BÁO CÁO KHOA HỌC: "CHỌN LỌC DÒNG ACETOBACTER XYLINUM THÍCH HỢP CHO CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG DÙNG TRONG SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN VỚI QUY MÔ LỚN" pot

CHỌN LỌC DÒNG ACETOBACTER XYLINUM
THÍCH HỢP CHO CÁC LOẠI MÔI TRƯỜNG DÙNG
TRONG SẢN XUẤT CELLULOSE VI KHUẨN VỚI
QUY MÔ LỚN

Nguyễn Thúy Hương
Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Bách Khoa
tp.HCM
Phạm Thành Hổ
Bộ môn Công nghệ sinh học, trường Đại học Khoa học Tự
nhiên tp.HCM

MỞ ĐẦU.

Thạch dừa (Nata-deCoco) được sản xuất từ nguồn nước
dừa già là loại thực phẩm phổ biến trên thị trường Việt
Nam hiện nay. Thạch dừa thực chất là sinh khối của tế bào
vi khuẩn Acetobacter xylinum , mà thành phần chủ yếu là
cellulose . Loại cellulose vi khuẩn (Bacterial cellulose –
BC) này, ngoài giá trị thực phẩm như thạch dừa , các nhà
khoa học trên thế giới đã tìm ra hàng loạt những ứng dụng
mới, độc đáo trong nhiều lãnh vực khác nhau : thực phẩm,
y học, mỹ phẩm, khoa học vật liệu, xử lý nước thải, bảo vệ
môi trường , v v [ 1 ,6] . Sự phát triển các ứng dụng này
đòi hỏi sản xuất BC phải đạt quy mô công nghiệp với nhiều
yêu cầu :

- Đa dạng hoá nguồn nguyên liệu ban đầu ( không chỉ là
nước dừa già , mà số lượng rất hạn chế ).

- Các chủng giống mới phù hợp hơn với yêu cầu kỹ thuật

như tế bào dài để BC có độ bền chắc hơn, đặc biệt là phát
triển nhanh trong các loại môi trường khác nhau.

- Sàng lọc các chủng giống thích hợp với điều kiện lên men
chìm.

Nghiên cứu này nhằm sàng lọc một số dòng A.xylinum phát
triển tốt trên 2 loại môi trường mật rỉ đường và nước mía.
Các kết quả đạt được trên 2 loại môi trường này hứa hẹn sử
dụng tốt trong sản xuất BC với quy mô công nghiệp.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP.
Bảng 1. Thành phần môi trường nghiên cứu dùng để sàng
lọc giống.



- Các dòng vi khuẩn Acetobacter được phân lập từ các
nguồn : 11 nguồn sản xuất Nata-deCoco ở Thái Lan; 4
nguồn sản xuất Nata-deCoco ở Philippines ; 2 chủng giống
có nguồn gốc từ Viện Công nghệ châu á (AIT); 3 chủng
giống có nguồn gốc từ viện Công nghệ Thực phẩm và môi
trường (IEF) Philippines; ngoài ra còn từ các nguồn nguyên
liệu giấm, bia, nước quả và Nata-deCoco ở trong nước.

- Phân lập nuôi cấy vi sinh vật trên môi trường thạch đĩa.

- Môi trường dinh dưỡng : gồm các môi trường phân lập,
sàng lọc và môi trường sản xuất BC được trình bày qua
bảng 1.

. Môi trường đối chứng : Môi trường truyền thống nước
dừa già [Saccharose:10-20 g; (NH
4
)
2
S0
4
:8 g ;(NH
4
)
2
HPO
4
:
2g ; Acid acetic: 5 ml; Nước dừa già: 1000 ml.] -(MT5)

- Sàng lọc giống thông qua các chỉ tiêu:

+ Kích thước và hình dạng tế bào (m).
+ Mật độ tế bào ( 106 tế bào / ml).
+ Trọng lượng BC (g / l).
+ Độ chịu lực của màng BC (N / m
2
).
- Kết quả thí nghiệm là trung bình của 3 lần lập lại.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.

1. Phân lập và tuyển chọn.

Từ các nguồn phân lập thu thập trong và ngoài nước, chúng
tôi tiến hành phân lập trên môi trường 1 (MT1) và môi
trường 3 (MT3) và thu được tổng cộng 59 dòng vi khuẩn có
các đặc điểm sau :

- Quan sát đại thể : các dòng đều có hình dạng tròn, nhầy,
trơn bóng trắng trong hoặc trắng sữa, rìa mép khuẩn lạc
nhẵn, sau 4 ngày nuôi cấy đường kính đạt 2-5 mm.

