nghiên cứu cải tiến công nghệ nuôi cây phôi dừa sáp makapuno (cocos nucifera l.) giai đoạn phòng thí nghiệm và vườn ươm.

VIỆN NC DẦU VÀ CÂY CÓ DẦU






BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN CÔNG NGHỆ NUÔI CÂY PHÔI
DỪA SÁP MAKAPUNO (COCOS NUCIFERA L.)
GIAI ĐOẠN PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ VƯỜN ƯƠM


Cnđt : TRẦN THỊ NGỌC THẢO













8281

HÀ NỘI – 2010





1
TÓM TẮT
Bằng phương pháp nuôi cấy phôi hữu tính, cây dừa sáp nuôi cấy phôi có
thể cho tỷ lệ trái sáp đặc ruột ≥70%. Qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp gồm nhiều
giai đoạn, tuy nhiên, với qui trình nuôi cấy phôi dừa trước đây chỉ đạt tỉ lệ thành
công 19-20%, thời gian nuôi trồng khoảng 20 tháng. Nguyên nhân là do tỷ lệ
phôi phát triển thành cây trong ống nghiệm và sự thích nghi của cây con ở vườn
ươm còn thấp. Đề tài tập trung nghiên cứu các giải pháp kỹ thuật trong phòng
thí nghiệ
m và vườn ươm như thay đổi thành phần môi trường nuôi cấy, điều
kiện chiếu sáng, hàm lượng đường, chế độ bón phân để làm tăng tỷ lệ nảy
mầm, giúp phôi tăng trưởng tốt trong ống nghiệm thông qua việc cải thiện chồi,
rễ và làm tăng tỷ lệ sống của cây con ở vườn ươm.
Đề tài đã xây dựng được qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cải tiến ở giai
đ
oạn phòng thí nghiệm và vườn ươm, đạt tỷ lệ 37%, thời gian nuôi trồng 15-16
tháng và đã tạo ra được 200 cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở vườn ươm.

MỞ ĐẦU
Cơ sở pháp lý của đề tài
- Căn cứ vào Quyết định số 6363/QĐ-BCT của Bộ Trưởng Bộ Công Thương
ký ngày 02/12/2008 về việc đặt hàng thực hiện các nhiệm vụ khoa học và
công nghệ năm 2009 cho Viện nghiên cứu Dầu và Cây có dầu
- Căn cứ vào Hợp đồng Nghiên Cứu Khoa học và Phát Triển Công nghệ số:

193.RD/HĐ-KHCN ký ngày 16/03/2009 giữa Vụ Khoa Học và Công Nghệ,
Bộ Công Thương và Viện nghiên cứu Dầu và Cây có dầu về
việc thực hiện
nghiên cứu khoa học và phát triển công nghệ có tên: Nghiên cứu cải tiến qui
trình công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai
đoạn phòng thí nghiệm và vườn ươm.
- Căn cứ vào Hợp đồng giao khoán nội bộ số 08/HĐGK-VD ký ngày
07/04/2009 giữa Viện Trưởng Viện nghiên cứu Dầu và Cây có dầu với Chủ
nhiệm đề tài về việc giao khoán thực hiện nhiệm vụ Nghiên cứu Khoa học và
Phát triển công nghệ Cấp Bộ năm 2009 có tên: Nghiên cứu cải tiến qui trình
công nghệ nuôi cấy phôi dừa Sáp Makapuno (Cocos nucifera L.) giai đoạn
phòng thí nghiệm và vườn ươm.
Mục tiêu chung của đề tài:
Nâng cao tỷ lệ sống của cây dừa Sáp bằng phương pháp nuôi cấy phôi ở giai
đoạn phòng thí nghiệm đến vườn ươm. Dự kiến đạt 30- 35%.
Mục tiêu cụ thể:
- Xây dựng được qui trình nuôi cấy phôi dừa Sáp cả
i tiến ở giai đoạn
phòng thí nghiệm đạt tỷ lệ phôi nảy mầm và phát triển thành cây trong
phòng thí nghiệm dự kiến tăng 20-30% so với qui trình hiện có.

2
- Rút ngắn thời gian nuôi trồng trong phòng thí nghiệm.
- Nghiên cứu nâng cao tỉ lệ sống của cây dừa sáp nuôi cấy phôi ở giai đoạn
vườn ươm thông qua việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật, xác định nhiệt
độ, độ ẩm ở vườn ươm và lựa chọn tổ hợp phân bón phù hợp cho sự tăng
trưởng của cây dừa sáp nuôi cấy phôi.
- Xây dựng qui trình nuôi cấy phôi d
ừa Sáp cải tiến giai đoạn phòng thí
nghiệm và vườn ươm, đạt tỷ lệ 30-35%

- Đạt 200 cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở vườn ươm.
Đối tượng nghiên cứu: phôi dừa Sáp đặc ruột được thu thập từ huyện Cầu kè,
Tỉnh Trà Vinh.
Phạm vi: Đề tài được giới hạn ở việc nghiên cứu qui trình công nghệ nuôi cấy
phôi dừa Sáp từ giai đoạn phòng thí nghiệm đến vườn ươ
m.
Nội dung nghiên cứu: nghiên cứu cải tiến qui trình công nghệ nuôi cấy phôi
dừa Sáp giai đoạn trong phòng thí nghiệm và vườn ươm
- Nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy phôi dừa Sáp (giai đọan phòng thí
nghiệm): môi trường dinh dưỡng (nguồn carbon, nitơ, chất điều hòa sinh
trưởng ) và điều kiện ngoại cảnh (cường độ ánh sáng, phổ màu, cung cấp
ôxy, nhiệt độ) để tăng tỷ lệ nảy mầ
m và sống.
- Nghiên cứu lựa chọn điều kiện thích hợp cho sinh trưởng của cây non trong
giai đoạn chuyển tiếp phòng thí nghiệm ra vườn ươm nhằm nâng cao tỷ lệ
sống.
- Nghiên cứu nâng cao tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi giai đoạn đầu
thích nghi ở vườn ươm thông qua việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật.
- Nghiên cứu đi
ều kiện nuôi trồng cây dừa sáp nuôi cấy phôi ở vườn ươm
(giai đoạn thích nghi): nhiệt độ, độ ẩm
- Nghiên cứu một số tổ hợp phân bón cho cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở vườn
ươm (bao gồm: phân bón NPK, các chế phẩm sinh học, các chất điều hòa
tăng trưởng thực vật…).
- Xây dựng qui trình nuôi cấy phôi dừa sáp cải tiến giai đoạn phòng thí
nghiệm và vườn ươm

3
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Tình hình nuôi cấy phôi dừa ở nước ngoài

Việc nuôi cấy in vitro phôi dừa hợp tử (zygotic) đã được nhiều tác giả
nghiên cứu thành công từ những năm trước đây như De Guzman và Del Rosario
(1974), Assy Bar (1986), Rillo và Paloma (1992), Samosir và cộng sự (1999).
Các nghiên cứu này nhằm mục đích cứu lấy những phôi hữu tính phát triển bình
thường từ những quả dừa đột biến nhưng có giá trị cao như dừa Sáp (makapuno)
trong khi nội nhũ (c
ơm dừa) lại mềm, xốp và không có chức năng (Rillo và
Paloma, 1992) để từ đó tạo ra những cây giống cho tỷ lệ trái sáp cao. Ngoài ra
phương pháp này còn được áp dụng trong việc chọn lựa in vitro các tính trạng
cây trồng khác nhau và bảo quan gen dừa ở nhiệt độ thấp.
Từ nhiều năm nay, Mạng luới gen dừa quốc tế - Viện Quỹ gen thực vật
Quốc tế (COGENT-IPGRI) đã tài trợ vốn và thiết l
ập ngân hàng bảo tồn nguồn
gen dừa quốc ở nhiều nơi (ICG). Mạng lưới các điểm bảo tồn này, trong đó có
nhiều nơi đã đi vào hoạt động nằm trong 5 khu vực của COGENT là Đông Nam
Á, Nam Á, Nam Thái Bình Dương, Châu Phi, Ấn Độ Dương, Châu Mỹ La Tinh
và vùng Caribe. Mạng lưới ngân hàng gen dừa này sẽ là nơi lưu giữ phần lớn
nguồn gen dừa của thế giới và bảo vệ chúng cho việc s
ử dụng trong tương lai
của ngành công nghiệp dừa. Để hỗ trợ cho việc thành lập các ngân hàng bảo
tồn gen dừa, việc thu thập nguồn gen bằng phôi mầm riêng biệt hoặc những
miếng nội nhũ nhỏ có chứa phôi và di chuyển chúng như trong trường hợp nuôi
cấy phôi trong ống nghiệm (in vitro) đã trở thành một biện pháp mang tính thực
tế hơn nhiều trong công đoạn vận chuyển gen dừa v
ừa gọn nhẹ, dễ dàng, vừa an
toàn về mặt kiểm dịch thực vật.
Cho đến nay, kỹ thuật nuôi cấy phôi dừa tiêu chuẩn quốc tế đã được sử
dụng để lập ra bộ sưu tập nguồn gen dừa và sản xuất các cây giống chất lượng
cao từ những giống dừa đột biến như dừa Sáp (makapuno). Phương pháp này
được gọi là “Kỹ thuật nuôi cấ

