BÁO CÁO KHOA HỌC: "NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY BAO PHẤN NGÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI HỮU TÍNH" doc

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN HIỆU QUẢ NUÔI CẤY
BAO PHẤN NGÔ BẰNG PHƯƠNG PHÁP LAI HỮU
TÍNH

Lê Huy Hàm
Viện Di truyền nông nghiệp

ĐẶT VẤN ĐỀ

Một trong những khó khăn cơ bản hạn chế ứng dụng rộng
rãi nuôi cấy bao phấn trong chọn tạo giống ngô là tính phụ
thuộc vào giống . Mặc dù có những tiến bộ rất lớn trong
thời gian qua nhưng nuôi cấy bao phấn chỉ được ứng dụng
có hiệu quả đối với một số giống. Đối với các giống Việt
nam quy trình này kém hiệu quả do các nguyên nhân sau:

- Giống không phản ứng hay phản ứng rất thấp với môi
trường, số phôi tạo thành quá ít.

- Khả năng tái sinh của phôi thành cây thấp. Tái sinh qua
callus gây nhiều dị thường. (Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh,
Trần Duy Quý, Buter, 1999)

Các nghiên cứu về di truyền đã cho thấy rằng có ít nhất 9
locut trên các nhiễm sắc thể khác nhau liên qua đến phản
ứng của ngô trong nuôi cấy bao phấn (Beckert, 1994).
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã khắc phục hiện tượng
phụ thuộc vào giống bằng cách lai hữu tính các giống ngô
Việt nam có phản ứng thấp trong nuôi cấy bao phấn với các
giống ngô có phản ứng cao nhằm chuyển các gen phụ trách
về phản ứng trong nuôi cấy bao phấn của các giống có phản

ứng cao vào các giống ngô Việt nam.

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Các giống ngô Việt Nam có mức độ phản ứng thấp khác
nhau trong nuôi cấy bao phấn đã được sử dụng làm các
dòng mẹ để lai với các giống ngô có phản ứng cao trong
nuôi cấy bao phấn. Đó là các giống ngô ETH - M82, M24.
Việc lai tạo được tiến hành theo phương pháp truyền thống
sử dụng cho ngô trên đồng ruộng.

Vì phản ứng của các giống ngô trong nuôi cấy bao phấn là
một đặc tính chịu ảnh hưởng của điều kiện khí hậu, đặc
điểm thổ nhưỡng và điều kiện gieo trồng, cho nên để tiện
so sánh, các giống mẹ và con lai được gieo đồng thời, các
chế độ chăm bón, thu hoạch và xử lý cờ đảm bảo hoàn toàn
giống nhau. Mỗi giống mẹ và con lai được gieo 20-30 hạt,
từ đó thu được từ 15 - 20 hoa đực. Sau khi xử lý lạnh 7
ngày, từ mỗi hoa đực được tách ít nhất 120 bao phấn để
nuôi cấy trong 4 đĩa petri với mật độ 30 bao phấn/đĩa. Phản
ứng trong nuôi cấy bao phấn của từng cá thể của mỗi cặp
lai được ghi nhận và phản ứng của con lai được đánh giá
trên cơ sở phản ứng trung bình của 15 - 20 cá thể. Môi
trường và quy trình nuôi cấy được thực hiện như đã mô tả
trong các công bố trước đây (Lê Huy Hàm và CS 1997;
1998; 1999)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả nghiên cứu phản ứng của con lai được trình bày ở

bảng 1, biểu đồ 1. Trên bảng: dòng trên là phản ứng của
cây mẹ, dòng dưới là phản ứng của con lai. Trên biểu đồ:
cột bên trái là phản ứng của giống Việt nam, cột liền kề bên
phải là phản ứng của con lai . Ta thấy, so với giống mẹ
(ngô Việt Nam) tất cả các con lai đều có phản ứng trong
nuôi cấy bao phấn cao hơn hẳn. Nếu phản ứng của tập đoàn
ngô Việt Nam chỉ ở vào khoảng 0% - 12% (Le Huy Ham at
all, 1998) thì phản ứng của con lai đạt từ 30% đến 67%.

