BÁO CÁO KHOA HỌC: "PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA A BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEP VENT ADN POLYMERASE" pot

PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEP
VENT ADN POLYMERASE

Nguyễn Hoài Giang
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Nguyễn Tùng Lâm
Trường Đại học Ngoại Thương

ĐẶT VẤN ĐỀ

Haemophilia A (bệnh máu khó đông) là một trong những
bệnh di truyền phổ biến liên quan đến nhiễm sắc thể X.
Ước tính trên thế giới có khoảng từ 1/5000 đến 1/10.000
các bé trai sinh ra mắc bệnh này. Theo số liệu thống kê của
Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương số lượng bệnh
nhân Haemophilia A ở Việt nam cũng không phải là nhỏ.
Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh Haemophilia A
là do các đột biến ở gen mã hoá cho yếu tố đông máu số
VIII (factor VIII). Gen này nằm trên cánh dài của nhiễm
sắc thể tại vị trí Xq28. Gen mã hoá cho yếu tố VIII rất lớn
(khoảng 180 kb) bao gồm 26 exon (1). Kỹ thuật PCR dùng
Taq ADN polymerase, sau đó phát hiện điểm đột biến bằng
enzyme giới hạn (PCR-RFLP) đã được các nghiên cứu
trước đây sử dụng rất có hiệu quả để phát hiện các đột biến
của bệnh Haemophilia A(1, 2).

Deep Vent ADN polymerase có hoạt tính xúc tác quá trình
tổng hợp ADN mới như Taq ADN polymerase. Các nghiên
cứu của hãng New England Biolab cho thấy Deep Vent
ADN polymerase có nhiều ưu điểm hơn so với Taq ADN

polymerase. Ở 95
o
C, Taq ADN polymerase bị mất 50%
hoạt tính xúc tác sau 40 phút so với 1380 phút cùng điều
kiện của Deep Vent ADN polymerase. Deep Vent ADN
polymerase lại ít gây lỗi khi xúc tác tổng hợp sợi ADN mới
so với Taq ADN polymerase (3, 4). Những đột biến ở
intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII là đột biến
mất vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I và Hind
III(1, 2). Do vậy, độ chính xác của các sản phẩm PCR so
với khuôn mẫu ADN ban đầu rất quan trọng, nó đảm bảo
kết quả chẩn đoán phát hiện đột biến ở bệnh nhân
Haemophilia A. Trong nghiên cứu này, chúng tôi muốn sử
dụng ưu điểm ít gây lỗi trong quá trình xúc tác của Deep
Vent ADN polymerase để sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP
phát hiện các đột biến ở intron 18 và 19 của gen mã hoá
cho yếu tố đông máu số VIII. Kỹ thuật này có thể ứng dụng
để phát hiện các phụ nữ mang gen bệnh và chuẩn đoán sớm
trước sinh bệnh Haemophilia, phục vụ chương trình chăm
sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng.


VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Vật liệu

19 mẫu máu của bệnh nhân Haemophilia A do Viện Huyết
học và Truyền máu Trung ương cung cấp. 25 mẫu máu của
người bình thường khoẻ mạnh do Viện Vệ sinh Dịch tễ
Trung ương cung cấp. Taq ADN polymerase, Deep Vent

ADN polymerase, các enzyme giới hạn Bcl I và Hind III và
thang ADN chuẩn 100bp của hãng New England Biolabs
(Mỹ). Các hoá chất khác sử dụng cho nghiên cứu này đều
của các hãng Sigma, Merck, Promega…

Phương pháp nghiên cứu

• Tách chiết ADN từ máu được cải tiến theo phương
pháp được mô tả bởi Sambrook và cộng sự (5).

• Phản ứng PCR sử dụng enzyme Taq ADN polymerase,
với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và 19 của yếu tố VIII
được tiến hành theo nghiên cứu của Kogan và cộng sự (2).

• Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và
19 của yếu tố VIII, sử dụng enzyme Deep Vent được tối ưu
theo theo phương pháp nghiên cứu được mô tả bởi Nguyễn
Hoài Giang và các đồng tác giả (6).

• Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Bcl I và Hind
III theo thường qui chuẩn của hãng New England Biolabs
(4).

• Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6% và
nhuộm bạc theo phương pháp của Sambrook và cộng sự
(5).


KẾT QUẢ, THẢO LUẬN

1. Phát hiện đột biến ở intron 18 của gen mã hoá cho
yếu tố đông máu số VIII

0,5 ml của 44 mẫu máu (19 mẫu của bệnh nhân
Haemophilia A và 25 mẫu của người bình thường khoẻ
mạnh) được tách chiết ADN bằng đệm phân giải, đệm phân
giải nhân, proteinase K và kết tủa ADN bằng isopropanol,
theo phương pháp đã cải tiến của Sambrook và cộng sự (5).
Kết quả đo OD ở bước sóng 260 nm cho thấy tất cả các
mẫu ADN tách chiết được đều đủ điều kiện để tiến hành
phản ứng PCR. Sủ dụng điều kiện PCR dùng Taq ADN
polymerase cho cặp mồi của intron 18, gen mã hoá yếu tố
VIII theo Kogan và cộng sự (30 chu kỳ với 94
o
C-1 phút,
45
o
C-1 phút, 72
o
C -1 phút), chúng tôi đã thành công trong
việc khuyếch đại intron này từ các mẫu ADN của người
khoẻ mạnh và bệnh nhân Haemophilia A (giếng 1 , Hình
1). Theo nghiên cứu của hãng New England biolabs và
kinh nghiệm của chúng tôi về Deep Vent ADN polymerase
(4, 6), điều kiện PCR với Deep Vent ADN polymerase cho
cặp mồi của intron 18 sau khi tối ưu hoá là 30 chu kỳ với
94
o
C-30 giây, 50
o

C-20 giây, 72
o
C-20 giây; 2 mM Mg
2+
;
200 àM dNTPs. Kết quả điện di trên gel polyacrylamide
6% cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho
intron 18 có kích thước 142 bp ở cả người bình thường
khoẻ mạnh và bệnh nhân Haemophilia, giống như kết quả
của Kogan và cộng sự (giếng 1 đến 3, Hình 1). Theo nghiên
cứu trước đây (1, 2), đột biến ở intron 18 sẽ làm thay đổi vị
trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I. Nghĩa là những
bệnh nhân Haemophilia A có đột biến ở intron 18 sẽ không
thay đổi kích thước của sản phẩm PCR sau khi ủ với
enzyme Bcl I (giếng 5, Hình 1). Ngược lại những người
bình thường khoẻ mạnh hoặc những bệnh nhân
Haemophilia A không có đột biến ở intron 18 sẽ bị enzyme
giới hạn Bcl I cắt tạo ra 2 băng kích thước 99 và 43 bp
(giếng 4, Hình 1). Trong số 25 mẫu người bình thường
khoẻ mạnh khi sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP với cặp mồi
đặc hiệu cho intron 18: 25/25 mẫu (100%) đều bị cắt với
enzyme Bcl I ở 50
o
C sau 12 giờ. Trong số 19 mẫu bệnh
nhân Haemophilia A có 8 mẫu không bị cắt và 11 mẫu bị
cắt bởi enzyme Bcl I ở 50
o
C sau 12 giờ. Kết quả này cho
thấy có 8/19 (42%) số bệnh nhân Haemophilia A được
nghiên cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho

yếu tố VIII.


Hình 1. PCR-RFLP với intron 18 (Haemophilia A).

Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Taq
ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết từ mẫu máu
của người bình thường khoẻ mạnh).

Giếng 2: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme
Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết
từ mẫu máu của người bình thường khoẻ mạnh).

Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme
Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết
từ mẫu máu của bệnh nhân Haemophilia A).

Giếng 4: Sản phẩm PCR (ở giếng 2) sau khi cắt bằng
enzyme Bcl I.

Giếng 5: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi cắt bằng
enzyme Bcl I.

Mr: Thang ADN chuẩn - 100bp (New England Biolabs).



2. Phát hiện đột biến ở intron 19 của gen mã hoá yếu tố
đông máu số VIII

Sử dụng điều kiện PCR của intron 19 của Kogan và cộng
sự là 30 chu kỳ với 94
o
C-1 phút, 55
o
C-1 phút, 70
o
C-3 phút;
chúng tôi cũng đã thành công trong việc khuyếch đại intron
này bằng Taq ADN polymerase (giếng 1, Hình 2). Tương
tự với intron 18, điều kiện PCR với Deep Vent ADN
polymerase cho cặp mồi của intron 19 sau khi tối ưu hoá là
30 chu kỳ với 94
o
C-30 giây, 57
o
C-20 giây, 72
o
C-40 giây và
sản phẩm PCR có kích thước 730 bp.

Loại trừ 8 mẫu đã phát hiện được mang đột biến ở intron
18, 11 mẫu bệnh nhân còn lại và 25 mẫu người bình thường
khoẻ mạnh được khuyếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu cho
intron 19 với Deep Vent ADN polymerase theo điều kiện
PCR đã được tối ưu hoá như trên (giếng 3 và 5, Hình 2).
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ rõ đột biến ở intron 19 sẽ
làm thay đổi vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Hind III
(1, 2). Nghĩa là những bệnh nhân Haemophilia A có đột
biến ở intron 19 sẽ không thay đổi kích thước của sản phẩm

PCR sau khi ủ với enzyme Hind III. Ngược lại những
người bình thường khoẻ mạnh hoặc những bệnh nhân
Haemophilia A không có đột biến ở intron 19 sẽ có một
hoặc hai vị trí nhận biết đặc hiệu với enzyme giới hạn Hind
III cắt tạo ra 2 băng kích thước 480 và 250 bp hoặc 3 băng
kích thước 480, 160 và 90 bp (1, 2). Tất cả các mẫu bệnh
nhân Haemophilia A (11/11 hay 100%) đem nghiên cứu,
đều bị cắt bởi enzyme Hind III ở 37oC sau 12 giờ (giếng 2,
4 và 6, Hình 2). Kết quả nghiên cứu trên 11 bệnh nhân
Haemophilia A cho thấy không phát hiện được đột biến ở
intron 19 gen mã hoá cho yếu tố VIII. Kết quả này có thể
được giải thích là do đột biến ở intron 19 không phổ biến ở
bệnh nhân Haemophilia A của Việt nam hoặc chúng tôi cần
tăng số mẫu nghiên cứu lên nhiều hơn nữa.




Hình 2. PCR-RFLP với intron 19(Haemophilia A).

Giếng 1: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme Taq
ADN polymerase. (ADN khuôn được tách chiết từ máu của
người bình thường khoẻ mạnh).

Giếng 2: Sản phẩm PCR (ở giếng 1) sau khi cắt bằng
enzyme giới hạn Hind III.

Giếng 3: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme
Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết
từ máu của người bình thường khoẻ mạnh).

Giếng 4: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi cắt bằng
enzyme Hind III.

Giếng 5: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme
Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết
từ máu của bệnh nhân Haemophilia A).

Giếng 6: Sản phẩm PCR (ở giếng 5) sau khi cắt bằng
enzyme Hind III .

Mr: Thang ADN chuẩn 100bp.



KẾT LUẬN

• Hình thành được qui trình phát hiện các đột biến ở
intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII, bệnh
Haemophilia A bằng kỹ thuật PCR-RFLP với Deep Vent
ADN polymerase.

• 8/19 (42%) số bệnh nhân Haemophilia A được nghiên
cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho yếu tố
VII và không có mẫu nào mang đột biến ở intron 19.



TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Bowen DJ. (2002). Haemophilia A and haemophilia
B: molecular insights. Mol. Pathol. 55:1-8.
2. Kogan SC, Doherty M and Gitschier J (1987). An
improved method of prenatal diagnosis of nenetics disease
by analysis of amplified DNA sequences-application to
haemophilia A. N. Engl. J. Med. 317:985-990.
3. Rolfs AI. Schuller U. Finckh I. Weber-Rolfs (1992).
PCR: Clinical Diagnostics and Research. Springer-Verlag
Berlin, Heidelberg.
4. Catalog and Technique Reference 2000-2001. New
England Biolab.
5. Sambrook J, Frisch EF, and Maniatis T. (1989).
Molecular Cloning. Cold Spring Harbor Laboratory Press,
USA.
6. Nguyễn Hoài Giang, Nguyễn Hạnh Phúc, Lê Thị Kim
Tuyến. (2002). Tối ưu hoá điều kiện phản ứng PCR sử
dụng Deep vent ADN polymerase để khuyếch đại gen NS4
của virút hepatitis C. Tạp chí Nghiên cứu Y học. 1: 9-11.


LỜI CẢM ƠN

Các tác giả xin cảm ơn Viện Huyết học và Truyền máu
Trung ương đã cung cấp các mẫu máu của bệnh nhân
Haemophilia A.

Các tác giả cũng xin cảm ơn TS. Nguyễn Hạnh Phúc (Viện
Vệ sinh Dịch tễ Trung ương) đã hỗ trợ kinh phí cho nghiên
cứu này.

SUMMARY

Detection of mutations (in Introns 18 and 19) from
haemophilia patients by PCR-RFLP with DEEP VENT
DNA POLYMERASE

Haemophilia A is an X-linked recessive genetic disorder
caused by the mutations in the factor VIII gene. The
incidence of haemophilia A is from 1/5000 to 1/10.000
males births. The changes of factor VIII gene are the points
mutations and inversion mutation in intron 22. Genetics
analysis in haemophilia A families is widely carried out by
linkage analysis by allelotyping using restriction fragment
length polymorphism (RFLP) and microsatellite repeat
(STR) markers to track chromosomes linked with the
disease. PCR-RFLP is a fast and convenient method to
detect the mutations in the factor VIII gene.

Deep Vent DNA polymerase is purified from the strain of
E.coli that carries the Deep Vent DNA polymerase gene of
Pyrococcus species GB-D. The native organism was
isolated from a submarine thermal vent at 2010 meters and
it able to grow at temperature as high as 104oC. Deep Vent
DNA polymerase is a high-fidelity thermophilic DNA
polymerase. The fidelity of Deep Vent DNA polymerase is
derived in part from an integral 3’-5’ proofreading
exonuclease activity.

In this study, we applied the PCR-RFLP technique with

Deep Vent DNA polymerase to detect the mutations in
introns 18 and 19 of factor VIII gene from Vietnamese
haemophilia A patients. Our data showed that 8/19 (42%)
patients have the mutation in intron 18 and none of them
has the mutation in intron 19. This method can be used for
carrier analysis and prenatal diagnosis of haemophilia A.



Người thẩm định nội dung khoa học: GS.TS. Lê Đình
Lương