, và bảo quản với
glycerin 75% ở nhiệt độ -80
o
C.

Nuôi cấy. Các khuẩn lạc có vòng sáng lớn trên đĩa thạch
chứa 0,5% tributyrin được cấy vào 3 ml môi trường LB và
nuôi lắc 220 vòng/phút qua đêm ở nhiệt độ 30
o
C. Dịch nuôi
cấy cấp I được cho vào 50 ml môi trường LB theo tỷ lệ 100
l/100 ml môi trường và được tiếp tục nuôi lắc 220
vòng/phút, nhiệt độ 30
o
C. Sau 24, 48, 72, 96, 120 và 144

giờ các mẫu dịch nuôi cấy được lấy ra để đo OD
600
và hoạt
tính lipase.

Xác định hoạt tính lipase. Hoạt tính lipase được xác định
bằng phương pháp chuẩn độ tự động pH-Stat trên máy 718
Stat Titrino [5-6].

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Phân lập

Để phân lập các chủng vi khuẩn sinh tổng hợp lipase,
chúng tôi đã lấy mẫu đất và nước thải xung quanh các xí
nghiệp thuộc da Mai Động, xí nghiệp chế biến hải sản
Nhân Chính, lò mổ Khương Thượng, sông Tô Lịch và hồ
Hoàn Kiếm. Từ các mẫu nước thải đó đã phân lập được 41
chủng sinh tổng hợp lipase (hình 1) trong đó có 8 chủng
kháng streptomycine. Các chủng phân lập được nuôi cấy
trong 3 ml môi trường và bảo quản ở -80
o
C (bảng 1).

Hình 1. Định tính lipase trên đĩa thạch agar chứa 0,5%
tributyrin. A) Các chủng vi sinh vật M1 (1), M2 (2), M3
(3), M4 (4),B1 (5), B2 (6). B) Các chủng Pseudomonas:
ĐN1 (1), ĐN2 (2), ĐN3 (3), ĐN4 (4), ĐN6 (5), KT4 (6).

Bảng 1. Các chủng vi sinh vật sinh tổng hợp lipase được

phân lập từ nước thải. Nơi lấy mẫu: B: bơ; CR cống rãnh,
LM: lò mổ; MD: Mai động; M: mỡ; HK: Hoàn kiếm. HT:
Hoạt tính lipase được đánh giá theo vòng sáng thủy phân
dầu Marvella. Vàng C: vàng cam; vàng N: vàng nghệ.




2. Nuôi cấy 5 chủng có hoạt tính cao

Trong số đó, 5 chủng B1, LM27, M1, M42 và CRS3
(kháng lại streptomycine) đã được nuôi cấy trong 50 ml
môi trường trong 7 ngày để đo tốc độ phát triển và xác định
hoạt tính lipase. Các chủng đều phát triển tốt và đạt nồng
độ OD
600nm
tối ưu sau 72 giờ nuôi cấy, trừ chủng LM27 sau
đó được xác định là đã bị nhiễm sau 72 giờ nuôi cấy (hình
2).

Hoạt tính lipase được xác định bằng phương pháp chuẩn độ
thủ công với cơ chất là dầu ăn Marvella. Hoạt tính của các
chủng nuôi cấy M1, LM27 và CRS3 không cao, cao nhất
chỉ đạt 4,2 đơn vị/ml dịch nuôi cấy. M1 và LM27 có biểu
đồ hoạt tính tương tự nhau và đạt tối ưu sau 168 giờ nuôi
cấy, trong khi đó CRS3 có biểu đồ hoạt tính trái núi đạt tối
ưu sau 96 giờ nuôi cấy 2,4 đơn vị/ml dịch nuôi cấy (hình
2A).

Hình 2. Tốc độ sinh trưởng các chủng nuôi cấy M1, LM27,

B1, M42, và CRS3 từ 0-168 giờ (A) và hoạt tính lipase các
chủng M1, LM27, và CRS3 từ 0-168 giờ (B).



3. Khảo sát hoạt tính lipase của 102 chủng Pseudomonas

Trong những năm gần đây có nhiều công bố về nhân dòng,
tinh sạch và ứng dụng lipase của các chủng Pseudomonas.
Nguyễn Ngọc Dũng và CS đã phân lập nhiều chủng
Pseudomonas nhằm mục đích sản xuất phân bón vi sinh.
Chúng tôi đã khảo sát hoạt tính lipase của 102 chủng
Pseudomonas do TS. Nguyễn Ngọc Dũng cung cấp nhằm
tìm ra một số chủng có hoạt tính cao. Kết quả khảo sát hoạt
tính lipase trên đĩa thạch có chứa 0,5% tributyrin được thể
hiện trong bảng 2.


Bảng 2. 102 chủng Pseudomonas đã được khảo sát hoạt
tính lipase. HT: Hoạt tính lipase.



Sau 24 giờ nuôi cấy trên đĩa thạch, chủng nào không có
vòng sáng được coi là không sinh tổng hợp lipase (-),
chủng nào có vòng sáng nhỏ là có hoạt tính thấp (+), chủng
nào có vòng sáng trung bình được coi là có hoạt tính trung
bình (++), chủng nào có vòng sáng lớn được coi là có hoạt
tính cao (+++). Trong số 102 chủng Pseudomonas được
khảo sát có 14 chủng hoàn toàn không có hoạt tính lipase

chiếm 13,7%; 58 chủng có hoạt tính lipase thấp chiếm
56,9%; 15 chủng có hoạt tính lipase trung bình chiếm
14,7%; và 15 chủng có hoạt tính lipase cao chiếm 14,7%.

Trên hình 1B, ta thấy các chủng ĐN1 (1) và ĐN4 (4) có
vòng sáng lớn nhất (hoạt tính lipase cao nhất), sau đó đến
ĐN3 (3) và ĐN2 (2), cuối cùng là KT1 (6) và ĐN6 (5). Đĩa
thạch này được chụp ảnh sau 48 giờ nuôi cấy.

4. Nuôi cấy một số chủng Pseudomonas có hoạt tính cao
Bảng 3. Hoạt tính các chủng Pseudomonas có vòng sáng
lớn trên đĩa thạch agar chứa 0,5% dầu. Điều kiện phản ứng:
40
o
C, pH 8,0, cơ chất là dầu tổng hợp 5%.




Trong số những chủng Pseudomonas có vòng sáng lớn trên
đĩa thạch agar chứa 0,5% dầu, chúng tôi đã tiến hành nuôi
cấy 21 chủng (bảng 3) trong môi trường LB. Sau 24 giờ,
dịch nuôi cấy được ly tâm và loại bỏ tủa tế bào. Hoạt tính
lipase được đo bằng phương pháp pH-stat. Hoạt tính dao
động trong khoảng 2,02 đến 6,70. Chủng có hoạt tính cao
nhất là T301 (6,70 đơn vị/ml), chủng có hoạt tính thấp nhất
là ĐN4 (2,02 đơn vị/ml).
Bảng 4. Hoạt tính các chủng Pseudomonas có vòng sáng
lớn trên đĩa thạch agar chứa 0,5% dầu, nuôi cấy 48 giờ.
Điều kiện phản ứng: 60

o
C, pH 8,0, cơ chất là dầu tổng hợp
5%.



Hình 3. Tốc độ sinh trưởng các chủng Pseudomonas 92, 93,
82 Fe
3
O
4
, M4 và F1O4T nuôi cấy 144 giờ.


Trong 21 chủng Pseudomonas, 6 chủng 92, 93, 82 Fe
3
O
4
,
M4 và F1O4T được nuôi lắc trong 50 ml môi trường LB,
30
o
C, 144 giờ. Sau 24, 48, 72, 96, 120 và 144 giờ, mẫu
được lấy ra và đo OD
600
cũng như hoạt tính lipase. Tốc độ
sinh trưởng của các chủng 92, 93 là tốt nhất, đạt tối ưu tại
96 giờ. Trong khi đó các chủng 82 và M4 không phát triển
bình thường, OD
600

không thay đổi trong suốt 144 giờ nuôi
cấy (hình 3). Hoạt tính lipase của hai chủng 92 và 93 đối
với dầu Oliu lần lượt đạt 13,7 và 8,1 đơn vị/ml dịch nổi.
Trong khi đó chủng 82 đạt 10,0 đơn vị/ml đối với dầu tổng
hợp (bảng 4). Chúng tôi đã chọn ra một chủng trong 6
chủng trên để tách chiết ADN hệ gen phục vụ cho việc
nhân dòng gene lipase.

KẾT LUẬN

• Đã phân lập được 41 chủng vi khuẩn có hoạt tính
lipase. Hoạt tính cao nhất đạt 4,2 đơn vị/ml dịch nuôi cấy.

• Đã khảo sát hoạt tính lipase của 102 chủng
Pseudomonas. Có 14 chủng hoàn toàn không có hoạt tính
lipase chiếm 13,7%; 58 chủng có hoạt tính lipase thấp
chiếm 56,9%; 15 chủng có hoạt tính lipase trung bình
chiếm 14,7%; và 15 chủng có hoạt tính lipase cao chiếm
14,7%.

• Đã nuôi cấy 21 chủng Pseudomonas có hoạt tính lipase
cao trên đĩa thạch agar chứa 0,5% tributyrin trong 50 ml
môi trường LB.

• Tiếp tục nuôi cấy 6 chủng trong 50 ml môi trường LB
trong 6 ngày để theo dõi tốc độ sinh trưởng và hoạt tính
lipase.

Đề tài này được thực hiện dưới sự hỗ trợ của Quỹ Nghiên
cứu Khoa học Cơ bản, năm 2001-2002.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. K.E. Jaeger, et al. (1994) Bioeng. 2: 39-46.
2. R.A. Sheldon. In enzymatic reactions in organic media,
p. 266-307. Edited by A.M.P. Koskinen & A.M. Klibanov:
Chapman and Hall (1996).
3. E.J. Gilbert. (1993) Enyme Microb. Technol. 15: 634-
645.
4. K.E. Jaeger, et al. (1994) FEMS Microbiol. Rev. 15: 29-
63.
5. D.T. Quyen, et al. (1998) Genetics and Applications
(Hanoi) 4: 43-48.
6. D.T. Quyen. (1998) PhD. Thesis. Stuttgart University.

SUMMARY

Isolation of becteria strain biosynthetizing lipase from
waste water and charactersization of lipase activity of
102 pseudomonas strains

In our report we collected 41 microbial strains producing
lipase from slaughterhouse waste and lakes around Hanoi.
Among them 8 strains were streptomycine resistant. 10
strains showed high lipase activity (+++) on agar plates
containing 0.5% tributyrin, 21 strains had average lipase
activity (++) and 10 strains showed low lipase production
(+). We selected five best strains B1, CRS3, LM27, M1,
and M42 for 50-ml flask culture and characterized cell
growth from 0 to 168 hours and estimated lipase activity

profiles. A maximum of the cell growth of 4 strains was
obtained after 72 hours of culture, OD
600nm
were between
2,0 toward cooking oil Marvellaand 10,0. The lipase
activity 4.2 units/ml of the five strains were not so high (
supernatant). The strains M1 and LM27 had a similar
profile of lipase activity toward Marvella oil and a
maximum (4.2 units/ml) was obtained after 168 hours of
cultivation. The strain CRS3 grew at a maximum at 96
hours of cultivation (2.4 units/ml).
Also in this study we screened 102 Pseudomonas strains
isolated from soil samples for lipase production. Strains
were stroke on the agar plates containing culture medium
and 0.5% tributyrin. After incubation at 30
o
C overnight
colonies grew and showed a halo ring if the strain produces
lipase. Among them 14 strains did not produce lipase (-),
58 strains had low lipase activity (+), 14 strains showed
middle lipase activity (++) and 15 strains produced lipase
with a wide halo ring (+++). Among Pseudomonas strains
producing lipase we chose 21 strains and cultivated to
characterize the cell growth and lipase activity. Most
strains showed a growth curve with a maximum after 72-96
hours of cell culture. The cell growth of the strains 92 and
93 were similar. They grew steeply from 0-96 hours of
cultivation. A maximum of the lipase activity of these
strains was obtained at 96 hours of cultivation. Then cell
growth decreased gradually to 144 hours of cultivation. The

cell growth of the strain Fe
3
O
4
decreased gradually from 0
to 144 hours of cultivation, whereas the strains 82 and M4
seem not to grow in the time interval 0-144 hours. The
strain F1O4T grew to a maximum after 72 hours of
cultivation and decreased to 96 hours of cultivation and
remained constant to 144 hours of cultivation.
Pseudomonas sp. 92 produced lipase with the highest
activity of 13.72 units/ml supernatant toward 5% olive oil
whereas the lipase activities of the strains 93 and 82 toward
5% olive oil were 8.13 and 4.26. The lipase activity of
Pseudomonas sp. 82 toward mix oil was the highest (10.0
units/ml) whereas others strains produced lipase with
activity of 5.08-6.06 units/ml supernatant.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Trương Nam Hải.