BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR" ppsx

PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN
TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm Anh
Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương
Khoa Sinh học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên -
ĐHQG Tp HCM
Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản I
Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II

TỔNG QUAN

Virut gây bệnh đầu vàng (YHV-Yellow Head Virus), tìm
thấy đầu tiên tại Thái Lan vào đầu những năm 1990, có vật
chất di truyền là ARN. Đây là một trong những tác nhân
chính gây bệnh đầu vàng ở tôm cùng với một số virut
tương cận như GAV (Gill-Associated Virus) và LOV
(Lymphoid Organ Virus). YHV tác động trên tôm chủ yếu
ở giai đoạn tôm con đến tôm gần trưởng thành. Tôm bệnh
sẽ chết hàng loạt sau 2 - 4 ngày, với sự xuất hiện màu vàng
ở phần đầu ngực và sự nhạt màu của toàn cơ thể. Các quan
sát mô bệnh học cho thấy tình trạng hoại tử của những tế
bào có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung phôi bì cùng với
sự hình thành những thể vùi ưa kiềm trong tế bào chất.

Với khả năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnh
hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của những quốc gia có
nghề nuôi tôm phát triển. Do chưa có thuốc chữa trị đặc
hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất
cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô
bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không

cho phép phát hiện sớm và đặc hiệu tác nhân gây bệnh.
Nhiều phương pháp phân tử như lai tại chỗ, Western blot,
RT-PCR được phát triển nhằm khắc phục những nhược
điểm vừa kể trong việc phát hiện YHV trên tôm sú.

Chúng tôi thiết lập quy trình RT-PCR trên ARN YHV đồng
thời xác định tính đặc hiệu và độ nhạy của quy trình. Quy
trình sau đó được áp dụng để phát hiện YHV trong 20 mẫu
tôm sú nghi nhiễm.

VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP

Mẫu tôm: Các mẫu tôm nghi nhiễm YHV và ARN YHV do
Viện NCNT Thuỷ Sản II cung cấp. Các mẫu này được bảo
quản trong cồn tuyệt đối và giữ ở -20
0
C.
Phương pháp tách chiết ARN (TriZol): Mẫu tôm được
nghiền trong dung dịch TriZol (guanidinium thiocyanate,
phenol pH8, glycerol, sodium acetate). 200 l dịch nghiền
được ly giải và loại protein tiếp tục bằng dung dịch TriZol.
Sau đó ARN được tủa bằng isopropanol. Sau ly tâm, cặn
được làm khô và hòa lại trong 50 l H
2
O đã xử lý DEPC
(Diethyl pyrocarbonate)

Đoạn mồi cho phản ứng RT-PCR: Chúng tôi sử dụng các
phần mềm Annhyb và ClustalX để thiết kế các đoạn mồi
dùng cho phản ứng RT-PCR dựa trên các trình tự hệ gen

YHV được công bố (Tang & Lightner, 1999). Các đoạn
mồi này gồm đoạn mồi xuôi YHVf và các đoạn mồi ngược
YHVr và YHVi với trình tự như sau : YHVf 5'-GTGACC
ATYTYAACTGCAAGATCTCACGRCAACTCA-3',
YHVr 5'-CTGCYACTGAATTTCC
GACGAGAGTGTTAGGAGG-3', YHVi 5'-
GTCTCACACACATGGACTTC-3'.
đoạn mồi do hãng GENSET OLIGO (Singapore) tổng hợp
và cung cấp.

Phương pháp RT-PCR : bao gồm hai bước RT và PCR.
Trong bước RT, phản ứng được thiết lập với1 hạt bead RT-
PCR (Amersham), 1 l đoạn mồi YHVr, 19 l ARN, ủ ở
42
0
C-45 phút. Để tiến hành phản ứng PCR, cho thêm vào
hỗn hợp RT 2 l đoạn mồi YHVf, 1.5 l đoạn mồi YHVi
và nước vừa đủ 50 l. Chương trình PCR : 95
0
C-3'; 15 chu
kỳ 94
0
C-30", 62
0
C-30", 72
0
C-30"; 36 chu kỳ 94
0
C-30",
48

0
C-30", 72
0
C-30"; 72
0
C-6'.
Phương pháp Southern Blot : Các sản phẩm PCR sau điện
di và biến tính được chuyển lên màng lai nylon (Hybond
N+ - Amersham) và tiến hành lai với mẫu dò là trình tự
đoạn mồi YHVi được đánh dấu bằng DIG - dUTP. Bộ kit
DIG Nucleic Acid Detection (Boehringer Mannheim) được
sử dụng để phát hiện các phân tử lai.

KẾT QUẢ - THẢO LUẬN

Kết quả thiết kế đoạn mồi và chương trình PCR tương ứng:
Các đoạn mồi thiết kế cho phản ứng RT và PCR dùng để
nhân bản một trình tự trên ARN hệ gen của YHV có vị trí
bắt cặp dự kiến theo sơ đồ sau (hình 1).

Hình 1 : Sơ đồ bắt cặp các đoạn mồi và sản phẩm PCR từ
ARN hệ gen YHV


Chúng tôi kiểm tra hiệu quả nhân bản của các cặp đoạn mồi
thiết kế cũng như các chương trình PCR tương ứng trên
ARN YHV có (hình 3) và không có (hình 2) kết hợp với
dịch chiết tôm. Kỹ thuật PCR sử dụng ở đây là kỹ thuật
PCR semi-nested, gồm hai bước : (1) PCRI cho phép nhân
bản đoạn ADN có kích thước 303 bp, (2) PCRII nhân bản

đoạn ADN có kích thước 186 bp từ sản phẩm PCRI.

Hình 2 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm
PCRI và II từ RNA YHV.
1,2 : Sản phẩm PCRI (303 bp);
3 : Thang X 174 Hae-III;
4,5 : Sản phẩm PCRII (186 bp).


Hình 3 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm
PCRII từ RNA YHV trộn với dịch chiết tôm
1 : Thang 186 bp
2, 3, 4, 5 : 1 l, 5 l, 10 l, 15l RNA YHV trộn với dịch
chiết tôm


Các kết quả trên cho thấy tín hiệu dương tính nhận được có
cường độ cao, với kích thước như dự kiến ; đồng thời
không thấy sản phẩm ký sinh. Phản ứng tiến hành trên dịch
chiết tôm kết hợp với ARN YHV cũng cho kết quả dương
tính rõ và có cường độ tương ứng với hàm lượng ARN
trong mẫu. Điều này cho thấy đoạn mồi và chương trình
PCR hoạt động tốt.
Tính đặc hiệu của sản phẩm PCR : Chúng tôi sử dụng mẫu
dò đặc hiệu cho YHV để kiểm tra tính đặc hiệu của các sản
phẩm PCR nhận được. Phản ứng Southern blot được tiến
hành trên các sản phẩm PCR khác nhau, được nhân bản từ
ADN MBV (Monodon Baculovirus), ARN YHV và ADN
WSSV (White Spot Syndrome Virus).

Hình 4 A, B : Kết quả điện di và Southern blot với mẫu dò
đặc hiệu cho YHV
1,2 : Sản phẩm PCR từ MBV; 3,4 : Sản phẩm PCRI từ
YHV; 5: Thang X174- HaeIII; 6,7: Sản phẩm PCRII từ
YHV; 8,9: Sản phẩm PCR từ WSSV.


Kết quả (hình 4 A và B) cho thấy tín hiệu lai là hoàn toàn
đặc hiệu cho các mẫu YHV.
Độ nhạy của quy trình RT-PCR : Độ nhạy của quy trình
được xác định bằng cách tiến hành phản ứng RT-PCR trên
ARN YHV (30 g/l) pha loãng nhiều bậc.

Hình 5 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm
PCR từ RNA YHV pha loãng
6: Thang 100 bp; 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11: Các sản phẩm
PCR ứng với độ pha loãng 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-
6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 của RNA YHV


Kết quả trên cho thấy quy trình có khả năng phát hiện được
6 pg ARN YHV hiện diện trong mẫu.

Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm bệnh
đầu vàng

Quy trình đã thiết lập trên ARN YHV được áp dụng để
phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi nhiễm, kết quả được
trình bày trong hình 6 cho thấy có 2/20 mẫu khảo sát cho
kết quả dương tính. Các mẫu còn lại, tuy đã được chẩn

đoán mô học là dương tính với bệnh đầu vàng nhưng lại
cho kết quả RT-PCR âm tính. Điều này có thể do nhiều
nguyên nhân : (1) đoạn mồi không phát hiện được các biến
chủng của YHV địa phương, (2) Mẫu không được bảo quản
tốt dẫn đến sự phân hủy ARN virut, (3) Bệnh do một virut
tương cận nhưng không phải là YHV.

Hình 6: Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi
nhiễm đầu vàng.
11: Thang 100 bp ; 1 - 21: Sản phẩm PCR từ các mẫu tôm
nghi nhiễm.


KẾT LUẬN:

- Quy trình RT-PCR do chúng tôi thiết lập phát hiện được
YHV với độ đặc hiệu cao và độ nhạy là 6pg ARN YHV
tinh sạch.

- Trên 20 mẫu tôm sú nghi nhiễm, quy trình phát hiện 02
mẫu nhiễm YHV.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1- Cowley J.A., Dimmock C.M., Wongteerasupaya C.,
Boonsaeng V., Panyim S. & Walker P.J. 2001. Yellow
head virus from Thailand and gill-associated virus from
Australia are closely related but distinct prawn viruses. Dis.
Aquat. Org.,
2- Tang K.F.J. & Lightner D.V. 1999. A yellow head virus

gene probe : nucleotide sequence and application for in situ
hybridization. Dis. Aquat. Org., 35:165-173.
3- Wongteerasupaya C., Tongchuea W., Boonsaeng V.,
Panyim S., Tassanakajon A., Withyachumnarnkul B. &
Flegel T.W. 1997. Detection of yellow-head virus (YHV)
of Penaeus monodon by RT-PCR amplification. Dis.
Aquat. Org., 31:181-186.


SUMMARY

Detection of yellow head virus (yhv) in black tiger
shrimp (penaeus monodon) by RT-PCR

Yellow head disease (YHD) is one of the most threatening
epidemic diseases in shrimp rearing. Data collected in some
coastal regions of Viet Nam in 2001 showed an infection
rate of about 50-60% in post larvae.

We set up a RT-PCR-based protocol for the detection of
YHV (Yellow Head Virus), one of the main causing agents
of YHD generally called YHCV (Yellow Head Complex
Viruses). We designed primers based on genomic sequence
previously reported (Tang & Lightner, 1999).
Amplification reaction with these primers showed high
specificity and a detection limit of 6pg of pure YHV RNA.
On 20 shrimp samples collected from rearing ponds, RNA
was extracted by Trizol method and amplified using the
established protocol. We obtained two positive signals with
low intensity. This low positive rate may be due to high

genetic polymorphism of YHV or the presence of other
members of the YHCV.

ACKNOWLEDGMENTS: We gratefully acknowledge J.A.
Cowley who provided YHV RNA.

Ngưòi thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương