BÁO CÁO KHOA HỌC: "SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐA HÌNH ADN (PCRRFLP) TRÊN VÙNG INTRON 18 ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ THỂ MANG GEN BỆNH MÁU KHÓ ĐÔNG HEMOPHILIA" potx

SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP ĐA HÌNH ADN (PCR-
RFLP) TRÊN VÙNG INTRON 18 ĐỂ XÁC ĐỊNH CÁ
THỂ MANG GEN BỆNH MÁU KHÓ ĐÔNG
HEMOPHILIA A

Lê Nhật Minh
1
, Lê Thị Kim Tuyến
1
, Võ Thị Thương
Lan
2
, Đỗ Trung Phấn
3

1
Phòng sinh học phân tử, Viện Vệ sinh dịch tễ TW.
2
Đại học Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội.
3
Viện Huyết học và truyền máu TW

Tóm tắt: 9 bà mẹ của 9 bệnh nhân nam mắc bệnh
Hemophilia A (trong đó có trường hợp một mẹ và hai con
trai mang bệnh) được phân tích tính đa hình ADN của vùng
Intron 18 trên gen mã cho yếu tố VIII bằng enzym giới hạn
Bcl I. Kết quả phân tích cho thấy 4/9 bà mẹ (44.44%) mang
cặp alen dị hợp tử XhX về bệnh máu khó đông và truyền
bệnh cho con trai mình tạo thành dạng XhY gây bệnh.

MỞ ĐẦU

Bệnh ưa chẩy máu hay còn gọi là Hemophilia là một bệnh
di truyền gen lặn, liên kết nhiễm sắc thể giới tính X thường
gặp ở nước ta. Bệnh Hemophilia là do thiếu các yếu tố
đông máu tham gia vào quá trình đông máu như yếu tố VIII
- hemophilia A hoặc yếu tố IX - hemophilia B [1,2]. Tỉ lệ
mắc bệnh ở các nước khác nhau, trung bình 1/10.000 dân.
Nước ta, theo thống kê của Viện Huyết học và Truyền máu
TW có khoảng 5000 bệnh nhân Hemophilia. Trong số bệnh
nhân mắc bệnh máu khó đông thì bệnh Hemophilia A là
phổ biến hơn cả, chiếm khoảng 85%.Trên thế giới các
nghiên cứu sinh học phân tử đã chứng minh Hemophilia A
có liên quan với một số đột biến nhất định trên gen mã hoá
tổng hợp yếu tố VIII. Trong đó, đột biến ở vùng intron 18
liên quan với sự mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn Bcl
I là phổ biến nhất. Đề tài này, nghiên cứu mối liên quan của
bệnh Hemophilia A ở Việt nam với đột biến này. Trên cơ
sở đó có thể xác định được những bà mẹ mang gen dị hợp
tử X
h
X và chẩn đoán sớm, có thể là ngay từ giai đoạn bắt
đầu mang thai, để có những biện pháp xử lý thích ứng với
mỗi trường hợp.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

1. Đối tượng: Năm ml máu được lấy từ 9 bà mẹ và 9
bệnh nhân nam (con trai của các bà mẹ đó). Máu được
chống đông bằng EDTA 10mM.

2. Phương pháp:

a. ADN được tách từ máu theo phương pháp sử dụng nồng
độ muối cao. [ ]

b. Phản ứng PCR: một ống 50l gồm có: 5l ADN khuôn;
5l dNTPs 10mM; 1,5mM MgCl
2
; 0,5 U Taq; 0,8 nM mỗi
loại mồi; 5l đệm PCR. 50l mỗi ống được làm phản ứng
PCR trên máy Amp Gen 9700 với chương trình 94
o
C- 7’;
30 chu kỳ: 94
o
C - 1’; 58
o
C-1’’; 72
o
C -1’; 72
o
C 10 phút;
40C-20’. 40nM ADN mồi với trình tự của đôi mồi là:

8.1: 5’ TAAAAGCTTTAAATGGTCTAGGC 3’
8.2: 5’ TTCGAATTCTGAAATTATCTTGTTC 3’

c. Cắt sản phẩm PCR với enzym giới hạn: 1l BclI; 3l
đệm enzym NBE3 (New England Biolab) và 25l sản
phẩm PCR

d. Chạy điện di: sản phẩm PCR trước và sau khi cắt với
BclI được chạy điện di trên gel Polyacryamid 10%, 100V
trong 1
h
.

e. Phát hiện các băng ADN bằng phương pháp nhuộm bạc.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Kết quả PCR của các mẫu bệnh phẩm.