y phôi mầm lai” (Batugal, 2002), được sử dụng để
sản xuất cây giống dừa ở những nơi phôi mầm được gửi đến sau các vụ trao đổi
quốc tế.
Nhiều khía cạnh về mặt sinh lý của cây con phát triển trong quá trình nuôi
cấy in vitro là chưa tối ưu và chính điều này được cho là nguyên nhân làm giảm
tỷ lệ thích nghi với điều kiện khí hậu bên ngoài và sự phát triển của cây con sau
khi đưa ra khỏi môi tr
ường nuôi cấy. Các đặc điểm sinh lý của cây con có khả
năng chịu ảnh hưởng bởi kỹ thuât, là sự phát triển của bộ rễ, khả năng quang
hợp và tính mẫn cảm với bệnh.
Những nghiên cứu gần đây của Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp Quốc
tế Úc (2008) với sự tham gia của một nhóm các nhà khoa học đến từ nhiều quốc
gia khác nhau (Úc, Indonesia, Papue Newguinea, Philippines và Việt Nam trong
một thời gian hơn 3 n
ăm. Một số cải tiến đáng kể của quy trình được sử dụng
cho việc vận chuyển gen dừa, tái thiết lập và sản xuất cây giống đột biến chất
lượng cao như dừa Sáp Makapuno.

4
1.2 Tình hình nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa ở trong nước
Ở Việt Nam, về nuôi cấy phôi dừa đã có các công trình từ 1993 ( Nguyễn
Hữu Hổ và cộng sự, 1993; Nguyễn Thị Hiền, 1996) nhưng chỉ thực hiện với các
giống dừa địa phương có tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên rất cao, chưa có nghiên
cứu nào thực hiện cho các giống dừa quý hiếm.
Viện nghiên cứu Dầu và cây có dầu đã nghiên cứu nuôi c
ấy phôi dừa từ
năm 1996 và đã nhận được trợ giúp tài chính từ Chính phủ Việt Nam, IPGRI-
COGENT, và gần đây thông qua Đại học Queensland (Australia) bởi một dự án
ACIAR.
Nhóm tác giả Vũ Thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo và cộng sự (Viện

nghiên cứu Dầu và cây có dầu) đã nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa trong điều kiện
in vitro từ năm 1999 trên 2 giống dừa là Ta xanh và Lùn vàng Mã Lai.
Từ năm 2000 đến 2001,
được sự tài trợ của IPGRI-COGENT, Nhóm tác
giả trên đã nghiên cứu nuôi cấy phôi dừa Sáp (Makapuno), dừa Ẻo trong điều
kiện in vitro.
Đến năm 2003-2004, nhóm tác giả trên tiếp tục nghiên cứu hoàn thiện,
nâng cao qui trình nuôi cấy phôi trong phòng thí nghiệm thông qua việc tìm môi
trường thích hợp cho nuôi cấy phôi dừa Sáp và dừa Dứa, nghiên cứu ảnh hưởng
của thời gian trữ lạnh đến khả năng nảy mầm của phôi dừa Sáp. Bên cạnh đó,
nhóm tác gi
ả còn nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể trồng, chế độ tưới, chế độ
ánh sáng, độ ẩm đến tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy phôi ở vườn ươm. Từ đó
cho thấy, việc tìm ra điều kiện nuôi trồng của vườn ươm giúp cây dừa cấy phôi
thích nghi với điều kiện ex-vitro là một vấn đề khó khăn nhưng lại rất thi
ết thực.
Song song đó, với sự tài trợ của Trường Đại học Queensland (Australia)
thông qua dự án ACIAR thực hiện từ năm 2003-2005, nhóm tác giả này đã
nghiên cứu sự ảnh hưởng của IBA và NAA đến sự tạo rễ của phôi dừa Dứa và
Xiêm, nghiên cứu ảnh hưởng của việc cắt dây treo (haustorium) của phôi trong
quá trình nuôi cấy để hạn chế tỷ lệ chết của cây dừa nuôi cấy phôi khi chuyển ra
vườ
n ươm.
Và thông qua dự án Phát triển sản xuất giống Dừa (giai đoạn 2001-2005)
của Bộ Công Nghiệp, nhóm tác giả Vũ Thị Mỹ Liên, Trần Thị Ngọc Thảo và
cộng sự đã nghiên cứu nuôi trồng 2 giống dừa quý là Sáp và Dứa, hiện nay đã
trồng ra đồng được khoảng 5ha.
Tuy nhiên, cho đến nay tỷ lệ thành công vẫn chưa cao. Từ phôi mới đưa
vào nuôi cấy cho đến khi cây trưởng thành để trồng ra
đồng là 19-20%.

1.3 Qui trình nuôi cấy phôi dừa hiện có của Viện
Từ năm 2001-2005 viện Nghiên Cứu Dầu và Cây Có Dầu đã bước đầu
thực hiện thành công việc nhân giống dừa sáp bằng cách nuôi cấy phôi dừa
trong điều kiện in vitro. Dưới đây là quy trình được mô tả lại :
Giai đoạn 1:
Chọn trái giống

5
Dừa sáp được lấy ở Cầu Kè Trà Vinh, chọn trái giống không bị hư,
khoảng 9 tháng tuổi. Ở giai đoạn này tỷ lệ trái được sử dụng để lấy phôi bị hao
hụt chỉ còn khoảng 80%.
Giai đoạn 2 :
Tách phôi và khử trùng. Cấy phôi và nuôi phôi
Phôi dừa sau khi được lấy ra cùng với lớp cơm dừa được khử trùng với
javen 100% trong 10-15 phút. Rửa phôi bằng nước vô trùng khoảng 4-5 lần.
Tách phôi
Cấy phôi đã được vô trùng vào các ống nghiệm có chứa 50 ml môi
trường chuẩn Y3 (chi tiết xem phụ lục)
Các ống nghiệm chứa phôi được mang đi nuôi cấy ở phòng sáng ở nhiệt
độ 28
0
C
±
2
0
C, ánh sáng là 4.000 lux, thời gian chiếu sáng 9h/ngày.
Cấy chuyền phôi hàng tháng (10 lần/10tháng).
Phôi dừa bắt đầu nảy mầm sau khoảng 3-4 tuần, khoảng 10-11 tháng hình
thành đầy đủ các bộ phận thân, lá, rễ. Trong khoảng thời gian này cần định kỳ
cấy chuyền mỗi tháng một lần nhằm thay thế môi trường cũ đã cạn kiệt dinh

dưỡng bằng môi trường mới giàu dinh dưỡng hơn, tạo điều kiện cho cây phát
triển khỏe m
ạnh và cân đối.
Cây trưởng thành trong ống nghiệm chuẩn bị chuyển ra vườn ươm là cây
phải đạt kích thước về chiều cao cây ≥ 15cm, đã có 3 lá mở hoàn toàn và đã có
rễ thứ cấp.
Kết thúc giai đoạn nuôi cấy phôi trong phòng thí nghiệm, tỷ lệ phôi sống
sót và phát triển thành cây là khoảng 40%.
Giai đoạn 3
: Giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm.
Cây trưởng thành trong ống nghiệm chuẩn bị chuyển ra vườn ươm nên
cần có một giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm. Các cây dừa con được
cấy vào môi trường Y3 có nồng độ đường 4,5% và được đặt vào điều kiện
phòng thí nghiệm có nhiệt độ 30
o
C, độ ẩm 60% và cường độ chiếu sáng 5.000
lux. Giai đoạn thích nghi trong phòng thí nghiệm được thực hiện khoảng 1-2
tháng.
Giai đoạn 4 :
làm cây thích nghi ở vườn ươm
Cây dừa trong phòng thí nghiệm được đem ra trồng trong các túi PE 15
có pha cát, xơ dừa, phân chuồng theo tỷ lệ (1:1:1). Nuôi trồng cây dừa trong
bịch PE khoảng 4 tháng. Cây sống sót từ giai đoạn này đạt 60-70%.
Giai đoạn 5
: Trồng ở vườn ươm
Sau khi trồng thích nghi ở vườn ươm, các cây con được chuyển sang giá
thể trồng khác là đất và được trồng trong túi PE 25
Cây sống sót ở giai đoạn này đạt 80-90%.
Cây con đạt tiêu chuẩn đưa ra vườn trồng là cây có chiều cao ≥ 40cm, cây
có ít nhất 5 lá xanh, chu vi gốc ≥ 10cm