Bảng 1: Phản ứng nuôi cấy bao phấn của một số giống ngô
Việt Nam và con lai




Biểu đồ 1: Phản ứng trong nuôi cấy bao phấn của giống
ngô mẹ (Việt Nam) và con lai


So sánh phản ứng của con lai và giống mẹ của từng cặp lai
ta được kết quả như sau:

F
1
của cặp LVN18 x M82 phản ứng cao hơn LVN18 từ 9 -
10 lần
F
1
của cặp LVN4 x M82 phản ứng cao hơn LVN4 từ 7 - 8
lần

F
1
của cặp LVN17 x M24 phản ứng cao hơn LVN17 nhiều
lần
F
1
của cặp LVN5 x M82 phản ứng cao hơn LVN5 nhiều lần
F
1
của cặp LVN20 x M82 phản ứng cao hơn LVN20 từ 11 -
12 lần

Như vậy ta thấy rằng trong tất cả các cặp lai, các con lai
đều có phản ứng cao hơn giống mẹ hàng chục lần. Điều đó
thể hiện ở cả hai chỉ số quan trọng là số phôi tạo thành và
số cây tái sinh. Các giống bố M24, M82 là những giống có
nguồn gốc ôn đới, thích nghi kém trong điều kiện Việt
Nam, các giống mẹ là các giống ngô Việt Nam có tiềm
năng sinh trưởng và năng suất cao. Các con lai ở đây đều
sinh trưởng rất khoẻ, tương đương hoặc hơn giống mẹ. Với
tỷ lệ tạo phôi và tái sinh cao, các con lai này ngay từ giai
đoạn này có thể dùng để sản xuất các dòng thuần để cung
cấp cho chọn giống.

Theo Beckert (1994). Tính phản ứng trong nuôi cấy bao
phấn là một đặc tính đa gen, nó được kiểm soát bởi ít nhất
9 locut khác nhau, nằm trên các nhiễm sắc thể khác nhau.
Các nghiên cứu đã tiến hành ở các nước như Thuỵ Sỹ,
Pháp, Thái Lan đã chứng minh rằng, tính phản ứng trong
nuôi cấy bao phấn là một đặc tính di truyền và bằng

phương pháp lai có thể chuyển được các locut phụ trách các
giai đoạn khác nhau trong chuỗi dây chuyền phản ứng của
tiểu bào tử trong nuôi cấy sang các dòng mong muốn
(Buter, 1993; Saisingtong at all, 1996; Jumpatong at all,
1996). Các kết quả chúng tôi thu được chứng tỏ rằng đây là
phương pháp rất có hiệu quả để tạo ra các giống ngô có
phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn để phục vụ cho sản
xuất các dòng thuần.

Nghiên cứu phản ứng cá thể của các giống ngô con lai

Để hiểu rõ bản chất tính phản ứng cao trong nuôi cấy bao
phấn của các con lai thu được, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu phản ứng của từng cá thể. Ba con lai có phản
ứng tương đối cao đã được chọn làm thí nghiệm là LVN18
x M82, LVN17 x M82, LVN4 x M82.
Mỗi giống ngô trên được gieo 20 - 25 hạt và thu được từ 15
- 20 hoa đực. Trong số các hoa đực thu được mỗi con lai
được chọn 11 cá thể để nghiên cứu. Từ mỗi hoa, chúng tôi
đã tách khoảng 240 bao phấn để kiểm tra phản ứng trong
nuôi cấy bao phấn. Bao phấn của từng cá thể được theo dõi
tuyệt đối riêng rẽ để đánh giá mức độ phản ứng riêng của
mỗi cá thể. Môi trường nuôi sử dụng là môi trường IM lỏng
không có giá thể (xem Le Huy Ham at all 1998). Bao phấn
được giữ trong môi trường trong suốt thời gian nuôi, chỉ
những phôi tạo thành được chuyển sang môi trường tái sinh
sau khi chúng đạt kích thước 2 - 3mm. Mức độ phản ứng
được đánh giá bằng tỷ lệ giữa số phôi tạo thành và số bao
phấn theo dõi, biểu diễn bằng %.

Kết quả thu được trình bày ở bảng 2, biểu đồ 2.

Ta thấy mức độ phản ứng của các cá thể trong cùng một
giống là rất khác nhau.



Bảng 2: Phản ứng cá thể của các con lai


Trong tổng số 11 cá thể được nghiên cứu ở giống LVN18 x
M82, 9 cá thể (81,8%) có tạo phôi trong môi trường nuôi
cấy phản ứng. Số cá thể phản ứng cao hơn 100% là 4,
chiếm 36,7%. Số cá thể không phản ứng là 2 cá thể chiếm
18,2%. Mức độ phản ứng trung bình của cả giống là 71,2%.
Đây là một mức độ phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn.
Như vậy, ta thấy tuy giống có phản ứng cao nhưng mức độ
phản ứng của các cá thể khác nhau là rất khác nhau. Biên
độ dao động của đặc tính này ở cặp lai LVN18 x M82 là rất
lớn từ 0 - 158%, trong đó có 2 cá thể hoàn toàn không có
phản ứng trong cùng một điều kiện nuôi cấy (xem bảng 2,
Biểu đồ 2). Sự khác nhau rất lớn trong phản ứng của các cá
thể cùng một giống được biểu diễn rất rõ trên đồ thị 3 ( ví
dụ của giống LVN18xM82).

Ở giống LVN4 x M82 cũng quan sát thấy hiện tượng tương
tự. Mức độ phản ứng ở các cá thể rất khác nhau. Cá thể số
5 và cá thể số 8 có phản ứng đến 122%, trong khi đó cá thể
số 2 lại không phản ứng. Thí nghiệm tiến hành với 11 cá
thể thì 10 cá thể (10 cờ) có phản ứng, chiếm 90,9%. 1 cá

thể không phản ứng chiếm 9,1%. Tỷ lệ phản ứng lớn hơn
100% quan sát thấy ở 4 cá thể chiếm 36,4%. 4 cá thể phản
ứng thấp (dưới 15%) chiếm 36,4%. Cá thể số 4 và số 10
phản ứng trung bình với tỷ lệ hơn 20 %. Mức độ phản ứng
trung bình của cả giống là 52,3%.

Biểu đồ 2: Phản ứng cá thể của các con lai.


Ở giống LVN 17 x M24 mức độ phản ứng của cá thể số 3
là cao nhất - 111,4% và thấp nhất là cá thể số 11 với mức
độ phản ứng là 9%. 100% các cá thể được nghiên cứu có
phản ứng. Trong đó 3 cá thể (27,27%) có mức độ phản ứng
dưới 15%, 7 cá thể (63,64%) có mức độ phản ứng từ 20 -
50%. Mức phản ứng chung của toàn giống là 35%.

Như vậy phản ứng của một giống trong nuôi cấy bao phấn
là kết quả trung bình giữa các yếu tố:

- Mức độ phản ứng của các cá thể riêng rẽ

- Tỷ lệ giữa số cá thể phản ứng và số cá thể không phản
ứng.

Số cá thể phản ứng càng cao thì phản ứng của giống càng
cao, phản ứng của các cá thể càng cao thì phản ứng của
giống cũng càng cao. Điều này có giá trị quan trọng khi
đánh giá phản ứng của giống trong nuôi cấy bao phấn. Do
số cá thể và mức độ phản ứng của các cá thể khác nhau,
phản ứng của giống cần được đánh giá trên cơ sở đánh giá

số lượng tương đối lớn cá thể. Số lượng bao phấn của mỗi
cá thể cũng phải đủ lớn mới đảm bảo đánh giá đúng tiềm
năng của giống. Điều này đặc biệt quan trọng đối với các
giống có phản ứng thấp, mà phần lớn các giống sản xuất
đều thuộc vào loại này.

Kết quả thí nghiệm này một lần nữa chứng minh rằng tính
di truyền của đặc tính phản ứng trong nuôi cấy bao phấn ở
ngô hoàn toàn được khẳng định. Điều đó có nghĩa rằng lai
hữu tính trong trường hợp này là một trong những biện
pháp quan trọng để nâng cao hiệu quả của nuôi cấy bao
phấn trong việc tạo các dòng thuần cho chọn giống. Như
vậy, bên cạnh việc cải tiến hiệu quả nuôi cấy bao phấn ngô
bằng các phương pháp cải tiến môi trường, cải tiến quy
trình nuôi cấy, một tiềm năng rất quan trọng để nâng cao
hiệu quả của phương pháp này là cải tiến bằng phương
pháp lai hữu tính. Phương pháp này nhanh chóng, rẻ tiền,
không tốn thời gian và công lao động có thể mang lại hiệu
quả ngay. Phương pháp này đặc biệt hữu hiệu đối với các
cơ sở tạo giống ngô không chuyên về nuôi cấy mô.

KẾT LUẬN

Trên cơ sở các kết quả trình bày trên đây, chúng ta có thể
rút ra các kết luận sau:

- Lai hữu tính các giống ngô Việt nam với các giống ngô
có phản ứng cao trong nuôi cấy bao phấn có thể làm tăng
đáng kể phản ứng của các giống ngô Việt nam. Có thể sử
dụng các con lai F1 để sản xuất dòng thuần thông qua nuôi

cấy bao phấn.

- Mức phản ứng của các con lai rất khác nhau. Một số cá
thể phản ứng tương đương mức phản ứng của dòng bố, một
số khác phản ứng tương đương mức phản ứng của dòng
mẹ, và các dòng khác có mức phản ứng nằm giữa bố và mẹ.

- Bên cạnh biện pháp tăng cường hiệu quả nuôi cấy bao
phấn bằng cải tiến quy trình, cải tiến môi trường, lai hữu
tính là một biện pháp rất hữu hiệu, có thể giúp cải thiện một
cách cơ bản hiệu quả của quy trình nuôi cấy bao phấn ngô.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Lê Huy Hàm, Đỗ Năng Vịnh, Trần Duy Quý (1999).
Một số nghiên cứu tạo dòng đồng hợp tử bằng nuôi cấy bao
phấn ngô. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà nội,
tr. 902 – 907.
2. Le Huy Ham, Do Nang Vinh, Tran Duy Quy, Bueter
B. (1998) Study on anther culturability of Vietnamese
maize germplasm. Proceeding of National Center for
Science and Technology of Vietnam, V.10, N2, p. 74-78.
3. Murigneux A, Bentollia S, Hardy T, Baud S, Guitton
C, Jullien H, Ben TS, Freyssinet G, Beckert. M (1994).
Genotypic variation of quantifative trait loci controlling in-
vitro androgenesis in maize. Genome 37: 970-976.
4. Buter, B. (1997). Einflussfaktoren der in vitro
Haploidproduction bei Zea mays. Ph.D Thesis No. 9725,
Swiss Federal Institute of Technology (ETH), Zurich,
Switzerland.

5. Beckert, M. (1994). Advantages and disadvantages of
the use of in vitro/in situ produced DH maize plants. In:
Bajai, Y.S.P (ed.) Biotechnology in Agritulture and
forestry. Springer-Verlag Berlin Heidelberg 25:201-213


SUMMARY

Hybridization approach for improvement of anther
culture efficiency in Maize


Genotype dependency in maize limits the application of the
method for breeding. Some maize genotypes have good
response in anther culture giving enough number of
embryos and regenerated plants. But most genotype show
poor or no response in anther culture. Genetics studies
revealed that at least 9 locus located in different
chromosomes have relation to response of genotype in
anther culture. In this study, attempts were made to
overcome genotype dependency in maize by crossing high
responsive lines with local Vietnamese genotypes to deliver
genes responsible for response in anther culture to local
genotypes.
Two high responsive in anther culture maize lines M82 and
M24 of temperate background were crossed with large
number of local genotypes. Five crossings were selected for
studies. Results showed that hybrids of all five crossings
have response in anther culture much higher then local
parents. This concerned both embryo production and plant

regeneration. In general response of hybrids in 7-12 time
more then local parents. Hybrids inherited good
characteristics of both parents: high response in anther
culture from M82 and M24 lines and good adaptation to
tropical climate conditions in Vietnam of local parents.

Further, response of individual hybrids was investigated. It
was revealed that although response of the hybrid lines was
improved very much, response of individuals within the
lines is very different from plant to plant varying from 0 to
158%. Thus response of a genotype must be accessed as
average response of all it’s individuals.

Thus, anther culture efficiency of economically important
genotypes can be improved by sexual crossing with high
responsive genotypes. F
1
hybrids of these lines can be used
for production of inbred lines through anther culture.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đỗ Năng Vịnh.