ADN tách từ các bệnh nhân Hemophilia A và các bà mẹ
được dùng trong phản ứng PCR.

Hình 1: Kết quả PCR của các mẫu bệnh phẩm M1: Thang
ADN x 174HaeIII; M2: ADN pBR322 MspI; 1-7: Sản
phẩm PCR của bệnh nhân Hemophilia A; 8 chứng dương
người bình thường.


Kết quả điện di trên Hình 1 cho thấy những mẫu bệnh
phẩm cho sản phẩm PCR là đoạn ADN trên intron 18 có độ
dài 142 bp.

2. Kết quả phân tích RFLP của intron 18 bằng emzym
giới hạn BclI

Đoạn ADN dài 142 bp thuộc vùng intron 18 trên nhiễm sắc

thể X bình thường (không có đột biến) có một vị trí nhận
biết của enzym giới hạn BclI tại nucleotit thứ 99. Do đó nó
sẽ bị cắt thành hai đoạn ADN có chiều dài tương ứng là 99
bp và 43 bp. Vạch ADN nhỏ 43bp thể hiện mờ hơn trên gel
vì độ phát sáng của phương pháp nhuộm bạc tương đương
với trọng lượng phân tử ADN. Sự có mặt rõ ràng của vạch
99bp đủ để xác định không có đột biến. Khi xảy ra đột biến
điểm làm thay đổi trình tự tại vị trí nhận biết của BclI, đoạn
ADN không bị cắt và giữ nguyên chiều dài 142 bp. Như
vậy tính đa hình độ dài các đoạn ADN cắt với enzym giới
hạn BclI (PCR-RFLP) gồm các đoạn ADN có kích thước
142 bp; 99 bp và 43 bp. Trên cơ sở đó có thể phân tích kết
quả xét nghiệm của một số cặp mẹ con (Hình 2)

Hình 2: Kết quả điện di và phân tích RFLP. M1: ADN
chuẩn X174 HaeIII; M2: ADN chuẩn pBR 322 MspI. 1-2:
cặp mẹ con thứ 1; 3-4: cặp mẹ con thứ 2; 5-6: cặp mẹ con
thứ 3; 7-8: cặp mẹ con thứ 4


1. Ở cặp mẹ con thứ nhất (1: người con trai; 2: người
mẹ) và thứ tư (7: người con trai; 8: người mẹ) cho thấy tính
đa hình độ dài các đoạn giới hạn với enzym Bcl I (PCR-
RFLP) ở người mẹ thể hiện ba đoạn ADN có kích thước
142bp, 99bp và 43bp. Theo kết quả RFLP của hai người mẹ
này thì đột biến xảy ra trên một nhiễm sắc thể giới tính X
tại vùng không mã hoá intron 18, thuộc đoạn ADN dài
142bp được nhân lên bằng phản ứng PCR. Đột biến này
tương ứng với sự thay đổi nucleotit làm mất vị trí nhận biết
của enzym giới hạn BclI. Kết quả là đoạn ADN dài 142 bp

vẫn được giữ nguyên (Hình 2). Như vậy, có thể kết luận
được người mẹ này có kiểu gen X
h
X và là người mang gen
bệnh. Đồng thời phân tích RFLP trên Hình 2 ở hai người
con trai của hai bà mẹ này cho thấy chỉ có duy nhất một
đoạn ADN kích thước 142 bp. Kết hợp với số liệu được
cung cấp về tình trạng bệnh của người con trai này (người
con trai này bị bệnh máu khó đông Hemophilia A) chúng
tôi có thể đi đến một kết luận chính xác rằng: người con trai
nhận một gen tổn thương X
h
từ mẹ, có kiểu gen là X
h
Y và
biểu hiện kiểu hình bệnh máu khó đông.

Tóm lại có thể nhận định chính xác về tình trạng bệnh ở hai
cặp mẹ con thứ nhất và thứ tư là như sau: kiểu gen của
người mẹ là dị hợp tử X
h
X. Người mẹ mang gen bệnh và
truyền gen đó cho con trai mình tạo nên kiểu gen X
h
Y gây
nên bệnh máu khó đông.