- Quan sát vi thể : vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, tế
bào đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi.

- Đặc điểm sinh hóa : được kiểm tra thông qua 7 đặc điểm
sinh hóa phân loại Acetobacter.

Trong 59 dòng vi khuẩn phân lập trên đây, sau khi thử khả
năng oxy hóa, chúng tôi khẳng định đây là những giống
Acetobacter, trong đó có 30 dòng được xác định là
Acetobacter nhưng không tổng hợp cellulose nên không đề
cập đến, còn lại 29 dòng có kết quả sinh hóa như sau :
Bảng 2. Đặc điểm sinh hóa của 29 dòng vi khuẩn phân lập.



Kết hợp quan sát đại thể , vi thể và sinh hóa cho kết luận :

Từ các nguồn phân lập, chúng tôi thu được 29 dòng vi
khuẩn Acetobacter có khả năng sản sinh cellulose. Kết quả
phân loại 29 dòng này đều thuộc loài Acetobacter xylinum.

Bảng 3. Ký hiệu các dòng A.xylinum được phân lập và sơ
tuyển.



2. Mật độ tế bào của 29 dòng A.xylinum.

Sau 6 ngày nuôi cấy trên 2 môi trường nhân giống, mật độ
tế bào của các dòng A.xylinum khảo sát thu được thể hiện ở
bảng 4.
Bảng 4. Mật độ tế bào ( 10
6
tế bào / ml)



Mật độ tế bào vi khuẩn tỷ lệ với lượng cellulose sinh ra
theo thời gian nuôi cấy [ 3,4 ]. Vì vậy, tiêu chuẩn để tuyển
chọn dòng vi khuẩn thích hợp trên các môi trường khác
nhau thông qua 2 chỉ tiêu chính là mật độ tế bào và lượng
BC sinh ra.

Giữa 2 môi trường rỉ đường và môi trường nước mía, có
những dòng phát triển nhanh và phù hợp hơn ở từng loại
môi trường. Những dòng được sơ tuyển trên đây đều có
mật độ tế bào dao động trong khoảng từ 32,11. 106 đến
48,15.10
6
tế bào / ml.

Kết quả bảng 4 chỉ ra rằng, trên môi trường rỉ đường (MT1)
có 6 dòng phát triển nhanh : T.8, P.16, P.17, P.18, V.25 và
V.28. Trên môi trường nước mía (MT3) có 7 dòng phát
triển nhanh , ngoài 6 dòng kể trên còn có dòng T.7.

3. Khảo sát trọng lượng BC khô của các dòng A.xylinum
sàng lọc từ môi trường rỉ đường.

Sản phẩm BC của A.xylinum bằng các kiểu lên men bề mặt
hay lên men chìm là khác nhau [ 2 ] và có các ứng dụng
hoàn toàn khác nhau [ 6 ]. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo
sát trọng lượng BC thu được từ các dòng A.xylinum theo 3
kiểu lên men : lên men bề mặt, lắc và sục khí. Kết quả thu
được sau 6 ngày nuôi cấy như sau :
Bảng 5. Trọng lượng BC khô thu được từ các kiểu lên men
khác nhau trên môi trường rỉ đường ( g / l).



Qua thử nghiệm sản xuất BC từ nguồn nguyên liệu rỉ
đường, kết quả cho thấy cả 6 dòng vi khuẩn khảo sát đều
phù hợp lên men bề mặt. Trọng lượng BC khô thu được
thay đổi từ 6,55 đến 7,11 g/l. Khảo sát bằng nuôi cấy chìm
cho thấy : với kiểu nuôi cấy lắc có 2 dòng P.16 và P.17 cho
lượng BC khô là 3,86 g/l và 4,58 g/l. Với kiểu nuôi cấy sục
khí cũng chỉ có 2 dòng này với lượng BC tương ứng là 3,50
g/l và 5,42 g/l . Như vậy, xét chung lại dòng P.16 là dòng
phát triển nhanh cho lượng BC cao trong cả 2 kiểu lên men
bề mặt và lên men chìm.
4. Khảo sát trọng lượng BC khô của các dòng A.xylinum

sàng lọc trên môi trường nước mía.
Tương tự như ở mục 3, chúng tôi cũng tiến hành khảo sát
trên môi trường nước mía. Kết quả thu được sau 6 ngày
nuôi cấy thể hiện qua bảng 6.
Bảng 6. Trọng lượng BC khô thu được từ các kiểu lên men
khác nhau trên môi trường nước mía ( g / l).