6
Giai đoạn 6: Trồng ra đồng
Sau khi được trồng ở giai đoạn thích nghi cây dừa đã cứng cáp có khả
năng chống chịu cao, được đem trồng ra đồng, tăng lượng phân bón lên 1/3 so
với khuyến cáo trồng dừa.
Tỷ lệ sống giai đoạn này là khoảng 95% -100%.
Như vậy, sau quá trình nuôi cấy phôi khoảng 12-13 tháng, tỷ lệ phôi phát
triển thành cây xanh tốt ở vườn ươm đạt tiêu chuẩn trồng ra đồng là 19-20%.
Nguyên nhân dẫn đế
n tỷ lệ thành công thấp là do:
• Tỷ lệ phôi bị chìm hoàn toàn trong môi trường khi mới đưa vào nuôi cấy
chiếm 10-15%, các phôi này hầu hết không phát triển được và chết.
• Tỷ lệ phôi phát triển bất thường cao chiếm khoảng 10-30% (các phôi phát
triển bất thường là các phôi phát triển không có lá hay rễ, hay cây không
có lá mở)
• Tỉ lệ phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm đủ tiêu
chuẩn đưa ra vườn ươm thấp (khoảng 40%)
• H
ệ thống lá và rễ nghèo nàn (lá nhỏ, phát triển chậm, bộ rễ không có hoặc
có ít rễ thứ cấp)
• Khả năng thích nghi ở vườn ươm thấp (Tỷ lệ cây con sống sót ở vườn
ươm là khoảng 60-70%)
Như vậy vấn đề chính cần giải quyết trong đề tài này là phải định hướng
cho phôi phát triển ngay khi mới đưa vào nuôi cấy và cải tạo được hệ thống chồi
và rễ
để năng cao tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh có đầy đủ lá
rễ trong ống nghiệm. Ngoài ra, đề tài cải thiện tỷ lệ sống của cây dừa nuôi cấy
phôi ở giai đoạn vườn ươm.

7
Quy trình nuôi cấy phôi dừa sáp năm 2001-2005:

1. Chọn trái giống, cấy phôi
2. Cấy truyền mỗi tháng.
5. Trồng giai đoạn 2 ngoài
vườn ươm.
3. Cây dừa phát triển đầy đủ
lá, rễ trong ống nghiệm
4. Làm cây thích nghi và
trồng giai đoạn 1.
50ml Y3 với đường 4,5%, 2 tháng
Túi PE 15, cát-bụi dừa-phân chuồng
(1:1:1), 3-4 tháng
50 ml Y3 + đường 6% + IBA 2mg/l, ĐK : 26
±
2
0
C,
4000lux, 9h/ngày.10-11 tháng.
6. Trồng ra đồng, phân bón
tăng 1/3 so với giai đoạn
1.

50ml môi trường Y3 + IBA 2mg/l
ĐK : 28
±
2
0
C, 4000lux, 9h/ngày
Túi PE 30, giá thể: đất, 6 tháng.
100%
80-90%
60%-70%
40%
80%
Tỷ lệ đạt
được 19,2%
Chọn trái 9 tháng tuổi, không
sâu bệnh Tách phôi khử trùng
với javel 10 đến 15 phút.
10 lần

8
Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt trong phòng thí nghiệm có đủ điều kiện
để đưa ra vườn ươm là:
• Cây phát triển xanh tốt.
• Cây lá và rễ phát triển cân đối
• Cây đã có 3 lá mở và có rễ phụ
Cây dừa nuôi cấy phôi phát triển tốt trong vườn ươm đủ tiêu chuẩn để đưa ra
vườn trồng khi:
• Cây phát triển xanh tốt, không sâu bệnh.
• Cây đạt chiều cao ≥ 40cm
• Cây có 5-6 lá xanh

• Đường kính gốc ≥ 30mm
1.4 Sơ lược về đối tượng nghiên cứu: cây dừa Sáp (Cocos nucifera L.)
1.4.1 Vị trí phân loại
Giới: Plantae
Ngành : Magnoliophyta
Lớp : Liliopsida
Bộ : Arecales
Họ : Arecaceae
Chi : Coconuts(cocos)
Loài : Cocos nucifera
1.4.2 Đặc điểm hình thái của trái dừa sáp
Dừa sáp (Makapuno) là một giống dừa đột biến từ giống dừa cao Laguna, có
nguồn gốc từ Philippines. Dừa sáp còn gọi là dừa đặc ruột, dừa kem, thuộc
giố
ng dừa cao. Dừa sáp về bản chất có đặc điểm sinh học giống như những loại
dừa thường khác, chỉ có cơm dừa (nội nhũ) là đặc biệt khác.
Dựa vào độ đặc ruột của cơm dừa, dừa Sáp được chia thành 3 nhóm với kiểu
đặc ruột là kiểu A, B và C với độ đặc ruột tương ứng tăng dần, với kiểu A là
đặc ít, chỉ khoảng 1/3 bán kính trái d
ừa, và kiểu C là gần như không có nước.
dừa sáp có lớp cơm màu trắng rất dày (có khi choán hết cả phần ruột) giống như
sáp đèn cầy, chính giữa là chất lỏng sệt như nước cơm chắt. Không như cơm
dừa bình thường, nếu còn non thì mềm và ngọt, nếu già thì cứng cạy. Cơm dừa
sáp mềm và dẻo như bột quánh lại, béo và có mùi thơm đặc trưng. Nước dừa
sáp c
ũng vậy.
Thông thường một quày dừa sáp có 12 trái, chỉ có khoảng 3-4 trái có sáp,
thậm chí không có trái nào, tùy theo nhiều yếu tố.
1.4.3 Giá trị kinh tế của cây dừa sáp.

9
Dừa Sáp Makapuno có giá trị kinh tế cao, phục vụ cho các ngành du lịch,
chế biến thực phẩm…, giá thành của một trái dừa sáp cao gấp 20-30 lần một
trái dừa thường. Hiện nay, dừa sáp được mệnh danh là loại dừa mắc nhất Việt
Nam với giá dao động từ 100.000đ đến 120.000đ/trái. Đây là loại trái giải khát
độc đáo của Huyện Cầu Kè tỉnh Trà Vinh, không đâu có thể sánh được, kể cả
xứ s
ở nổi tiếng về dừa là Bến Tre. Tất cả các phần của cây dừa sáp từ thân, lá,
trái, vỏ, xơ, gáo, nước… đều có thể sử dụng phục vụ đời sống con người. Do
vậy, với giá thành hiện tại của trái dừa sáp cùng với hương vị thơm ngon của
trái dừa sáp đã phần nào giúp đỡ cho tiềm năng du lịch tại địa phương phát
triển. Bên cạnh đó cũ
ng giải quyết được công ăn việc làm, ổn định về đời sống
kinh tế cho người nông dân.
Hiện nay, Philippines là quốc gia hàng đầu về sản xuất cây dừa Sáp nuôi
cấy phôi, với 10 phòng thí nghiệm chuyên sản xuất giống dừa này nhưng vẫn
chưa đủ giống cung cấp cho nhu cầu sản xuất và giá cây dừa giống vẫn còn khá
cao, chỉ một số công ty tư nhân mới đủ khả năng đầu tư
trồng dừa Sáp và phải
đặt mua cây giống trước 1-2 năm.

Bảng 1.1: Giá cây dừa Sáp nuôi cấy phôi ở các nước khác

Năm Quốc gia Giá trái Sáp Giá cây dừa NCP
Philippines
30 Peso/trái
(~0,65USD/trái)
500 Peso/cây (~11 USD/cây)
2007
Indonesia 2-3 USD/trái 30 USD/cây

2008 Philippines 600 Peso/cây (~14 USD/cây)
2009 Philippines 600 Peso/cây (~14 USD/cây)
2010 Philippines
60 Peso/trái (~1,35
USD/trái)
900 Peso/cây (~21 USD/cây)

Mặc dù giá cây dừa giống cấy phôi khá cao, người dân khó có khả năng tiếp
cận, nhưng tiềm năng lợi nhuận rất lớn, vì cây dừa Sáp nuôi cấy phôi sau 3,5
năm trồng sẽ cho năng suất trái sáp là trên 70% nên chỉ cần sau 1 -2 đợt thu
hoạch là có thể thu hồi vốn đầu tư và có thể thu hoạch được 40-50 năm.

1.4.4 Phương pháp nhân giống dừa Sáp
Trồng dừa sáp theo phương pháp truyền thống: dùng trái không đặc của cây
d
ừa sáp để ươm làm giống sẽ cho tỷ lệ nảy mầm khoảng 60-70%. Tuy nhiên

10
những cây giống này sẽ cho tỷ lệ trái đặc ruột thấp giống như cây bố mẹ
(khoảng 25%).
Phương pháp nuôi cấy phôi in vitro: Những trái sáp đặc ruột không thể tự
nảy mầm do nội nhũ phát triển bất thường (cơm dừa mềm và xốp) và phôi của
trái sáp đặc ruột này chỉ nẩy mầm bằng phương pháp nuôi cấy phôi in vitro, lấy
phôi từ trái đặc ruột đem cấ
y vào môi trường dinh dưỡng thay thế cho nội nhũ
của dừa sáp, phôi dừa sáp nảy mầm và phát triển thành cây dừa giống có tỷ lệ
trái đặc ruột cao (≥70%, theo Rillo).
1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy phôi dừa in vitro
1.5.1 Mẫu phôi
Chọn mẫu phôi dừa để cấy là yếu tố hết sức quan trọng ảnh hưởng rất lớn

trong quá trình nuôi cấy cho đến lúc ra vườn ươm, phát triển thành cây, hoa và
trái. Do vậ
y, công tác chọn phôi phải thật nghiêm ngặt. Phải chọn phôi dừa sáp
từ những quả dừa sáp không quá non, không quá già, không bị thối nhũn. Trái
giống đều đặn, không dị dạng và sâu bệnh. Trái đủ độ chín, khoảng 10-11 tháng
tuổi.
1.5.2 Sự hóa nâu:
Dừa là loài thực vật giàu các hợp chất polyphenol (tanin hay các
hydroxyphenol). Sau khi phôi bị tổn thương trong quá trình cắt và khử trùng,
các hợp chất này bị oxid hóa bởi các oxydase chứa gốc đồng (Cu) như
polyphenoloxydase. Các hoạt động oxid hóa đượ
c tạo thành sẽ cản hoạt động
của các enzyme trong mô làm mô và môi trường nuôi cấy bị hóa nâu hay đen
trong vòng vài ngày sau đó, mô không thể tăng trưởng và sẽ chết. Các
polyphenol oxydase có thể tổng hợp mới hay hiện diện sẵn và phóng thích do
sự tác động của vết thương.
Có thể hạn chế sự hóa nâu bằng cách:
- Loại bỏ các hợp chế phenol (phenolic) sinh ra.
- Thay đổi thế oxid khử.
- Bất hoạt hóa các enzyme phenolase
-
Giảm hoạt tính phenolase
- Loại đài chất của phenolase.
Trong thực tế, phương pháp dễ nhất để cản sự hóa nâu của mô thực vật là
loại các hợp chất phenol sinh ra, có thể thực hiện bằng nhiều cách:
Mô cấy được chuyển thường xuyên trong 2-4 tuần lễ đầu. Sự cấy chuyền sẽ
dễ thực hiện hơn nếu mô cấy được đặt vào môi trường lỏng (nuôi cấ
y lắc).

11

Các phenolic có thể liên kết với các hợp chất được cho vào trong môi trường
nuôi cấy như than hoạt tính (0.5-5mg/l). Khi bị liên kết các phenolic sẽ không
cản sự tăng trưởng của mô thực vật.
1.5.3 Vai trò của các chất dinh dưỡng
Các nguyên tố đa lượng cũng như vi lượng đều có vai trò đối với thực vật
(hoạt hóa enzym). Thực vật chỉ cần một lượng nhỏ chất khoáng cho nhu cầu
sinh trưởng, phát triển của chúng. Tuy nhiên, s
ự thừa hay thiếu các nguyên tố
này cũng đều gây ra những rối loạn biến dưỡng, dẫn tới những triệu chứng bất
thường đặc trưng và có thể dễ dàng nhận ra khi theo dõi sự phát triển của
chúng.
Các khoáng đa lượng:
Nitơ ( N):

Nitơ là nguyên tố cần thiết tạo acid min, các loại protein, acid nucleic, diệp
lục tố, vitamin và enzym. Là thành phần bắt buộc của protein-chất đặc trưng
cho sự sống. Các hợp chất nitơ cung cấp năng lượng cho cơ thể, tham gia cấu
tạo ADP và ATP. Nitơ còn là thành phần của nhiều vitamin như : B1, B2, B6,
PP,… đóng vai trò là nhóm hoạt động của nhiều hệ enzym oxy hóa khử, trong
đó có sự tạo thành của Adenin.
Mô tế bào thực vật trong nuôi c
ấy có thể sử dụng nitơ ở hai dạng amonium
và nitrat, đồng thời có thể sử dụng các dạng nitrogen hữu cơ như acid amin. Tỷ
lệ nitơ dạng amonium và nitrat thích hợp tùy theo loại cây, bộ phận và trạng
thái phát triển của mô. Nồng độ NH
4
+
, NO
3
-

thay đổi từ 3-6 mM.
Nitơ còn có tác động nhiều mặt đến sự đồng hóa CO
2
. Khi thiếu Nitơ cường
độ đồng hóa CO
2
giảm, làm giảm cường độ quang hợp. Khi cung cấp nitơ làm
cây tổng hợp Auxin tăng lên.
Nếu mô cấy hấp thu nitơ vượt quá nhu cầu thì sẽ mềm mỏng. Tuy nhiên nếu
không cung cấp đủ lượng cấn thiết thì mô cấy sẽ bị cứng do thừa cenllulose và
ligin ở thành tế bào.
Khi thiếu nitơ thì thân mô cấy kém phát triển, mô có màu xanh nhạt, lá có
màu vàng, phiến lá mỏng, ảnh hưởng đến quang hợp.
Phospho (P):

Phospho có vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng, cần thiết cho sự phân
chia tế bào, sự phát triển của rễ. Phospho có liên quan đến sự tổng hợp đường,
tinh bột vì phospho là thành phần của các hợp chất cao năng tham gia vào các
quá trình phân giải hay tổng hợp các chất hữu cơ trong tế bào

12
Khi thiếu phospho lá cây có màu xanh đậm do sự thay đổi tỷ lệ diệp lục tố a
và b. Ở môi trường có pH thấp, nhiều sắt thì dễ bị thiếu phospho vì làm
phospho ít linh hoạt. Sự thiếu phospho thường đi theo sự thiếu nitơ và có triệu
chứng gần tương tự nhau vì phospho liên quan đến sự biến dưỡng nitơ.
Hai dạng muối phospho thường dùng nhất là NaH
3
PO
4
.7H

2
O và KH
2
PO
4
.
Nồng độ phospho trong môi trường biến thiên từ 0.15- 4mM, thường dùng 1
mM.
Kali (K):

Kali làm tăng quá trình quang hợp và thúc đẩy sự vận chuyển glucid từ phiến
lá vào các cơ quan. Kali còn tác động rõ rệt đến trao đổi protid, lipid, đến quá
trình hình thành các vitamin.
Kali rất dễ xâm nhập vào tế bào, làm tăng tính thẩm thấu của thành tế bào
đối với các chất khác, tăng quá trình thủy hóa, giảm độ nhớt, tăng hàm lượng
nước liên kết. Kali ảnh hưởng đến các quá trình sinh tổng hợp các sắc tố trong
lá, ảnh hưởng tích cực quá trình đẻ nhánh, hình thành bông và chất l
ượng hạt
của các hạt ngũ cốc.
Người ta cung cấp Kali cho mô nuôi cấy dưới dạng KNO
3
, KCl, KH
2
PO
4
.
Nồng độ Kali trong môi trường biến thiên từ 2-25 mM, trung bình khoảng 10
mM.
Canxi (Ca):

