BÁO CÁO KHOA HỌC: "KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA PLASMID SPV Ở CÁC SALMONELLA PHÂN LẬP TỪ NƯỚC VÀ THUỶ SẢN" pps

KHẢO SÁT SỰ HIỆN DIỆN CỦA PLASMID SPV Ở
CÁC SALMONELLA PHÂN LẬP TỪ NƯỚC VÀ
THUỶ SẢN

Nguyễn Tiến Dũng
Phòng vi sinh, Chi nhánh Kiểm tra chất lượng và Vệ sinh
thuỷ sản 4, TP HCM
Trần Linh Thước
Phòng Thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử, Trường
ĐH Khoa học tự nhiên, Đại học Quốc gia TP HCM

MỞ ĐẦU

Salmonella là vi sinh vật gây bệnh đường ruột quan trọng
về các khía cạnh bệnh học, dịch tễ học, vệ sinh môi trường,
vệ sinh an toàn thực phẩm, Vi khuẩn này phân bố rộng
khắp trong tự nhiên, có thể xâm nhiễm và gây bệnh cho
người, động vật máu nóng, động vật máu lạnh dưới nước
và trên cạn [1]. Sự xâm nhiễm Salmonella vào cơ thể vật
chủ và gây bệnh được thực hiện chủ yếu qua đường tiêu
hoá với biểu hiện phổ biến nhất là gây tiêu chảy, đôi khi là
thương hàn và phó thương hàn. Để gây bệnh, Salmonella
cần phải xâm nhiễm thành công vào bên trong thành ruột,
thích nghi và vô hiệu hoá hệ thống phòng vệ của vật chủ,
sau đó nhân lên và phát tán đến các mô đích [4,5]. Các quá
trình này cần đến vai trò của nhiều gen gây bệnh của
Salmonella hiện diện trên bộ gen và trên plasmid. Plasmid
spv (Salmonella Plasmid Virulence) chứa operon spv có vai
trò quan trọng trong quá trình gây bệnh của plasmid này ở
Salmonella do làm tăng cường độ gây bệnh sau khi vi
khuẩn xâm nhiễm thành công vào bên trong tế bào chủ.

Plasmid spv được tìm thấy ở hầu hết các kiểu huyết thanh
Salmonella được phân lập được từ động vật nhưng hầu như
không hiện diện ở các kiểu huyết thanh có ký chủ chuyên
biệt là người [3].

Locus spv trên plasmid gây bệnh gồm có 5 gen là
spvRABCD, trong đó 4 gen spvABCD cấu trúc thành một
operon. Gen spvR nằm ở một vị trí tách biệt, mã hoá cho
một protein điều hoà sự biểu hiện của operon spvABCD [5].
Operon này được biểu hiện mạnh nhất khi Salmonella đã
xâm nhiễm vào bên trong tế bào vật chủ làm tăng tốc độ
tăng trưởng của Salmonella và chống lại hệ thống phòng vệ
của vật chủ [2].

Trong bài báo này, chúng tôi trình bày các kết quả khảo sát
sự phân bố của plasmid spv trên các dòng Salmonella phân
lập được từ nước và thuỷ sản. Nghiên cứu này nhằm góp
phần làm sáng tỏ vai trò của các gen gây bệnh ở
Salmonella. Việc xác định chính xác các kiểu huyết thanh
Salmonella gây bệnh cho người và tần suất hiện diện của
chúng trong tự nhiên tạo cơ sở cho việc đánh giá mối nguy
hiểm thực sự của các dòng Salmonella có nguồn gốc từ môi
trường tự nhiên nhiễm vào trong thực phẩm.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Chủng vi sinh vật: 140 chủng vi sinh vật đã được sử dụng,
gồm 110 chủng Salmonella, 9 chủng E. coli, 4 chủng
Staphylococcus aureus, 5 chủng Vibrio cholerae, 2 chủng
V. paraheamolyticus, 2 chủng V. vulnificus, 1 chủng
Rhodococcus equi, 2 chủng Streptococcus fecalis, 4 chủng

Shigella spp, 1 chủng Listeria monocytogenes, 1 chủng L.
inocua. Các chủng này được nhận từ Phòng Vi khuẩn
đường ruột Viện Pasteur TP HCM, Trường Đại học Y
Dược TP HCM, Phòng thí nghiệm Vi sinh Chi nhánh Kiểm
tra Chất lượng và Vệ sinh Thuỷ Sản 4 - TP HCM, Phòng
thí nghiệm Thực phẩm Alfred Jogensen, Denmark, Trung
tâm Lưu trữ chủng Quốc gia Norway.