2. Kết quả phân tích đa hình trên Hình 2 ở cặp mẹ con
bệnh nhân thứ 3 (5: con trai; 6: người mẹ) cho thấy vị trí
của enzym giới hạn BclI là đặc hiệu thể hiện qua tính đa

hình ở người con có hai đoạn ADN 99 bp và 43 bp. Kết quả
này chỉ ra rằng nhiễm sắc thể X là bình thường với chỉ thị
enzym giới hạn BclI. Tuy nhiên kết hợp thông tin lâm sàng,
người con trai bị bệnh máu khó đông Hemophilia A như
vậy là nhiễm sắc thể X của người con trai này phải là
không bình thường. Kiểu gen X
h
Y biểu hiện bệnh là do
nhận một nhiễm sắc thể X tổn thương từ mẹ nhưng đột biến
không xẩy ra ở vị trí của BclI mà ở vị trí khác. Điều này
cũng phù hợp khi phân tích tính đa hình của người mẹ chỉ
có hai đoạn ADN là 99 bp và 43 bp. Như vậy cả hai nhiễm
sắc thể X của người mẹ này là bình thường ở vị trí BclI.
Muốn có những kết luận chính xác về tình trạng bệnh máu
khó đông của cặp mẹ con này cần tiến hành thêm ở những
chỉ thị khác làm thêm một số chỉ thị khác như enzym giới
hạn XbaI trên vùng không mã hoá intron 22, enzym giới
hạn HindIII trên vùng không má hoá intron 19, enzym giới
hạn BglI trên intron 25… Nếu kết quả phân tích tính đa
hình trên cặp mẹ con này cũng cho những kết quả tương tự
như khi phân tích với BclI có thể đưa đến một kết luận
khác: nhiễm sắc thể X của mẹ là hoàn toàn bình thường,
bệnh máu khó đông ở người con trai này có thể là do đột
biến tự phát xảy ra trong quá trình hình thành tế bào sinh
dục (ở người mẹ) như các đột biến mất đoạn hay đột biến
điểm. Tuy nhiên tỷ lệ của các đột biến tự phát thường
không cao.

3. Kết quả phân tích đa hình trên Hình 2 của cặp mẹ con
bệnh nhân thứ hai (3: con trai và 4: người mẹ) chỉ có một

đoạn ADN 142bp. Có thể kết luận người mẹ có kiểu gen
đồng hợp tử X
h
X
h
, đột biến xảy ra trên cả hai nhiễm sắc thể
giới tính làm mất vị trí nhận biết của enzym giới hạn BclI.
Những trường hợp phụ nữ mang gen đồng hợp tử X
h
X
h
có
biểu hiện bệnh rất nặng và hiếm gặp. Trên thế giới hiện nay
chỉ ghi nhận 10 trường hợp phụ nữ bị bệnh máu khó đông
và những người này thường chết từ độ tuổi rất sớm do mất
máu nhiều lần trong đời sống sinh lý bình thường có ở bất
kỳ người phụ nữ nào. Tuy nhiên những thông tin về lâm
sàng chỉ ra rằng ở người mẹ này là không phải như vậy.

Kết quả với bà mẹ thứ hai có thể được giải thích như sau:
Đoạn ADN dài 142 bp ở đây không bị cắt có thể do nhiều
lý do như enzym giới hạn không hoạt động, có chất ức chế
trong phản ứng…Do đó chưa thể kết luận được vị trí của
enzym giới hạn BclI tạo nên sự đa hình ADN trên vùng
không mã hoá intron 18. Mặc dù người con trai bị bệnh
máu khó đông nhưng trường hợp này cần phải lặp lại thí
nghiệm phân tích sự đa hình của ADN bằng BclI và làm
thêm một số chỉ thị khác tương tự như đã nếu trong trường
hợp thứ 2. Điều này hoàn toàn có thể giải thích được vì tần
số đa hình cho mỗi chỉ thị không phải hoàn toàn là 100%.

Trong những trường hợp như vậy một trong những hướng
suy nghĩ tiếp theo mà chúng tôi mong muốn được tiến hành
là xác định trình tự đoạn ADN này.