Canxi là thành phần muối pectate của tế bào (pectate calcium) có ảnh hưởng
trên tính thấm của màng. Canxi cần cho sự thâm nhập của NH
4
+
và NO
3
-
vào rễ.
Canxi là ion kém linh động nên màng tế bào thực vật hấp thu dễ dàng.
Canxi được cung cấp dưới dạng muối Ca(NO
3
)
2
.4H
2
O, CaCl
2
.6H
2
O hoặc
CaCl
2
.2H
2
O. Nồng độ Ca
2+
trong môi trường nuôi cấy từ 1-3.5 mM, trung bình
là 2mM.
Magie (Mg):

Magie là thành phần cấu trúc của diệp lục tố, có tác dụng sâu sắc và nhiều
mặt đến quá trình quang hợp, phụ trợ cho nhiều enzym, đặc biệt là ATPase liên
quan trong biến dưỡng carbohydrat, sự tổng hợp acid nucleic, sự bắt cặp của
ATP với các chất phản ứng
Khi thiếu magie lá bị vàng, quang hợp kém dẫn đến năng suất giảm. Sử dụng
magie dưới dạng MgSO
4
.7H
2
O, MgO, nồng độ 0.5-3 mM
Lưu huỳnh (S):
Giữ vai trò đệm trong tế bào (trao đổi anion với các tế bào).

13
Lưu huỳnh là thành phần cấu trúc của cystein, methionin, tạo cầu nối
disulfur tạo cấu trúc bậc ba của protein.
Lưu huỳnh còn là thành phần của một vài enzym. Thiếu lưu huỳnh thì sự
sinh tổng hợp protein giảm, cây bị hoàng hóa do không tổng hợp được diệp lục
tố, lá có màu lục nhạt, thỉnh thoảng có một phần lá bị đỏ, thường xuất hiện ở lá
non cây chậm lớn, năng suất phẩ
m chất giảm. Lưu huỳnh thường được sử dụng
ở dạng MgSO
4
.7H
2
O, FeSO
4
, (NH
4
)

2
SO
4
Các khoáng vi lượng
Kẽm (Zn):

Tham gia trong quá trình tổng hợp auxin, vì kẽm có liên quan đến hàm lượng
tryptophan, amino acid tiền thân của quá trình sinh tổng hợp NAA.
Kẽm có tác dụng đến nhóm GA3, có liên quan đến sinh tổng hợp vitamin
nhóm B1, B2, B6, B12. Ngoài ra còn ảnh hưởng tốt đến độ bền của diệp lục tố,
tác dụng tốt đến tổng hợp carotenoid. Kẽm còn vận chuyển các sản phẩm quang
hợp từ lá xuống các cơ quan dự trữ, tăng khả năng giữ nước, độ ng
ậm nước của
mô do làm tăng quá trình tổng hợp các cao phân tử ưa nước như protein, nucleic
acid.
Khi thiếu kẽm thì cường độ tổng hợp tryptophan từ indol và serine bị kiềm
hãm nên rễ không tạo được hoặc kém phát triển, lá bị bạc màu, sắc tố bị hủy
hoại, lá kém phát triển, hình dạng lá không bình thường, lóng ngắn,…Thường
sử dụng kẽm ở dạng ZnSO
4
.7H
2
O.
Sắt (Fe):

Những môi trường cổ điển thường dùng sắt dưới dạng clorua sắt FeCl2,
FeCl
3
.6H
2

O, FeSO
4
.7H
2
O, Fe(SO
4
)
3
….Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm
đều dùng sắt dưới dạng chelat kết hợp với Disodium Ethylen diamin tetra-acetat
(Na
2
-EDTA). Ở dạng này sắt hầu như không bị tủa và giải phóng dần dần ra
ngoài môi trường theo nhu cầu của mô thực vật.
Đồng (Cu):

Là thành phần cấu trúc của nhiều enzym xúc tác các phản ứng oxi hóa khử,
can thiệp vào các phản ứng oxi hóa cần oxi phân tử.
Thiếu đồng lá kém phát triển, có màu xanh đậm. Nếu thiếu nhiều dẫn đến
chết một phần của lá Thường được sử dụng ở dạng CuSO
4
.5H
2
O.
Mangan (Mn):

Ảnh hưởng của Mn đối với cây trồng khá giống sắt, ngoại trừ bệnh vàng lá
không xuất hiện ở lá non như trong trường hợp của sắt. Có một vài dấu hiệu cho

14

thấy có sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa các lượng khác nhau sắt và mangan và cần
phải phòng ngừa trước để để chắc chắn rằng sự cân đối giữa mangan và sắt là
không đổi trong giới hạn phát triển tốt nhất của cây trồng.
Bor (B)

Bor liên quan trong sự tổng hợp các acid nucleic, các phản ứng hormon và
các chức năng của màng, trong sự cận chuyển carbohydrat, và trong sự dùng
calcium cho sự thành lập vách.
Thiếu Bor, sự phân chia tế bào bị cản, sự hoại mô đen xảy ra ở lá non (chủ
yếu ở gốc lá) và rễ phù to, cây có thể mất ưu tính ngọn.
Molypden (Mo)

Mo là thành phần của nitrat reductase.
Thiếu Mo, có sự hoàng hóa và hoại mô ở các lá già.
Nguồn Carbon:
Trong nuôi cấy in vitro, nguồn carbon để mô, tế bào thực vật tổng hợp nên
các chất hữu cơ giúp tế bào phân chia, tăng sinh khối không phải do quá trình
quang hợp cung cấp mà do đường trong môi trường. Đường được sử dụng như
nguồn carbon cung cấp năng lượng chủ yếu trong nuôi cấy phôi.
Hai dạng đường thường được sử dụng nhất là saccharose và glucose nh
ưng
hiện nay saccharose được dùng phổ biến hơn vì 2 nguyên nhân chính:
− Sử dụng đường saccharose kinh tế hơn đặc biệt là khi ứng dụng vào
sản xuất vì giá thành đường saccharose thấp hơn.
− Đường saccharose là một disaccharit được cấu tạo từ 2 đường đơn là α-
D-glucose và β-D-fructose. Trong quá trình hấp vô trùng môi trường
với autoclave ở 121
o
C, 1atm, saccharose bị tách thành 2 loại đường
đơn như trên và mô thực vật có thể hấp thu được cả hai loại đường đơn

này, đối với một số mô đặc biệt thì sự hấp thu đường fructose hiệu quả
hơn glucose, ngay cả đường saccharose mô thực vật vẫn có thể hấp thu
được nhờ các enzyme và các chất chuyên chở đặc biệt qua màng.
Trong thí nghiệm nuôi cấy phôi dừa, không sử dụng đường vàng vì trong
đường vàng có nhiều tạp chấ
t, có thể là những yếu tố không kiểm soát được
trong quá trình làm thí nghiệm.
Ngoài ra, đường còn tác động như chất tạo ra áp suất thẩm thấu. Tùy từng
giai đoạn phát triển phôi khác nhau, nhu cầu về đường và áp suất thẩm thấu
khác nhau (từ 0.1 đến 12%).

15
Các Vitamin:
Các vitamin thường được pha hỗn hợp trong dung dịch mẹ có nồng độ cao
gấp 500 hoặc 1000 lần dung dịch làm việc. Các dung dịch vitamin rất dễ hỏng
do nấm khuẩn nhiễm tạp, vì vậy cần giữ trong điều kiện lạnh dưới 0
o
C.
Vai trò từng loại vitamin:
- Thyamin hydrocloric (B1): dạng tinh bột kết tinh trắng, hút ẩm, rất không
bền vững. Chứa lưu huỳnh, được tổng hợp trong lá hay chồi non. Các mô
nuôi cấy không tổng hợp được vitamin B1 do vậy cần bổ sung vào môi
trường nuôi cấy. Vitamin B1 thiết yếu trong sự biến dưỡng tế bào.
- Vitamin PP được tìm thấy trong NAD hay NADP, các coenzym thiết yếu
trong sự vận chuyển điện tử.
- Prydoxine HCl (B6) :dưới d
ạng phosphoryl hóa, là nhóm hoạt động của
transaminase
- Myo-inositol : là một đồng phân của inositol, chất liên quan trong sự
truyền dấu hiệu hormon và liên kết với auxin. Nó thường được dùng với

nồng độ khá cao nên thường đặt ngoài nhóm vitamin.
- Ca-D pantothenate: chất bột trắng, tan trong nước, là dạng phổ biến nhất
của vitamin B3
- Biotin cần trong vài sự carboxyl hóa
Chất điều hoà tăng trưởng thực vật.
Chất điều hoà sinh trưởng th
ực vật (hormone thực vật) là những hợp chất
hữu cơ do tế bào tạo ra tại một nơi nào đó trong cơ thể thực vật và được chuyển
tới một nơi khác. Ở đó, với nồng độ rất thấp gây ra một phản ứng sinh lý.
- Ở nồng độ thấp làm biến đổi các hoạt động sinh lý (kích thích, điều hoà
hay cản) các quá trình sinh lý của thực vật.
- Ở nồng độ cao chúng trở thành chất độc cho thực vật (đặc biệt là với con
người).
- Chất điều hoà sinh trưởng nội sinh ít bền và dễ kiểm soát hơn so với các
chất điều hoà ngoại sinh. Do vậy trong thực tế các chất điều hoà tổng hợp
được sử dụng rất phổ biến.
Chất điều hoà sinh trưởng thực vật đượ
c phân làm 5 nhóm chính là: Auxin,
Cytokinin, Gibberilin, Acid Abscisic và Ethylen. Mỗi chất có những tác dụng
sinh lý khác nhau trên quá trình sinh trưởng của thực vật tự nhiên và thực vật
trong nhân giống in-vitro.

16
Auxin:
Auxin là hormon đầu tiên trong cây được phát hiện vào năm 1934, là một
hợp chất tương đối đơn giản: indol 3 acetic acid (IAA). Auxin được tổng hợp
trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn, lóng) và lá non (tức nơi có sự phân
chia tế bào nhanh) từ tryptophan được tổng hợp trong lá trưởng thành dưới ánh
sáng. Sau đó auxin được di chuyển đến rễ và tích tụ trong rễ.
Auxin chủ yếu của thực vật là indole-3-acetic acid (IAA), ngoài ra còn có

các dẫn xuất của nhân indole như indole-3-butyric (IBA), α-naphtalen acetic
acid (NAA), 2,4 dichlorophenoxy acetic acid (2,4-D)
Tác dụng sinh lý của Auxin:
- Sự kéo dài và phân chia tế bào: do auxin có tác dụng kích thích mạnh lên sự
kéo dài chiều ngang của tế bào, làm cho tế bào phình to lên. Sự kéo dài của
các tế bào gây lên sự tăng trưởng của cơ quan và toàn cây.
- Kích thích sự tăng trưởng chồi non.
- Sự tạo rễ, đặc biệt là sự hình thành rễ bất định.
- Sự cử động của thực vật như địa hướng động ở rễ và quang hướng độ
ng ở
các bộ phận khí sinh của thực vật.
- Ngoài ra, auxin còn có vai trò điều chỉnh nhiều quá trình khác như quá trình
trao đổi chất, các hoạt động sinh lý, sự vận động trong cây…
Gibberellin
Gillerellin là nhóm hormon thứ hai được phát hiện vào năm 1955-1956. Đó
chính là axit gibberellic (GA3). Gibberellin cũng được xem là một hormon
quan trọng của thế giới thực vật.
Ngày nay, người ta đã phát hiện ra rễ trên 60 loại gibberellin trong cây và kỳ
diệu là GA1,GA2, GA3, GA60 , trong đó GA3 có hoạt tính hóa học mạnh
nhấ
t. GA3 được sản xuất bằng con đường lên men và chiết xuất sản phẩm từ
dịch nuôi cây nấm.
Gibberellin được tổng hợp chủ yếu trong lá non, một số cơ quan non đang
sinh trưởng như phôi hạt đang nảy mầm, quả non, rễ non sự vận chuyển nó
trong cây theo hệ thống mạch dẫn và không phân cực như auxin. GA trong cây
cũng có thể ở dạng tự do hoặc ở dạng liên kết vớ
i hợp chất khác
Vai trò của GA3 :
- Hiệu quả rõ rệt nhất của GA là kích thích mạnh mẽ sự sinh trưởng về chiều
cao của thân, chiều cao của cành, của rễ, sự kéo dài của lóng cây hòa thảo.

Hiệu quả này có được là do ảnh hưởng kích thích đặc trưng của GA lên sự

17
dãn theo chiều dọc của tế bào, GA kiểm soát hướng đặt các vi sợi cenllulose
mới được tổng hợp trong các tế bào.
- Sự kéo dài lóng và tăng trưởng lá : kích thích kéo dài lóng là đặc điểm nổi
bật của GA. Hoạt động này vừa do sự phân chia tế bào thân. GA kích thích
mạnh sự phân chia tế bào mô vỏ và biểu bì. GA liều cao ( hay phối hợp với
cytokinin) kích thích sự tăng trưởng lá (diện tích có thể gấp đôi bình
thường).
- Sự
phát triển chồi cây và nảy mầm của hạt.
- GA làm chậm hiện tượng ngủ của chồi do ngày ngắn cảm ứng (mùa thu), và
gỡ sự ngủ của các chồi cây gỗ.
- Trong phần lớn các trường hợp, GA có hoạt động bổ sung cho auxin. Thông
thường, GA làm tăng hàm lượng auxin trong các mô mà nó kích thích. Tuy
nhiên, hai chất này có hoạt động độc lập .
Cytokinin:
Cytokinin là hormon thứ ba được phát hiện năm 1963. khi nuôi cấy mô thực
vật, người ta phát hi
ện ra một nhóm chất hoạt hóa sự phân chia tế bào mà thiếu
chúng thì sự nuôi cây mô không thành công, đó là 6-furfurilaminopurin, tức
kinetin. Kinetin chỉ hoạt động khi có auxin hiện diện, không có auxin sự phân
chia tế bào do cytokinin không xảy ra. Ngược lại, không có cytokinin thì auxin
tạo thành các tế bào khổng lồ (không có sự phân vách). Kinetin không có trong
thiên nhiên. Cytokinin tự nhiên chủ yếu là zeatin. Các cytokinin tổng hợp được
sử dụng khá rộng rãi trong nuôi cấy mô tế bào là kinetin và benzyl adenine
(BA).
Cơ quan tổng hợp cytokinin là hệ thống rễ, từ rễ cytokinin được vận chuyể
n

lên các bộ phận trên mặt đất theo hướng ngược chiều auxin nhưng không có
tính phân cực rõ rệt như auxin. Ngoài rễ ra, một số cơ quan non đang sinh
trưởng cũng có khả năng tổng hợp một lượng nhỏ bổ sung thêm cho nguồn
cytokinin của rễ.
Vai trò của cytokinin:
- Hoạt động trong sự tăng trưởng tế bào : Cytokinin kích thích sự phân chia tế
bào với điều kiện có auxin. Cytokinin tác động trên cả hai bước củ
a sự phân
chia tế bào là phần nhân và phân bào. Cytokinin giúp sự gia tăng kích thích
tế bào và sinh tổng hợp protein. Trong thân và rễ cytokinin cản sự kéo dài tế
bào, nhưng kích thích sự tăng rộng tế bào ( sự tăng trưởng củ). Cytokinin
cũng kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành (auxin không
có tác dụng này).

18
- Hoạt động trong sự tạo cơ quan: tùy theo tỷ lệ auxin/cytokinin (A/C) trong
môi trường nuôi cấy.
 Auxin/cytokinin cao kích thích sự tạo rễ
 Auxin/cytokinin thấp kích thích sự tạo chồi
- Như vậy, cytokinin hỗ trợ auxin trong sự tăng trưởng nhưng đồng thời cũng
có sự đối kháng giữa auxin (giúp sự tạo rễ) và cytokinin (giúp sự tạo chồi),
sự cân bằng hai loại hormon này là một trong những yếu tố ki
ểm soát sự
phát triển.
- Hoạt động của cytokinin trong sự trưởng thành của diệp lạp : trong tối cây
mầm bị hoàng hóa, nếu lá hoàng hóa được xử lý cytokinin trước sự chiếu
sáng, diệp lục tố và các enzym quang hợp sẽ được tổng hợp mạnh hơn khi lá
được chiếu sáng (sự kích thích không xảy ra trong tối).
Ethylene
Là một loại hormone ở thể khí (CH2=CH2), có nguồn gốc từ các vùng có

nồng độ auxin cao. Nó hoạt hoá sự chín
đồng thời kích thích sự phát triển về
phía bên của các tế bào kéo dài.
Acid abscisic:
Là một loại hormone làm chậm sự sinh trưởng, duy trì trạng thái ngủ, có
nguồn gốc từ các tế bào chịu stress.
1.5.4 Tác động của các điều kiện môi trường
Ánh sáng
Ánh sáng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo hình cây in vitro, nó tác
động đến các quá trình quang hợp và hô hấp của cây. Ánh sáng còn góp phần
vào việc tạo rễ và chồi bất định của các phôi.
Khi thiếu ánh sáng cây sẽ bị hoàng hoá do lá thi
ếu diệp lục tố vì quang hợp
không xảy ra dẫn đến hậu quả là cây sẽ giảm trọng lượng, việc phân hoá mô và
tạo rễ sẽ giảm.
Mặt khác, khi cường độ ánh sáng yếu thì cường độ quang hợp cũng kém hơn
cường độ hô hấp làm tăng hàm lượng CO
2
gây độc cho cây.
Khi ánh sáng quá nhiều, cường độ ánh sáng tăng cao sẽ làm tăng sự thoát
hơi nước, làm cho môi trường nuôi cấy khô do thiếu nước ảnh hưởng tới sự
phát triển của mô cấy.
Ánh sáng trong phòng cấy mô có cường độ thay đổi trong khoảng 3000-
5.000lux thời gian chiếu sáng từ 8-10 giờ /ngày.

19
Khi chuẩn bị đưa cây ra vườn ươm thì cường độ ánh sáng tăng lên khoảng từ
3.000- 5.000 lux
Phản ứng của cây đối với quang hợp và phát sinh hình thái khi ánh sáng có
bước sóng 400 và 680nm do diệp lục tố a và b có hai cực đại hấp thu, một ở

vùng xanh lam (400-460nm), một ở vùng đỏ (620-680nm) và hầu như không
hấp thu ánh sáng ở giữa hai cực đại này (tức trong vùng lục và vàng).
Chất lượng ánh sáng quyết định đến khả năng phát sinh hình thái của cây in
vitro. Chấ
t liệu bình nuôi cấy cho phép sự vận chuyển ánh sáng qua bình. Ví
dụ: chất liệu là thủy tinh, nhựa, polycarbonate, cho phép cản ánh sáng có bước
sóng 390, 300, 290nm. Như vậy, ánh sáng mà cây in vitro thu nhận được phụ
thuộc vào bước sóng ánh sáng và chất liệu bình nuôi cấy.
Nhiệt độ
Nhiệt độ có tác động trên sự tăng trưởng do tác động trên sự quang hợp, các
phản ứng biến dưỡng, sự hấp vận chuyển nước và các chất khoáng.
Ánh sáng là nguồn gốc tạ
o nên năng lượng và chuyển thành nhiệt năng, 25%
năng lượng được sử dụng trong quang hợp. Ánh sáng làm cho bình nuôi cấy
tăng nhiệt độ, và chênh lệch cao nhiệt độ ngoài bình từ 0,5 đến 1
o
C trong suốt
quá trình quang hợp.
Độ ẩm
Độ ẩm trong nuôi cấy in vitro cần độ ẩm tương đối khoảng 95% do độ ẩm
ảnh hưởng tới hình thái, cấu trúc và sinh lý của mô cấy. Độ ẩm giúp tạo áp suất
thuỷ tĩnh, giảm bớt nhiệt độ dao động trong bình cấy, giúp vận chuyển các chất
trong cơ thể thực vât…
Khi độ ẩm trong bình cấy mô quá cao sẽ gây ra sự bão hoà hơi nước trong
bình cấ
y mô làm cho lớp cutin mỏng, hiện tượng thuỷ tinh thể xảy ra dẫn đến sự
giảm năng suất khi đưa cây ra môi trường ngoài.
Độ pH
Độ pH phù hợp trong nuôi cấy phôi dừa sáp trong khoảng từ 5,8-6. Trong
môi trường nuôi cấy nếu pH chưa phù hợp thì nó có xu hướng dịch chuyển về

pH phù hợp để mô có thể phát triển được.
1.6 Giai đoạn thích nghi:
Để thích nghi cây dừa nuôi cấy phôi, cây con cần có tỷ lệ thích hợp giữa
chồi và r
ễ. Nếu cây con đã được tạo rễ in vitro, khi trồng vào hỗn hợp đất (chứa
trong túi PE) cần được duy trì trong các điều kiện che sáng một phần và độ ẩm
tương đối cao trong vài ngày. Cây thích nghi nhờ sự giảm dần độ ẩm tương đối

20
trong khí quyển. Điều này được thực hiện đơn giản bằng cách trùm cây con với với
túi PE trong suốt trong vài ngày sau đó mở dần túi PE ra.
Cây con ra rễ in vitro có thể làm cho cứng cáp hơn bằng cách để cây con
trong ống nghệm thêm 1-2 tuần trước khi cho ra hỗn hợp đất.
Xử lý cây con mới được chuyển ra đất với các chất chống nấm giúp làm tăng
đáng kể sự sống còn của các cây con.
Sự tự dưỡng của cây con:
Quang hợp và sự tạo lớp sáp cutin trên lá có ảnh hưởng trên sự sống còn của
cây con từ sự nuôi cấy in vitro.
Cây con tăng tưởng in vitro trên môi trường giàu carbihydrate nói chung chỉ
sản xuất một phần rất ít nhu cầu carbohydrate từ sự cố định CO
2
trong quang hợp.
Khi các cây con này được chuyển vào điều kiện in vivo, chúng phải trở nên hoàn
toàn tự dưỡng, quang hợp gia tăng. Tuy nhiên trong thời gian đầu (trong vòng
khoảng 1-2 tuần) chúng vẫn còn phóng thích nhiều CO
2
hơn là hấp thu cho quang
hợp. Hô hấp tối của các cây này cũng cao hơn hô hấp tối của các cây con cùng
tuổi, cho thấy rằng các cây con mới được chuyển dùng nhiều năng lượng để thích
ứng với môi trường mới. Do đó sự sống còn của các cây con mới được chuyển ra

vườn ươm lệ thuộc mạnh vào nguồn tinh bột được tích lũy trong sự nuôi cây in
vitro.
Sự cân bằng nước của cây con:
Các cây con t
ừ sự nuôi cây in vitro có lớp sáp cutin trên bề mặt lá mỏng hơn
nhiều so với các cây tương tự được trồng trong nhà kính hay ngoài đồng. Sự giảm
lớp sáp cutin này làm cây con in vitro mất nước nhanh hơn cây bình thường và do
đó gây bất lợi cho cây in vitro khi mới chuyển ra vườn ươm. Độ ẩm cao trong các
bình nuôi cây được xem là nguyên nhân chính làm giảm lớp sáp cutin. Ánh sáng
thấp cũng góp phần trong sự giảm này. Một lý do khác của sự mất nước là hoạt
động không hiệ
u quả của các khí khẩu.

21
CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM
2.1 Vật liệu nghiên cứu:
Phôi dừa nuôi cấy:
Phôi quả dừa sáp (Makapuno) được thu thập từ huyện Cầu Kè tỉnh Trà Vinh.
Môi trường nuôi cấy:
Môi trường Y3 (Eeuswen, 1976), (chi tiết xem phụ lục)
Môi trường được khử trùng với autoclave ở nhiệt độ 121
o
C, áp suất 1atm
trong thời gian từ 20-25 phút.
pH: 5,5-6
2.2 Phương pháp nghiên cứu:
Chọn mẫu cấy:
Phải chọn phôi dừa sáp từ những trái dừa sáp không quá non, không quá
già, trái đủ độ chín, khoảng 10-11 tháng tuổi. Cuốn trái không bị thối nhũn.
Trái giống đều đặn, không dị dạng và sâu bệnh.