Mồi: Hai cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu này có
các trình tự là: invA1: 5'-
TTGTTACGCCTATTTTGAGCA-3', invA2: 5'-
CTGAGTGCTACCTTGCCTGATG-3' nhằm phát hiện
Salmonella spp bằng phương pháp PCR và spvC1: 5’-
CGGAAATAC CATCTACAAATA-3’, spvC2: 5'-
CCCAAACCCATACTTACTCTG-3' nhằm phát hiện
plasmid spv . Các mồi này được cung cấp bởi Genset
Olygos Singapore Biotech. Pte. LT.
Mẫu thử nghiệm: Mẫu nước được thu từ các ao nuôi tôm
thuộc khu vực TP. HCM và tỉnh Long An. Mẫu thực phẩm
được thu từ các lô hàng thực phẩm chế biến xuất khẩu được
kiểm dịch tại Chi nhánh Kiểm tra chất lượng và Vệ sinh
thuỷ sản 4, TP. HCM.

Xử lý mẫu: 500ml nước được lọc qua màng lọc hay 25g
mẫu thực phẩm được tăng sinh trong môi trường Buffered
Pepton Water (BPW) (Merck, Đức) ở 37
o
C trong 16-18
giờ. Hút 0,5ml dịch sau tăng sinh vào ống eppendorf, ly
tâm để thu nhận sinh khối tế bào, rửa sinh khối với 0,5ml

nước cất vô trùng. Huyền phù sinh khối sau khi rửa với
0,5ml nước cất vô trùng hay đệm TE (0,1mM EDTA,
10mM Tris-HCl pH 8,0), đun sôi cách thuỷ trong 10 phút.
Dịch sau khi đun được ly tâm ở tốc độ 10000vòng/ phút
trong 5 phút, phần dịch nỗi được sử dụng làm khuôn cho
phản ứng PCR.

Phản ứng PCR: Việc khuếch đại bản sao của các gen được
thực hiện bằng phản ứng PCR với các thành phần như sau:
2,5mM Tris, 5mM KCl, 2,5mM MgCl2, 0,1mM
mercaptoethanol, 25g/ml tinh dịch cá hồi, 1l dNTP có
1mM mỗi loại, 1,5l mỗi mồi có nồng độ 6pM, 3l khuôn
DNA. Tổng thể tích trong một phản ứng là 25l. Phản ứng
khuếch đại được tiến hành ở 95
o
C trong 5 phút, sau đó lặp
lại 30 chu kỳ với các bước như sau: biến tính ở 95
o
C trong
1 phút, bắt cặp mồi và khuôn ở 44
o
C, kéo dài ở 72
o
C trong
1 phút. Trước khi kết thúc phản ứng được duy trì 72
ov
C
trong 10 phút. Sản phẩm sau khi khuếch đại được phân tích
bằng điện di gel agarose 2% trong đệm TAE (Tris Acetic
acid EDTA). Kết quả dương tính được ghi nhận khi có sản

phẩm khuếch đại 620bp, phù hợp với kích thước tương ứng
với mồi được thiết lập.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sự đặc hiệu của cặp mồi spvC đối với các Salmonella
mang plasmid spv

Khảo sát được tiến hành trên 9 chủng Salmonella và 8
chủng vi sinh vật không phải Salmonella . Các vi sinh vật
này là những chủng chuẩn và nguồn gốc xuất xứ. Kết quả
được thể hiện trên Hình 1 và Bảng 1:

Hình 1: Sản phẩm 620bp khuếch đại với cặp mồi spvC.
T: Thang DNA, 1: S. typhimurium,
2: S. typhi, 3: S. paratyphi C,
4: S. paratyphi B, 5: S. dublin,
6: S. adabraka, 7: S. enteritidis.

