BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN LAI GNRH-TBK Ở E. COLI" doc

NGHIÊN CỨU THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN PROTEIN
LAI GNRH-TBK Ở E. COLI

Đặng Thành Nam & Phan Văn Chi*
Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN & CNQG
*Tác giả để liên hệ: Tel. 7561903; Fax. 8363144; E-mail:

1. MỞ ĐẦU

Trichobakin (TBK) là một protein bất hoạt ribosom lớp 1,
được tách chiết từ cây Trichosanthes sp. Bac Kan 8-98
thuộc họ Cucurbitaceae [1,2]. Trichobakin tái tổ hợp sau
khi được biểu hiện ở E.coli, đã được tinh sạch và chứng
minh là có hoạt tính N- glycosidase cao đối với ARN
ribosom và có khả năng ức chế quá trình sinh tổng hợp
lucierase trên mô hình RRL (Rabbit Reticulocyte Lysate).
Ngoài khả năng kháng vi khuẩn, virut, chúng còn có khả
năng gây ức chế các dòng tế bào ung thư nuôi cấy in vitro
[3]. Để có thể có những ứng dụng hiệu quả hơn,
Trichobakin có thể được gắn thêm thành phần hướng đích
để tạo các protein lai theo dạng các “độc tố miễn dịch”
(ITs) nhằm tiêu diệt một cách chọn lọc các quần thể tế bào
mà ở đó có biểu hiện các thụ thể đặc hiệu của thành phần
hướng đích bằng công nghệ ADN tái tổ hợp [ 4, 5].

Hormon giải phóng kích dục tố (GnRH) hay hormon giải
phóng thể vàng (luteinizing hormone-releasing hormone:
LH-RH) là một neuro-decapeptide, không gây đáp ứng
miễn dịch và có ái lực rất cao (K
d
khoảng 10

-9
M) với thụ
thể của GnRH(GnRHR) [6, 11]. GnRHR được biểu hiện
nhiều trên bề mặt tế bào ung thư vú, tử cung, tuyến tiền liệt,
tuyến tuỵ[7-10]. Mặt khác ở các tế bào ung thư mang
GnRH receptor thường có biểu hiện loại “death receptor”
Fas[12]. Sự liên kết giữa GnRH (hoặc dẫn xuất ) với GnRH
receptor sẽ kích hoạt sự biểu hiện của Fas ligand, gây ra
quá trình appotosis cho tế bào[13]. Do vậy GnRH được
xem như là một tác nhân hướng đích lý tưởng, GnRH đã
được sử dụng trong một số độc tố miễn dịch tái tổ hợp khác
nhau như recombinant GnRH-PAP fusion toxin. Trong đó
PAP cũng là một protein bất hoạt ribosome được tách chiết
từ cây Phytolacca americana. GnRH-PAP đã có khả năng
ức chế đặc hiệu các tế bào ung thư có biểu hiện các GnRH
receptor bề mặt[6].

Trong báo cáo này, chúng tôi trình bày kết quả nghiên cứu
tạo protein lai GnRH-TBK được thiết kế dựa trên sự liên
kết đoạn gen mã hoá cho GnRH ở người và trình tự gen mã
hoá cho TBK bằng công nghệ ADN tái tổ hợp.

2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu và hoá chất

Các hóa chất thông dụng dùng trong sinh học phân tử được
mua từ các hãng Sigma, Bio-Rad, Pharmacia-Biotech Các
enzym giới hạn BamHI, NcoI, enzym ghép nối T4 ADN
ligase, Taq ADN polymerase được mua từ hãng New

England Biolabs (Anh). Vector biểu hiện pET 21d(+),
chủng vi khuẩn E.coli BL 21 (DE3) được mua của hãng
Novagen (Mỹ).

2.2 Phương pháp

2.2.1 Nhân gen gnrh- tbk bằng kỹ thuật PCR

Việc thiết kế gen lai gnrh- tbk được tiến hành trên cơ sở
gen tbk đã được tách dòng pQV 20 [1]. Gen mã hoá cho
GnRH của người được nối với gen mã hoá cho Trichobakin
thông qua một polynucleotid trung gian mã hoá cho 13 axit
amin (linker), có vai trò tạo nên sự mềm dẻo trong cấu trúc
và tính tan của protein lai HSP1. Tổ hợp gen này có kích
thước 813 bp mã hoá cho protein có kích thước khoảng 30
kDa. Sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu để tạo ra
và nhân lên tổ hợp gen mã hóa cho protein lai GnRH-TBK.
Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94
o
C, 48 giây; 56
o
C, 48
giây; 72
o
C, 84 giây; lặp lại 32 chu kỳ; 72
o
C, 8 phút.

2.2.2 Thiết kế vector biểu hiện protein tái tổ hợp

Vector pET-21d(+) (Novagen) và sản phẩm PCR cùng
được xử lý bằng hai enzym giới hạn NcoI, BamHI và được
nối với nhau nhờ T4 ADN ligase tạo thành plasmid tái tổ
hợp pGnRH-TBK. Việc xác định trình tự ADN được tiến
hành trên máy ALF express DNA Sequencer và Thermo
Sequenase Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia
Biotech).

2.2.3 Biểu hiện protein tái tổ hợp trong tế bào vi khuẩn
E.coli

Plasmid tái tổ hợp mang gen gnrh-tbk được biến nạp vào
chủng tế bào khả biến E.coli BL21(DE3) và nuôi trong môi
trường LB lỏng có bổ sung ampicillin ( nồng độ cuối cùng
là 100g/ml), lắc 200 vòng/ phút ở 37

C,. Khi giá trị
OD
600nm
của dịch nuôi cấy đạt tới 0.5-0.7, tiến hành cảm
ứng bằng IPTG (isopropyl

- D- thiogalactoside) với nồng
độ cuối cùng là 0.4 mM. Các mẫu tế bào được thu vào các
thời điểm 0 h, 1h, 2h, 3h sau khi cảm ứng và 3h không cảm
ứng. Sự biểu hiện protein lai tái tổ hợp được phân tích bằng
SDS-PAGE theo Laemmli [14] và Western blot theo
Towbin [15].

3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Thiết kế vector biểu hiện protein lai GnRH-TBK

3.1.1 Nhân gen mã hoá cho GnRH- TBK

Dựa trên trình tự các gen mã hoá cho các protein GnRH và
TBK cặp mồi phục vụ cho việc tạo ra và nhân gen tái tổ
hợp gnrh-tbk bằng kỹ thuật PCR đã được tổng hợp. Mồi
xuôi mang vị trí nhận biết của enzym giới hạn NcoI, toàn
bộ trình tự gen gnrh, trình tự đoạn linker và trình tự
nucleotid mã hóa cho 8 acid amin đầu tiên của TBK. Mồi
ngược mang vị trí nhận biết của enzym giới hạn BamHI và
trình tự nucleotidd mã hoá cho 7 acid amin cuối cùng của
gen tbk.

Sản phẩm PCR được phân tích bằng điện di trên gel
agarose 0.8 %(hình 1) cho thấy một băng duy nhất có kích
thước khoảng 813 bp. Kích thước này phù hợp với tính
toán lý thuyết về kích thước sản phẩm nối tạo thành giữa
gen gnrh, linker và gen tbk.

3.1.2 Vector biểu hiện protein lai GnRH-TBK

Sản phẩm PCR gnrh-tbk và vector biểu hiện pET 21d(+)
cùng được xử lý bằng hai enzym giới hạn NcoI và BamHI,
và sau đó được nối lại với nhau bằng enzym T4 ADN
ligase nhằm tạo ra plasmid mới mang tổ hợp gen gnrh-tbk
và hệ biểu hiện phù hợp, phục vụ cho việc biểu hiện protein
tái tổ hợp được nghiên cứu. Kết quả phân tích bằng điện di
trên gel agarose 0.8% (hình 1).

Kết quả điện di trên hình 1 cho thấy, plasmid tái tổ hợp
pGnRH-TBK sau khi được xử lý bằng hai enzym giới hạn
NcoI và BamHI (đường chạy 3) tạo thành hai băng sản
phẩm có kích thước 5400 bp và 813 bp. Trong đó, sản
phẩm 5400 bp tương ứng với kích thước của vector pET
21d(+) sau khi đã được xử lý bằng hai enzym giới hạn NcoI
và BamHI và sản phẩm 813 bp tương ứng với tổ hợp gen
gnrh-tbk (đường chạy 4). Các kết quả này cho thấy tổ hợp
gen gnrh-tbk đã được gắn vào vector biểu hiện pET 21d(+).
Kết quả xác định trình tự pGnRH-TBK cũng đã khẳng định
sự có mặt của tổ hợp gen gnrh-tbk trong vector biểu hiện
pET 21d(+) đúng ở vị trí mong muốn và không thấy có một
thay đổi, đột biến nào trong trình tự của tổ hợp gen cũng
như trong các trình tự chức năng của vector biểu hiện.
Plasmid tái tổ hợp pGnRH-TBK tiếp tục được biến nạp vào
E.coli chủng Bl21(DE3) để biểu hiện protein.



3.2. Biểu hiện GnRH-TBK ở vi khuẩn E.coli

Chủng vi khuẩn E.coli BL21(DE3) mang plasmid pGnRH-
TBK được nuôi cấy và gây cảm ứng bằng IPTG. Các mẫu
tế bào được thu tại các thời điểm và 0, 1, 2, 3 giờ sau khi
cảm ứng. Dịch chiết protein tổng số của các mẫu tế bào
được phân tích bằng SDS-PAGE (hình 2). Kết quả điện di
SDS-PAGE cho thấy, trong dịch chiết protein tổng số của
các mẫu tế bào thu tại các thời điểm khác nhau sau khi
được cảm ứng bằng IPTG (các đường chạy từ 1-4), có xuất

hiện một băng protein mới có trọng lượng phân tử khoảng
30 kDa so với mẫu tế bào không được cảm ứng bởi IPTG
(đường chạy 5). Như vậy, hệ biểu hiện của vector pET
21d(+) mang tổ hợp gen gnrh-tbk đã hoạt động ổn định,
dẫn đến sự biểu hiện một loại protein mới. Protein này có
trọng lượng phân tử phù hợp với tính toán lý thuyết về
trọng lượng phân tử của protein tái tổ hợp GnRH-TBK. Để
có thể khẳng định một cách chắc chắn hơn chúng tôi tiến
hành phản ứng Western blot với kháng thể một là huyết
thanh kháng TBK kết quả thu được thể hiện ở hình 3.

Hình 2. Điện di SDS-PAGE các sản phẩm protein tái tổ
hợp GnRH-TBK biểu hiện ở E.coli.

M: thang protein chuẩn; 1-4: protein tổng số của vi khuẩn
sau 0, 1, 2, 3h sau cảm ứng bằng IPTG; 5: protein tổng số
của vi khuẩn sau 3 h không cảm ứng IPTG

Hình 3. Phân tích GnRH-TBK bằng Western blotting.

M: Thang protein chuẩn; 1-3: Biểu hiện protein lai tái tổ
hợp GnRH- TBK (mũi tên)ở các thời điểm 1 , 2, 3 giờ sau
cảm ứng bằng IPTG.


4. KẾT LUẬN

Đã tạo được được tổ hợp gen gnrh-tbk có kích thước 813
bp dựa trên cơ sở gen mã hoá cho GnRH có nguồn gốc từ
người và gen mã hoá cho Trichobakin bằng kỹ thuật PCR.

Tổ hợp gen này đã được đưa vào vector biểu hiện pET
21d(+) và được biểu hiện trong chủng E.coli BL21(DE3).
Kết quả điện di SDS-PAGE và Western blot cho thấy,
protein tái tổ hợp được biểu hiện ổn định và có trọng lượng
phân tử 30 kDa phù hợp với tính toán lý thuyết của protein
lai GnRH-TBK.

Các nghiên cứu về tính chất của GnRH-TBK đang tiếp tục
được nghiên cứu làm rõ và sẽ được trình bày trong những
công bố tiếp theo.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Phan Van Chi, Hoang Quoc Truong, Nguyen Thuy
Ha, Won-II Chung and Le Tran Binh (2001) //Biotechnol.
Appl. Biochem. 34, 85-92.
2. Phan Văn Chi, Hoàng Quốc Trường, Ngyễn Thuý Hà,
Phạm Công Hoạt, Lê Trần Bình, (2000)// Những vấn đề
nghiên cứu cơ bản trong sinh học, NXB Đại học Quốc gia
Hà Nội, tr. 23-28.
3. Nguyễn Thuý Hà, Nguyễn Bích Nhi, Đỗ Khắc Hiếu &
Phan Văn Chi (2002)// Tap chí Y học (đang in)
4. Phan Văn Chi (2001) // Hội thảo Sinh học Quốc tế
2001, Hà nội, tr. 66-68.
5. Lê Thị Bích Thảo, Hà Văn Huân & Phan Văn Chi
(2003)// Tap chí Y học (đang in)
6. Schlick J.L., Dulieu P., Desvoyes B., Adami P.,
Radom J, Jouvenot M. (2000) // FEBS Letters 472, 241-
246.
7. Emos, G., Schroder, B., Ortmann, O., Westphalen, S.,

Schultz, K.D. and Schally, A.V. (1993) // J. Clin.
Endocrinol. Metab. 77, 1458-1464.
8. Eidne, K.A., Flanagan, C.A., Harris, N.S. and Millar,
R.P. (1987)// J. Clin. Endocrinol. Metab. 64, 425-432.
9. Quayum, A., Gullick, W., Clayton, R.C., Sikora, K.
and Waxman, J. (1990)// Br. J. Cancer 62, 96-99.
10. Imai, A., Ohono, T., Lida, K., Furui, T. and Tamaya,
T. (1994) // Cancer 74, 2555-2561.
11. Srkalovic, G., Bokser, L., Radulovic, S., Korkut, E.
and Chally, A.V (1990)// Endocrinology 127, 3052-3060.
12. Imai, A., Horibe, S., Takagi, A., Tadaki, H., Ohno,
T., and Tamaya, T., (1997) // Eur. J. Obstet, Gynecol.
Report. Biol.74, 73-78.
13. Imai, A., Takagi, A., Horibe, S., Tagaki, H., and
Tamaya, T. (1997) // Int. J. Oncol. 13, 97-100.
14. Laemmli, U.K. (1970)// Nature (London) 227, 680-
685.
15. Towbin, H., Staehelin, T. and Gordon, J. (1979) //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 4350-4354.


SUMMARY

Construction and expression of the fusion protein
GnRH-TBK in E. coli

Đang Thanh Nam & Phan Van Chi
Institute of Biotechnology (IBT),
National Center for Natural Science & Technology (NCST)

Immunotoxins and recombinant toxins are cytotoxic agents
and designed to selectively kill populations of cells that
display specific cell surface antigens. These toxins usually
composed of a targeting moiety linked to a protein toxin by
chemical coupling or recombinant DNA technology. The
targeting domain controls the specificity and is usually
derived from Fv fragment of an antibody, a growth factor,
or a soluble receptor. The protein toxins are obtained from
bacteria (e.g., Pseudomonas endotoxin [PE] or diptheria
toxin [DT]) or from plants (e.g., Ribosome-Inactivating
Proteins [RIPs]). Trichobakin (TBK), a type I ribosome-
inactivating protein isolated from the plant Trichosanthes
sp. Bac Kan 8-98 (family Cucurbitaceae) with specific
rRNA N-glycosidase activity, was proved to have potent
antiviral and anticancer activity once inside the cytoplasm.
Therefore, TBK is a good candidate to be used the
construction of different fusion proteins as recombinant
“immunotoxins”. In this paper, the result of the
construction of a bacterial expression plasmid encoding
TBK as a fusion protein with gonadotropin-releasing
hormone (GnRH), a neuro-decapeptide with receptor sites
on several gynaecologic tumors is presented. The fusion
cDNA were amplified by PCR using specific primers
designed from the DNA sequences of gnrh, linker and tbk
genes. As a result, the DNA sequence with the size of 813
bp encoding the fusion protein with 271 amino acids was
obtained. The target gene was cloned in pET-21d(+)
plasmid where the cloning/expression region of the coding
strand transcribed by T7 RNA polymerase. The resulting

recombinant plasmid, designated as pGnRH-TBK was used
for the expression of the protein in E.coli strain BL 21
(DE3). The extression was induced by the addition of
IPTG. The identity of recombinant protein has been
confirmed on SDS-PAGE by its size with the molecular
mass of about 30 kDa and Western blot using rabbit
antiserum against Trichobakin. The purification and
biochemical characterization of the recombinant protein is
now under study and will be reported in the next papers.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đinh Duy Kháng.