Tổng hợp lại có 4/9 (44,44%) bà mẹ xác định được rõ ràng
sự di hợp tử về bệnh Hemophilia A (X
h
X) và truyền gen
bệnh đột biến trên vùng intron 18 liên quan với enzym giới
hạn BclI sang cho con của mình. Tỉ lệ này cũng tương
đương với các quần thể dân cư khác trong khu vực như
Trung Quốc, Nhật Bản. 3/9 trường hợp (33.33%) đột biến
không xẩy ra trên intron 18 làm mất vị trí nhận biết của
enzym giới hạn Bcl I. Còn lại 2/9 (22,22%) chưa có những
kết luận chính xác và cần phải tiến hành các thí nghiệm
khẳng định khác. Ở đây chúng tôi mới bước đầu xây dựng
và triển khai một phương pháp sinh học phân tử để chẩn
đoán bệnh Hemophilia A. Bệnh nhân mắc bệnh máu khó
đông nếu được phát hiện sớm, điều trị kịp thời và đầy đủ sẽ
tham gia sinh hoạt và hoạt động xã hội như những thành
viên bình thường.Trên cơ sở phương pháp này có thể áp
dụng để xác định sớm, xác định những cá thể mang gen
bệnh (người mẹ) cũng như các cá thể mang các đột biến tự
phát sinh có khả năng lan truyền trong quần thể đối với
bệnh máu khó đông hemophilia A. Qua đó cung cấp những
thông tin chính xác cho công tác chăm sóc và điều trị bệnh
nhân được tốt hơn. Đồng thời có thể đóng góp cho việc
điều tra chất lượng dân số và đề ra những chính sách thích
hợp.

KẾT LUẬN

1. Xây dựng được phương pháp đa hình ADN (PCR-
RFLP) sử dụng enzym giới hạn BclI trên vùng intron 18 để
xác định được những cá thể là các bà mẹ mang gen bệnh
truyền cho con.

2. Bốn trong 9 gia đình có đột biến bệnh máu khó đông
hemophilia A liên qua tới vùng intron 18 và do các bà mẹ
mang gen bệnh truyền cho con trai của mình gây nên tình
trạng bệnh lý.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bạch Quốc Tuyên (1991), Bệnh ưa chẩy máu, Bách
khoa thư bệnh học.
2. Đỗ Trung Phấn (2001), Tổ chức quản lý và chăm sóc
bệnh nhân hemophilia, Thông tin hemophilia Việt nam,
Viện Huyết học và truyền máu TW.
3. Cung Thị Tý (2001) Tình hình bệnh hemophilia ở các
Tỉnh phía bắc Việt Nam, Thông tin Hemophilia Việt Nam,
Viện huyết học và truyền máu.
4. D J. Bowen (2001) “Hemophilai A and hemophilai B:
molecular insight”,
J Clin Pathol: Mol Pathol 2002; 55:1-18.
5. Young Min Choi (2000), “Carrrier detection and
prenatal diagnosis of hemophilia A in A Korean population
By PCR- based analysis of the BclI/ intron 18 and St14
VNTR polymorphisms.” Human Genet 45: 218-223.

CARRIER DETECTION OF HEMOPHILIA A BY
PCR-RFLP ANALYSIS OF THE Bcl 1 / INTRON 18
DNA POLYMORPHISMS

Le Nhat Minh
1
, Le Thi Kim Tuyen
1
, Vo Thi Thuong
Lan
2
, Đo Trung Phan
3

1
National Institute of Hygien and Epidemiology
2
Hanoi National University.
3
National Insitute of Hematology and Blood Transefer

The hemophilia are inherited, life-long,sex-linked disorders
occurring predominantly in males. The incidence is about
1: 5.000 male births and all races and socioeconomic
groups are affected. Haemophilia is allelic X linked
recesive disease caused by mutations in the human Factor
VIII gene. Haemophilia is the classical example of sex
linked recessive disorder. As males have only one X
chromosome, the synthesis of FVIII of FIX wil be deficient
if the relevant gene is defective. A commonly used strategy

for DNA based carrier detection and prenatal diagnosis is
to study the inheritance of DNA polymorphism either
within the FVIII of FIX gene (intragenic) of closely linked
to them (extragenic). Such polymorphisms (RFLP) or
variable number tandem repeats (VNTR) result in up to
95% of families being informative using intragenic
polymorphism where a degree of certainty > 99% can be
expected. Where only linked polymorphisms are useful this
figure is reduced to 95% certainy. These are being
identified with increasing frequency using technology
based on Southern blotting of polymerase chain reaction
(PCR) amplification of specific sequences of DNA to give
adequate quantities for analysis.

In this study we’re applying a new method “use DNA
polymorphism with marker Bcl 1 restriction enzyme on
intron 18” for detecting these mothers who carriers a
abnormal X chromosome with hemophilia and transfer to
her sons make hamophilia patient. The results show that 4/9
(44.45%) mothers is heterozygote with hemophilia A and is
the carriers. We need to determine those mothers in
associate and combine with prenatal, pregnancy diagnosis
to restrict transmission in social.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Hồ Thị Minh Lý.