Bảng 1: Kết quả khuếch đại PCR gen spvC trên các chủng
chuẩn



Năm trong số 9 chủng Salmonella được khảo sát cho kết
quả dương tính với cặp mồi spvC là S. typhimurium, S.
enteritidis, S. paratyphi C, S. dublin và S. cholerasuis. Kết
quả này phù hợp với các nghiên cứu của Shoba C. Swamy
[6], Chen Shun Chiu [3], Strephen J. Libby [7] cho thấy
rằng cả 5 kiểu huyết thanh Salmonella đều mang plasmid

spv, trong khi đó 4 kiểu huyết thanh Salmonella còn lại là
những dòng không mang plasmid này. Cả 9 chủng không
phải Salmonella đều không cho tín hiệu khuếch đại với với
cặp mồi spvC. Kết quả này chứng tỏ cặp mồi spvC đặc hiệu
cho plasmid spv của Salmonella.

Sự hiện diện của plasmid spv trong các dòng Salmonella
đưỵc phân lập từ nước và thực phẩm thuỷ sản.

Khảo sát được tiến hành trên 102 chủng Salmonella, 8
chủng E. coli, 4 chủng Staphylococcus aureus, 4 chủng
Vibrio cholearae, 4 chủng V. parahearmolyticus đã được
phân lập từ nước các ao nuôi thuỷ sản và từ các loại thực
phẩm có nguồn gốc thuỷ sản. Kết quả được thể hiện trên
Hình 2 và Bảng 2.

Hình 2: Sự hiện diện của plasmid spv ở các dòng
Salmonella được phân lập từ nước tự nhiên và thực phẩm.
T: thang DNA, caực gieỏng 1; 3; 5: sản phẩm 520bp
khuếch đại với mồi invA của Salmonella, các giếng 2, 4, 6:
sản phẩm 620bp khuếch đại với mồi spvC của Salmonella,
7: E. coli khuếch đại với cặp mồi spvC.

Bảng 2: Sự hiện diện plasmid spv ở các chủng vi sinh vật
khảo sát



Kết quả ở Bảng 2 cho thấy các vi sinh vật không phải
Salmonella đều không mang plasmid spv. Kết quả này một

lần nữa khẳng định plasmid gây bệnh spv chỉ có ở
Salmonella mà không có ở các vi sinh vật gây bệnh khác.
Ngoài ra, chỉ có 5/102 chủng Salmonella có nguồn gốc từ
nước tự nhiên và thực phẩm có mang plasmid spv, chiếm tỉ
lệ 4,9%.
Nghiên cứu của Shoba W. Swamy và các đồng sự đã cho
thấy 100% Salmonella phân lập được từ trứng đều có mang
plasmid spv, trong khi đó 0% Salmonella được phân lập từ
nước trong môi trường tự nhiên hoặc nước thải sinh hoạt
mang plasmid này [6]. Nghiên cứu của Cheng – Hsun Chiu
và đồng sự cho kết quả là 55% số chủng Salmonella phân
lập được từ phân trẻ em bị bệnh viêm đường tiêu hoá có
mang plasmid spv [3]. Các kết quả này cùng với kết quả
khảo sát của chúng tôi đã cho thấy rằng tỉ lệ Salmonella
mang plasmid spv trong tự nhiên rất thấp.

Vậy plasmid spv không đóng vai trò quyết định trong quá
trình gây bệnh cho con người. Tuy nhiên các nghiên cứu so
sánh khả năng gây bệnh ở các dòng Salmonella mang
plasmid spv và các dòng không mang plasmid cho thấy
chúng đóng vai trò trong việc tăng cường biểu hiện bệnh lý
trên động vật thí nghiệm. Những Salmonella có plasmid
spv thường có LD50 thấp hơn khoảng 10-100 lần so với các
dòng không mang plasmid.

Tỉ lệ Salmonella trong nước tự nhiên mang plasmid spv
thấp chứng tỏ rằng cường độ gây độc của các Salmonella
có nguồn gốc tự nhiên là rất yếu. Điều này giải thích tại sao
từ trước đến nay hầu như không có vụ ngộ độc Salmonella
nào gây ra do nước hay do ăn thuỷ sản nhiễm Salmonella

được công bố trong khi tần suất trung bình của thực phẩm
có nguồn gốc thủy sản nhiễm Salmonella là 2 - 3%.