Khử trùng mẫu cấy
- Dừa sáp sau khi được mang về được lột bỏ lớp vỏ bên ngoài, bổ đôi quả
dừa.
-
Phôi được tách ra bằng dụng cụ lấy phôi.
- Phôi dừa sau khi được lấy ra cùng với lớp cơm dừa mang đi rửa sạch,
ngâm trong xà phòng loãng khoảng 3-5 phút, rửa sạch lại dưới vòi nước
chảy.
Các bước khử trùng phôi dừa sáp trong tủ cấy vô trùng :
- Ngâm phôi dừa sáp trong cồn 96
0
trong vòng 1-2 phút.
- Ngâm trong javen 100% trong 10-15 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng khoảng 4-5 lần .
- Dùng dao cấy tách lấy phôi ra khỏi lớp cơm dừa.
- Ngâm phôi đã được tách vào javen 10% trong vòng 1-2 phút.
- Tiếp tục rửa lại phôi 3 lần bằng nước cất vô trùng.
- Phôi đã sẵn sàng cho các thí nghiệm nuôi cấy.
2.2.1 Nghiên cứu cải tiến môi trường nuôi cấy phôi dừa Sáp giai đoạn
phòng thí nghiệm: nguồn carbon, nitơ, các chất
điều hòa tăng
trưởng thực vật để tăng tỷ lệ nảy mầm và sống của phôi dừa Sáp
Mục đích thí nghiệm: Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy phôi để làm
tăng tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây hoàn chỉnh trong phòng thí
nghiệm, giúp phôi phát triển nhanh, cải thiện hệ thống chồi và rễ.

22
2.2.1.1- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng nitơ (N) trong môi
trường nuôi cấy:
Mục đích thí nghiệm: Nhằm lựa chọn ra môi trường có hàm lượng N phù

hợp cho sự phát triển của phôi dừa Sáp, giúp phôi phát triển tốt trong ống
nghiệm
Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiệm thức được bố trí theo khối đầy đủ
hoàn toàn ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần với số lượng 10 phôi/nghiệm
thứ
c.

Bảng 2.1: Công thức thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm
lượng nitơ (N) trong môi trường nuôi cấy phôi dừa Sáp
ST
T
Nghiệm thức Công thức
1 N0 Môi trường Y3 căn bản
2 N1 Môi trường Y3 có hàm lượng N tổng tăng thêm
1/3
3 N2 Môi trường Y3 có hàm lượng N tổng tăng thêm
1/2
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ nảy mầm, tỉ lệ sống, chiều cao cây, chiều
dài rễ, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá, trọng lượng tươi.
- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy. Thí nghiệm được theo dõi
trong 3 tháng
Môi trường được chọn (N
x
) được dùng làm nguyên liệu cho thí nghiệm
tiếp theo về sự ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực vật đến
phôi nuôi cấy
2.2.1.2- Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều hòa tăng trưởng thực
vật đến sự nảy mầm và tăng trưởng của phôi dừa Sáp:
Mục đích thí nghiệm: Nhằm lựa chọn ra môi trường có bổ sung chất điề
u

hòa tăng trưởng thực vật thích hợp cho phôi dừa Sáp, giúp phôi phát triển
thành cây hoàn chỉnh trong ống nghiệm, phôi phát triển nhanh, chồi và rễ
khỏe.
Thí nghiệm một yếu tố gồm 4 nghiệm thức được bố trí theo khối đầy đủ
hoàn toàn ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần với 10 phôi/nghiệm thức.

23
Bảng 2.2: Công thức thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của chất điều
hòa tăng trưởng thực vật đến sự nảy mầm và tăng trưởng của phôi
dừa Sáp
ST
T
Nghiệm thức Công thức
1 ST1 Môi trường N
x
+ IBA 2mg/L
2 ST2 Môi trường N
x
+ IBA 2mg/L + NAA 1mg/L
3 ST3 Môi trường N
x
+ IBA 2mg/L + GA 7mg/L
4 ST4 Môi trường N
x
+ IBA 2mg/L + BA 5mg/L
- Chỉ tiêu theo dõi: Tỉ lệ nảy mầm, tỉ lệ sống, chiều cao cây, chiều
dài rễ, số lá, chiều dài lá, chiều rộng lá.
- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy. Thí nghiệm được theo dõi
trong 3 tháng
2.2.1.3- Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường (nguồn

Carbon) trong môi trường nuôi cấy giai đoạn cây dừa con đã có lá: 3
nghiệm thức
Mục đích thí nghiệm: Nhằm lựa chọn n
ồng độ đường trong môi trường
nuôi cấy (lần cấy truyền thứ 4) thích hợp giúp cây dừa con vẫn tăng
trưởng tốt trong ống nghiệm nhưng giúp cây dễ thích nghi ở giai đoạn
vườn ươm, tăng tỷ lệ sống của cây ở vườn ươm.
Thí nghiệm một yếu tố gồm 3 nghiêm thức được bố trí theo khối đầy đủ
hoàn toàn ngẫu nhiên, được lặp lại 3 lần v
ới 10 cây/nghiệm thức.
Bảng 2.3: Công thức thí nghiệm Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm
lượng đường (Carbon) trong môi trường nuôi cấy.
STT Nghiệm thức Công thức
1 D1 Đường 4,5%
2 D2 Đường 3%
3 D3 Đường 2%
- Chỉ tiêu theo dõi: tỉ lệ sống, chiều cao cây, chiều dài rễ, số lá,
chiều dài lá, chiều rộng lá…

24
- Đo đếm số liệu sau mỗi tuần nuôi cấy. Thí nghiệm được theo dõi
trong 5 tháng

2.2.2 Nghiên cứu các điều kiện ngoại cảnh để nuôi cấy phôi dừa trong
phòng thí nghiệm: cường độ ánh sáng, phổ màu, cung cấp ôxy, nhiệt độ.
2.2.2.1- Nghiên cứu ảnh hưởng của việc nuôi cấy lắc (cung cấp ôxy)
và nhiệt độ đến tỉ lệ nảy mầm của phôi dừa (giai đoạn phôi mới được
đư
a vào ống nghiệm):
Mục đích thí nghiệm: Trong quá trình nuôi cấy phôi, đặc biệt là giai đoạn

phôi mới được cấy vào ống nghiệm, chúng tôi nhận thấy một số phôi bị
chìm hoàn toàn trong môi trường lỏng, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15%, điều
này làm hạn chế tỷ lệ nảy mầm và tăng trưởng của phôi.
Thí nghiệm được thực hiện nhằm lựa chọn điều kiện nuôi cấ
y (môi
trường lỏng lắc hay môi trường lỏng tĩnh kết hợp với nhiệt độ 25
o
C ± 2
o
C
và 30
o
C ± 2
o
C) giúp cải thiện tỷ lệ nảy mầm và phát triển thành cây của
phôi dừa Sáp đặc biệt là đối với những phôi bị chìm hoàn toàn trong môi
trường nuôi cấy.
Điều kiện nuôi cấy lỏng tĩnh: Sau khi được tách ra khỏi nội nhũ, các phôi
được cấy vào các bình tam giác 250ml có chứa 50ml môi trường lỏng Y3
căn bản và được đặt trên các kệ sáng cố định ở nhiệt độ 25
o
C ± 2
o
C và
30
o
C ± 2
o
C , cường độ ánh sáng khoảng 2000 lux, thời gian chiếu sáng
9h/ngày.

Điều kiện nuôi cấy lỏng lắc: Các bình tam giác này được đặc trên máy
lắc vòng, tốc độ 100-120 vòng/phút được đặc ở nhiệt độ 25
o
C ± 2
o
C và
30
o
C ± 2
o
C. Hệ thống đèn chiếu trắng được thiết kế bên trên máy lắc có
cường độ ánh sáng và thời gian chiếu sáng tương tự nuôi cấy lỏng tĩnh.
Thí nghiệm 2 yếu tố được bố trí theo khối đầy đủ hoàn toàn ngẫu nhiên,
được lặp lại 3 lần với 10 phôi/nghiệm thức.
- Yếu tố A gồm 2 nghiệm thức:
• A1: Môi trường lỏng tĩnh
• A2: Môi trường lỏng lắ
c
- Yếu tố B gồm 2 nghiệm thức:
• B1: Nhiệt độ 25
0
C ± 2
0
C
• B2: Nhiệt độ 30
0
C ± 2
0
C
• B3: Nhiệt độ 35

0
C ± 2
0
C