Khảo sát trọng lượng BC khô trên môi trường nước mía ,
cả 7 dòng đều phát triển tốt cho lượng BC cao khi lên men
bề mặt (từ 7,00 đến 7,82 g/l). Khảo sát 2 kiểu lên men chìm
là lắc và sục khí, chỉ sàng lọc được một dòng duy nhất là
P.17 cho lượng BC là 4,05 g/l và 4,64 g/l.

5. Khảo sát trọng lượng BC khô của các dòng
Acetobacter xylinum trên môi trường đối chứng – môi
trường truyền thống nước dừa già.

Kết quả mục 2 khảo sát mật độ tế bào của 29 dòng
A.xylinum sàng lọc được 7 dòng phát triển nhanh . Đưa 7
dòng phát triển nhanh này vào môi trường đối chứng – môi
trường nước dừa già kết quả thu được như sau:

Trên môi trường truyền thống cả 7 dòng vi khuẩn đều phát
triển nhanh , cho lượng BC từ 7,05 đến 7,28 g/l (lên men bề
mặt). Với kiểu lên men chìm sàng lọc được 2 dòng là P.16
và V.28 cho lượng BC là 4,51 g/l và 4,60 g/l.
Bảng 6. Trọng lượng BC khô thu được từ các kiểu lên men
khác nhau trên môi trường nước dừa ( g/l)

6. Mối liên hệ giữa hình dáng kích thước tế bào vi khuẩn
và độ chịu lực màng BC.

Vi khuẩn A.xylinum có sự thay đổi hình dạng và kích
thước tuỳ theo giống. Màng BC thực chất là sinh khối của
tế bào vi khuẩn A.xylinum, mà thành phần chủ yếu là
cellulose. Vì vậy, chúng tôi tiến hành khảo sát mối liên hệ
giữa các dòng và độ chịu lực của màng BC , một trong
những chỉ tiêu chất lượng quan trọng của màng BC khi đưa
ra ứng dụng. Khảo sát trên 3 dòng thu được từ kết quả bảng
5 và 6 trên đây (dòng P.16, P.17 và V.25) và một dòng
A.xylinum có hình dạng tròn dài trong bộ lưu trữ giống có
ký hiệu P.S.14 (đối chứng).

Bảng 8. Mối liên hệ giữa hình dáng kích thước tế bào vi
khuẩn và độ chịu lực màng BC.



Màng BC sử dụng trong các ứng dụng làm màng trị phỏng,
màng lọc, giấy , vải đòi hỏi chịu lực cao. Dòng P.16 và
P.17 đều là những dòng có tế bào dài, cho độ chịu lực của
màng BC tương ứng là 86.106 và 91.106 N/m
2
. Riêng đối
với dòng V.25 có tế bào dạng tròn dài và dòng A.xylinum
đối chứng dạng tròn dài trong bộ sưu tập đều có độ chịu lực

thấp hơn cách biệt (68.10
5
và 56.105 N/m
2
) . Những giống
có tế bào dài cho khả năng giữ nước tốt hơn, có độ dai chắc
hơn.

KẾT LUẬN.

- Bacterial cellulose có thể sản xuất từ nguồn nguyên liệu rỉ
đường và nước mía, nguồn nguyên liệu khá dồi dào và rẻ
tiền, có thể tiến hành sản xuất BC ở quy m ô công nghiệp :

+ Với nguyên liệu là rỉ đường, chúng tôi sàng lọc được
dòng P.16 thích hợp cho cả 2 kiểu lên men bề mặt và lên
men chìm : trọng lượng BC khô đạt 7,11 g/l (lên men bề
mặt) và 5,42 g/l (lên men chìm).

+ Với nguyên liệu là nước mía, chọn lọc dòng P.17 thích
hợp cho cả 2 kiểu lên men BC bề mặt và lên men chìm :
trọng lượng BC khô đạt 7,15 g/l (lên men bề mặt) và 4,64
g/l (lên men chìm).

+ So với đối chứng là nguyên liệu truyền thống nước dừa
già đạt cao nhất là 7,28 g/l (lên men bề mặt) và 4,60 g/l (lên
men chìm ), thì sự khác biệt không đáng kể trong cùng thời
gian lên men ( 6 ngày).