Khảo sát độ nhạy phát hiện Salmonella mang plasmid trong
mẫu nước và mẫu thực phẩm
Chúng tôi tiến hành lây nhiễm S. typhimurium với các mật
độ khác nhau vào trong các loại mẫu có mật độ vi sinh vật
khác nhau, sau đó thực hiện việc phát hiện Salmonella spp
bằng cặp mồi invA và plasmid spv bằng cặp mồi spvC. Kết
quả được thể hiện trên Bảng 3.
Bảng 3: Độ nhạy phát hiện Salmonella mang plasmid spv
trong nước và mẫu thực phẩm


Bảng 3 cho thấy phương pháp PCR có độ nhạy phát hiện
plasmid spv với cặp mồi spvC tương tự độ nhạy phát hiện
Salmonella spp bằng mồi invA. Mức phát hiện thấp nhất là
1-5 tế bào/25g mẫu thực phẩm hay 500ml nước tự nhiên
sau bước tăng sinh trên môi trường Buffered Pepton Water.
Sự tương đồng nhau về độ nhạy phát hiện Salmonella spp
và plasmid spv là một sự thuận lợi rất lớn để thiết lập qui
trình phát hiện phân biệt đồng thời Salmonella mang
plasmid spv với Salmonella không mang plasmid này.

Khảo sát sự hiện diện của Salmonella mang plasmid spv
trong nước tự nhiên

Chúng tôi cũng đã tiến hành khảo sát 105 mẫu nước lấy từ
các ao nuôi tôm và sông lạch tại huyện Cần Giờ, TP HCM
và huyện Cần Đước tỉnh Long An để khảo sát tần suất hiện

diện của Salmonella mang plasmid spv trong tự nhiên. Kết
quả khảo sát được thể hiện trên Bảng 4.

Bảng 4: Sự hiện diện Salmonella spp và plasmid spv trong
nước tự nhiên



Kết quả trên Bảng 4 cho thấy mặc dù tần suất hiện diện
Salmonella trong nước rất cao (47,6% số mẫu khảo sát)
nhưng trong số đó chỉ có khoảng 2% số Salmonella mang
plasmid spv. Nói cách khác, chỉ có khoảng 1% mẫu nước
có sự hiện diện của Salmonella chứa plasmid spv. Kết quả
nghiên cứu này phù hợp với kết quả của Shoba C. Swamy
khi không phát hiện được chủng nào mang plasmid spv
trong số 84 chủng Salmonella phân lập được từ nước thải
sinh hoạt [6]. Kết quả này một lần nữa khẳng định rằng rất
hiếm Salmonella phân bố trong tự nhiên mang plasmid gây
bệnh spv. Điều điều đó có nghĩa các Salmonella hiện diện
trong trong môi trường tự nhiên có độc lực kém hơn các
Salmonella phân lập được từ các ký chủ là động vật máu
nóng. Tuy nhiên để đi đến khẳng định rằng các Salmonella
phân bố tự nhiên trong môi trường ít có khả năng gây bệnh
cho con người cần phải có nhiều nghiên cứu sâu hơn trên
các gen gây bệnh khác ở Salmonella .

KẾT LUẬN

Việc khảo sát trên 111 chủng Salmonella (102 chủng phân
lập được từ nước tự nhiên, thực phẩm có nguồn gốc thuỷ

sản) cho thấy cặp mồi spvC là đặc hiệu cho việc phát hiện
plasmid spv. Thực nghiệm cũng cho thấy plasmid này chỉ
hiện diện trong Salmonella mà không hiện diện trong các vi
sinh vật gây bệnh khác. Trong số các chủng Salmonella có
nguồn gốc từ nước và thực phẩm thuỷ sản, chỉ có 4,9% số
chủng mang plasmid spv. Điều này cho phép bước đầu
khẳng định rằng các Salmonella có nguồn gốc tự nhiên có
độc lực thấp hơn các dòng Salmonella trong bệnh phẩm
hay có nguồn gốc từ các động vật máu nóng. Nghiên cứu
của chúng tôi cũng cho thấy rằng độ nhạy phát hiện
Salmonella mang plasmid spv và phát hiện Salmonella spp
bằng PCR là tương tự nhau ở mức 1-5 tế bào/25g thực
phẩm hay 500ml nước. Kết quả này tạo cơ sở để phát hiện
phân biệt Salmonella spp và Salmonella mang plasmid spv
sau này.

Cùng với việc khảo sát trên các chủng thuần, chúng tôi
cũng đã khác sát sự hiện diện của các Salmonella mang
plasmid spv trực tiếp trên mẫu nước tự nhiên. Kết quả cũng
cho thấy rằng chỉ có khoảng 1% trong số các mẫu có
Salmonella mang plasmid này. Kết quả này tái khẳng định
chỉ có một tỉ lệ rất thấp Salmonella trong tự nhiên mang
plasmid gây bệnh spv.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. ANDREAS J. BAUMLER, RENEE M. TSOLIS,
THOMAS A. FICHT, AND L. GARRY ADAMS.
Evolution of Host Adaptation in Salmonella enterica,
Infect. Immun. 66 (10): 4579 - 4587, 1998.

2. C. ROUDIER, J. FIERER AND DG. GUINEY.
Characterization of translation termination mutations in the
spv operon of the Salmonella Virulence Plasmid pSDL2. J.
Bacteriol., 174 (20): 6418 - 6423, 1992.
3. CHENG HSUN CHIU AND JONATHAN T. OU.
Rapid Identification of Salmonella serovars in feces by
specific detection of virulence gens, invA and spvC, by an
Enrichment broth culture multiplex PCR combination
assay. Journal of Clinical microbiology, p. 2619-2622. Oct.
1996.
4. K. HERAN. DARWIN AND VIRGINIA L. MILLER.
Molecular Basis of the Interaction of Salmonella with the
Intestinal Mucosa, Clinical Microbiol. Reviews. 12 (3): 405
-428, 1999.
5. PHILIPP GROB AND DONALD G. GUINEY. In
vitro binding of the Salmonella dublin Virulence Plasmid
regulatory protein SpvR to the promotor regions of spvA
and spvR . Journal of Bacteriology, p. 1813-1820. Apr.
1996.
6. SHOBA C. SWAMY; HAROLD M. BANHART;
MARGIE D. LEE AND DAVID W. DREESEN. Virulence
determinants invA and spvC in Salmonella isolated from
poultry products wastewater and Human sources. Applied
and Emvironmental Mcrobiology. p. 3768-3771. Oct. 1996.
7. STEPHEN J. LIBBY, L. GARRY ADAMS,
THOMAS A. FICHT, CHRIS ALLEN, HOWARD A.
WITHFORD, NANCY A. BUCHMEIER, STUART
BOSSIE, AND DONALD G. GUINEY. The spv Genes on
the Salmonella dublin Virulence Plasmid Are Require for
Severe Enteritis and Systemic Infection in the Nature Host.

Infect. Immun. 65 (5): 1786 – 1792. 1997.


SUMMARY'
Investigating the presence of the spv plasmid in
Salmonella isolates from seafood
and natural water

Salmonella plasmid virulence presents in some serotype of
Salmonella conferring the bacteria the ability to enhance
the virulence in host. Salmonella serovars containing this
plasmid were mainly isolated from human and warm-
blooded animal, rarely from the environment. We have
succesfully established a protocol for detection of spv
plasmid in bacteria using a polymerase chain reaction,
PCR, with a primer pair designed for aplification of the
spvC gene on the spv operon in the plasmid. The specificity
of the primer was confirmed using 5 spv-containing and 4
spv-free Samonella serovars and 9 type strains of different
enteric pathogens. The sensitivity of the protocol was
proved to be 1-5 cfu per 25g food or 500ml water using
spv-containing Salmonella inoculated foods or natural
water, respectively. The protocol was used to examine the
presence of spv plasmid among 102 Salmonella isolates and
17 other enteropahogenic isolates from seafood and fishery
aquaculture water samples. Five of 102 isolated Salmonella
serovars (4,9%) contained the plasmid. On the other hand,
the protocol was used in combination with a PCR protocol,
which had been established to detect Samonella spp. basing
on invA as targeted gene, to examine the frequency of

detection of spv in Salmonella spp. from natural water.
Among 105 examined samples, 47,9% of them was
infected with Salmonella spp. but only 2% of the detected
Salmonella isolates contained the plasmid. These results
suggested that natural originated Salmonella serovars are
less virulent than those isolates from swab or warm-
blooded animals.

Người thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương.