Bài giảng : CÁC QUÁ TRÌNH TÁCH TRONG SẮC KÝ LỎNG part 5 ppsx

41
Sắc ký ion : Ion Exchange
N
+
R
R
R
Sample
SO
3
-
Sample
+
+
+
++
+
+
+
+
+
++
+
Lực ion
42
Ion Exchange
•Sử dụng trong lĩnh vực sinh học
(phân tích protein, peptide, amino acid)
•Sắc ký Ion : phân tích các hợp chất ion
Bao gồm 2 loại cột:
–Cột trao đổi Cation

• Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO
3
-
)
• Weak Cation Exchange (WCX) (R-COO
-
)
–Cột trao đổi Anion
• Strong Anion Exchange (SAX) (R
4
N
+
)
• Weak Anion Exchange (WAX) (DEAE – diethyl
aminoethyl)
43
Phân tích Protein sử dụng cộtWCX
Analytical Conditions
Column : Shim-pack WCX-1
Mobile phase :
[A] 20 mM phosphate buffer (pH=6.0)
[B] A+0.25M sodium sulfate
[A] - [B] 30 min linear gradient
Flow rate : 1.0 mL/min
Temperature : ambient
Detector : UV-280 nm
Injection volume : 10 uL
Peaks
1. albumin
2. myoglobin

3. α-chymotrypsinogen A
4. liponuclease A
5. lisozyme
44
Những điểm quan trọng cần lưu
ý trong sắc ký ion
•pH của dung dịch đệm
•Nồng độ của dung dịch đệm
•Phương pháp rửa giải
– Đẳng dòng : Isocratic
– Gradient pH
– Gradient lực ion
45
Sắc ký gel SEC
•
•
S
S
ắ
ắ
c gel (s
c gel (s
ắ
ắ
c ký size phân t
c ký size phân t
ử
ử
) (S
) (S

EC)
EC)
thư
thư
ờ
ờ
ng đư
ng đư
ợ
ợ
c bi
c bi
ế
ế
t dư
t dư
ớ
ớ
i tên :
i tên :
¾GPC (Gel Permeation
chromatography) : sắc ký thẩm thấu gel,
thường sử dụng trong lĩnh vực polymer.
¾GFC (Gel Filtration Chromatography) :
sắc ký tinh lọc gel, thường sử dụng
trong lĩnh vực sinh hóa.
46
Nguyên lý của SEC
•
•

Không s
Không s
ử
ử
d
d
ụ
ụ
ng hi
ng hi
ệ
ệ
u
u
ứ
ứ
ng tương t
ng tương t
á
á
c.
c.
•
•
T
T
á
á
ch d
ch d

ự
ự
a trên s
a trên s
ự
ự
kh
kh
á
á
c nhau v
c nhau v
ề
ề
th
th
ờ
ờ
i
i
gian di chuy
gian di chuy
ể
ể
n c
n c
ủ
ủ
a ch
a ch

ấ
ấ
t.
t.
47
Thứ tự rửa giải
SEC
Column
48
Mục đích củaGPC/ GFC
•GPC
–
–
S
S
ử
ử
d
d
ụ
ụ
ng đ
ng đ
ể
ể
x
x
á
á
c đ

c đ
ị
ị
nh tr
nh tr
ọ
ọ
ng lư
ng lư
ợ
ợ
ng
ng
phân t
phân t
ử
ử
c
c
ủ
ủ
a polymer.
a polymer.
•GFC
–
–
T
T
á
á

ch c
ch c
á
á
c protein
c protein
49
Mối tương quan giữa trọng lượng
phân tử (MW) và thời gian lưuRT
Molecular Weight (LogMW)
Giới hạn loại trừ
Giới hạn thẩm thấu
Time
50
Lập đường chuẩn
• Tiêm từng dung dịch chuẩn polymer có
phân tử lượng khác nhau để biết được mối
quan hệ giữa trọng lượng phân tử và thời
gian lưu .
No. time
(
min
)
mol. wet.
1 22.0 5500000
2 22.6 1800000
3 23.4 860000
4 25.0 400000
5 27.4 160000
6 31.0 50000

7 33.8 20000
8 38.4 4000
9 39.8 2000
10 42.8 600
11 46.8 80