- Chọn lọc các dòng Acetobacter xylinum tế bào dài có

kích thước là ( 0,3-0,5) x 3 mð m : dòng P.16 và P.17.

- Màng BC theo kiểu lên men bề mặt có độ chịu lực cao
(86.106 - 91.106 N/m
2
), phù hợp với yêu cầu ứng dụng về
màng.

TÀI LIỆU THAM KHẢO.

1. Nguyễn Thúy Hương.1998. Chọn dòng Acetobacter
xylinum phát triển nhanh và một số biện pháp cải thiện sản
xuất cellulose vi khuẩn.
Luận văn Thạc sĩ, Đại học Khoa học Tự nhi ên tp.HCM.
2. Hùynh Thị Ngọc Lan, Nguyễn Văn Thanh. 2001.
Nghiên cứu tạo màng sinh học trị phỏng từ Acetobacter
xylinum.Y Học Thực Hành,Số 4.
3. Kouda T., Yano H., Yoshinaga. 1997. Effects of
agitator configuration on bacterial cellulose productivity in
aereated and agitated culture . J. Ferment. Bioeng. 83, 371-
376.
4. Millman B., Covin J. R. 1996. The formation of
cellulose microfibrils by A.xylinum in agar surface.
Canadian Journal of microb. 7, 383-387.
5. Toyosaki H., Naritomi T., Seto A. 1995. Screening of
bacterial cellulose - producing Acetobacter strains suitable
for agitated culture . Biosci. Biotech. Biochem. 59, 1498-
1502.
6. Yoshinaga F., Tonouchi N. 1997. Research progress in
production of bacterial cellulose by aeration and agitation

culture and its application as new inductrial materials.
Biosci. Biotech. Biochem. 61, 219-224.
7. Yamanaka S. 1989. Production an application of
bacterial cellulose. In . H. Inagaki and G. O. Phillips (eds)
Cellulosic utilization: Research and rewards in cellulose .
Elsevier /North-Holland Pub. Co. Amsterdam. 171-185.


SUMMARY.

Screening Acetobacter xylinum strains for good
growing in different media for large-scale production of
bacterial cellulose

Nguyen Thuy Huong
Dept. of Biotechnology, HochiMinh City University of
Technologies.
Pham Thanh Ho
Dept. of Biotechnology, HochiMinh City University of
Natural Sciences.

The utilization of bacterial cellulose (BC) produced by
Acetobacter xylinum for food, medical and industrial
applications is enormous. But in Vietnam, Acetobacter
xylinum is using mainly for the Nata de Coco production as
food from the traditional carbohydrate substrate – old
coconut water. For the large scale production of BC and
other applications, this study is focused on the :

– Replacing the traditional substrate – old coconut water

by other carbohydrate sources as molasses and sugarcane
juice in the cultural media.

– Selecting the strains more adapting to the new
substrates in the cultural media.

– Searching some strains with particular characteristic as
long size cell for technical application : using BC as
membrane.

Fifty nine (59) Acetobacter strains were received from
culture collection of Philippines and Thailand and isolated
from different Nata de Coco cottage industries in Vietnam.
After screening for the cellulose production, twenty nine
(29) Acetobacter xylinum strains were selected.

Some strains of A. xylinum show good growing in molasses
and sugarcane-juice media were selected. The experiments
indicate that bacterial cellulose (BC) can be produced from
Acetobacter xylinum in molasses and sugarcane-juice
media.

In the molasses medias, the selected strain P.16 growed
well for static and shaken cultures. For the static flask
culture, the dry cellulose production was 7.11 g/l . For the
shaken flask culture, the dry cellulose production was 5.42
g/l.

In the cane-juice medias, the selected strain P.17 growed
well for static and shaken cultures. For the static flask

culture, the dry cellulose production was 7.15 g/l . For the
shaken flask culture, the dry cellulose production was 4.64
g/l.

It is essential to notice that in traditional coconut water
medium, the dry cellulose production was equal about 7.28
g/l. So, the dry cellulose production received in the
molasses and sugarcane-juice media is close to this one in
coconut water medium.

The strains P.16 and P.17 have the size (0.3-0.5) x 3 m.
The bacterial cellulose produced from these strains has
suitable mechanical properties (the maximum strength
ranged from 86.106 N/m
2
to 91.106 N/m
2
) for the technical
application.

Người thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương.