Bài giảng : Phân tích công cụ part 9 pot

146

Nhưng vì
MRiRi
ttt −=
'

và
MRiRi
VVV −=
'

Nên ta có:
)1(
iMRi
ktt
+
=
(9.5 e)

)1(
iMRi
kVV
+
=
(9.5 f)
Hai công thức 9.5e và 9.5f cho ta biết mối quan hệ giữa thời gian lưu và hệ
số dung tích của một chất tan I trong một hệ sắc ký.
9.3.5 Hệ số chọn lọc (Seletivity Factor
)

Hệ số dung tích chỉ mới cho ta biết khả năng bị lưu giữ của môt chất ở trên
cột tách, nhưng chưa cho ta biết hai chất khi qua cột tách chúng có được tách ra
không. Để đặc trưng cho vấn đề này, người ta dùng hệ số chọn lọc α và nó được xác
định hoặc theo
'
i
k
(hệ số dung tích) hoặc theo K (hệ số phân bố), tức là:
'
'
/
B
A
BA
K
K
r ==
α
hay
B
A
K
K
=
α
(9.6a)
Trong đó
'
A
K

,
'
B
K
là hệ số dung tích của chất A và chất B; còn K
A
, K
B
là hệ
số phân bố. Nhưng như trên chúng ta đã biết:
)1(
'
iMRi
ktt +=
hay
M
MR
i
t
tt
k
)(
'
−
=

Nên ta cũng có:
)(
)(
)(

)(
MBR
MAR
tt
tt
−
−
=
α
(9.6b)
Như vậy từ biểu đồ sắc ký ta xác định được t
Ri
, t
M
và xác định được giá trị
α

của hai chất A và B và nếu:
α
= 1 : không có sự tách sắc ký
α
≠ 1 : có sự tách sắc ký và nếu t
A
>t
B
và
α
khác 1 càng lớn. thì sự tách của
hai chất A và B càng rõ rang, tức là hai pic sắc ký tách biệt nhau hoàn toàn. Song
cũng từ công thức 1.6a, nếu biết hệ số dung tích

'
i
k
hay hệ số phân bố K của hai chất
A và B, thì chúng ta cũng có thể dự đoán được
α
.
9.3.6 Chiều cao của đĩa, số đĩa
Nếu cột sắc ký có độ dài là L, và H là chiều cao của một đĩa lý thuyết của cột
tách thì tổng số đĩa lý thuyết N của một cột sắc lý sẽ là:
H
L
N
=
(9.7a)
Nhưng theo lý thuyết đĩa và quy luật Gaoxo chiều cao một đĩa lý thuyết của
cột sắc ký là:

147

L
H
2
σ
=
((9.7b)
trong đó
σ
là độ lệch chuẩn.
Mặt khác:

R
t
WL
4
.
=
σ
(9.7c)
Do đó
2
2
).(16
.
R
t
WL
H
=
(9.7d)

2
.16






=
W

t
N
R
(9.7e)
Như vậy từ biểu đồ sắc ký chất tan I, sau khi đo
R
t
và W chúng ta có thể dễ
dàng tính được số đĩa lý thuyết N của một cột tách.
9.3.7. Độ phân giải
Độ phân giải là đại lượng cho ta biết khả năng tách của 2 pic sắc ký của 2
chất kề nhau như thế nào. Nếu hai chất A và B có pic sắc ký như hình 9.5 thì ta có
độ phân giải R
S
của nó là:
)(
2
)2/2/(
/
BABA
BA
WW
Z
WW
Z
R
+
∆
=
+

∆
=
(9.8a)
Hay là:
)(
)(2
'
)(
'
)(
/
BA
BRAR
BA
WW
tt
R
+
−
=
(9.8b)
Trong đó W
A
, W
B
là đáy của các pic sắc ký.
Một cách gần đúng, ở đây có thể xêm (W
A
+W
B

) ≈ 2W
A
, do đó ta có giá trị
của độ phân giải R là:
A
BA
BA
W
tt
R
''
/
−
=
(9.8c)
Nhưng như trên chúng ta đã biết theo t
R
. Do đó ta lại có:
N
k
k
R
A
A
BA
⋅
+
⋅
−
⋅=

)1(
)1(
4
1
'
'
/
α
α
(9.8d)




148


Hay:
efBA
NR ⋅
−
⋅=
α
α
)1(
4
1
/
(9.8e)
Từ công thức này, để đạt được độ phân giải

BA
R
/
nhất định theo yêu cầu, và
các giá trị
'
A
k
,
'
B
k
, ta có thể tính được số đĩa tối thiểu N cho một cột sắc ký, sau đó
tìm chiều dài L của cột theo công thức:
H
L
N
=
.
9.3.8. Nồng độ của chất theo pic sắc ký
Nếu chất phân tích I trong mẫu có nồng độ là C
0
, thể tích mẫu được nạp vào
cột sắc ký là V
si
, thì lượng mẫu q
i
đã được nạp vào là:
0
CVq

sii
⋅
=
(9.9a)
và trong quá trình tách, chất I sẽ được rửa giải ra khỏi cột tách, tại đỉnh của
pic sắc ký sẽ có nồng độ là:
2/1
(max)
)2.(
πσ
v
i
i
q
C
=
(9.9b)
Đồng thời trong quá trình sắc ký, nó đã bị pha loãng ra một số lần là:
Hình 9
.5.

Độ phân giải của hai chất tan A và B

149

2/1
)2.(
πσ
v
si

l
V
D
=
(9.9c)
Gía trị
l
D
luôn lớn hơn 1, và nếu
l
D
càng lớn, thì giá trị
(max)i
C
càng giảm. Độ
pha loãng
l
D
phụ thuộc vào:
-

Chiều dài của đường dẫn trong hệ thống HPLC (tức là từ van bơm mẫu đến
flowcell của detector). Do đó muốn giảm
l
D
thì đường dẫn phải ngắn.
-

Tốc độ của pha động.
9.3.9 Quan hệ giữa chiều dày đĩa và tốc độ của pha động (H-u)

Chiều cao của đĩa và tốc đọ dich chuyển của đĩa (u) có liên quan chặt chẽ với
nhau. Mối quan hệ này được chỉ ra bởi phương trình Van Deemter:
uCuCuC
u
B
AH
321
++++=
(9.10a) Trong đó:
dpA
λ
2
=
là hằng số của chất nhồi cột (pha tĩnh), nên A phụ thuộc vào đường
kính dp của pha tĩnh. Nó là hợp phần chính quyết định chiều cao của đĩa H;
i
DB
γ
2
=
và là hằng số, D
i
là tốc độ khuếch tán của chất tan trong pha động.
Vì thế B là yếu tố ảnh hưởng của pha động đến H, nó là yếu tố thứ 2 đóng góp đáng
kể cho H. Các giá trị của C
1
, C
2
, C
3

là như sau:

{
}
sii
DdlkkC /.)1/(3/2
2''
1
+=
(9.10b)

[
]
iii
DdkkqC /).()1/()(.
2
2
2'2'
12
+=
(9.10c)

i
DdpqC /)(
2
23
=
(9.10d)
Trong đó: d
1

, q
1
, q
2
là các hằng số; D
S
là độ khuếch tán chất tan trong pha tĩnh
và nó là ảnh hưởng của pha tĩnh đến chiều cao H. Trong thực tế của phân tích sắc
ký, C
2
.u và C
3
.u rất nhỏ (dưới 5% của H), vì thế ta có thể viết phương trình Van
Deemter như sau:
uC
u
B
AH .
1
++=
(9.10e). Và mối quan hệ H – u được biểu diễn như trong hình 9.6






150

Ở đây u

0
là tốc độ tối ưu nhất của hệ sắc ký, và ở tốc độ u
0
này chiều cao H
là nhỏ nhất, có nghĩa số đĩa N trong cột sắc ký là lớn nhất.
- Nếu u<u
0
chiều cao H tăng khi giảm u
- Nếu u>u
0
chiều cao H cũng tăng theo u
Do đó trong phân tích chúng ta cố gắng chọn tốc độ chảy F
m
của pha động
qua cột sao cho giá trị u gần bằng u
0
hoặc bằng u
0
là điều lý tưởng nhất để có hiệu
quả tách cao nhất.
Vì thế muốn tìm được tốc độ pha động phù hợp ta phải xây dựng đường cong
H – u, qua các giá trị thực nghiệm ỏ những tốc độ chảy F
m
khác nhau, rồi tính theo
công thức:
'
Ri
t
L
u =

Và H theo công thức:
2'
2
).(16
.
Ri
t
WL
H =

Sau đó từ các cặp giá trị của u và H ta sẽ dựng được đường cong Van
Deemter, rồi tìm u từ đường cong này, sau đó suy ra F
m
.
Hình 9.6.

Quan hệ giữa H và u (đường cong Van Deemter)


151

Tóm lại một số thông số đặc trưng cơ bản cho quá trình sắc ký chúng ta có
thể xem trong bảng 9.2 dưới đây.

Bảng 9.2
.
Tóm tắt các đại lượng đặc trưng của sắc ký
Important Derived Quantities and Relationships
Name Calculation of Devired

Quantities
Relationship to Other
Quantities
Linear mobile phase
velocity
M
t
L
u =

Volume of mobile
phase
FtV
MM
=


Capacity factor
M
MR
t
tt
k
)(
'
−
=

M
S

V
KV
k =
'

Partition coefficient
S
M
V
Vk
K
'
=

M
S
C
C
K =

Selectivity fartor
MAR
MBR
tt
tt
−
−
=
)(
)(

α

A
B
A
B
K
K
k
k
==
'
'
α

Resolution
BA
ARBR
S
WW
tt
R
+
−
=
))()((2










+






−
=
'
'
1
1
4
B
B
S
k
kN
R
α
α

Number of plates
2

16






=
W
t
N
R

2
'
'
2
2
1
1
16








+







−
=
B
B
S
k
k
RN
α
α

Plate height
N
L
H =


Retention time
2'
3'
2
2
)(
)1(

1
16
)(
B
B
S
BR
k
k
u
HR
t
+






−
=
α
α


9.4. Detector của sắc ký
Detector là một bộ phận rất quan trọng trong hệ thống máy sắc ký. Nó ghi
nhận sự tách xảy ra ở trong cột sắc ký. Vì thế, nếu nó ghi nhận không trung thực thì
chúng ta sẽ không hiểu đúng được sự tách sắc ký. Mỗi loại detector ghi nhận chất
phân tích theo những đặc trưng hóa lý nhất định, ví dụ như:

1.

Sự hấp thụ bức xạ UV, VIS
2.

Độ huỳnh quang của chất phân tích

152

3.

Sự thay đổi dòng điện, điện thế, độ dẫn điện
4.

Độ dẫn nhiệt
5.

Sự biến thiên chiết suất, v.v…
Mặc dù có nhiều lọai khác nhau, nhưng yêu cầu chung của một detector để
dùng trong máy sắc ký phải có:
Có độ nhạy cao để phát hiên chất phân tích, thường là 10
-8
-10
-15
g/g, và nhạy
hơn thì càng tốt.
Phải ổn định, phải lặp lại tốt các giá trị đo, bền vững theo thời gian, để đảm
bảo phép đo đạt độ chính xác cao.
Có vùng tuyến rộng, thường 10
3

đến 10
4
.
Vùng làm việc ở khoảng nhiệt độ rộng (khoảng 400
0
C). Yêu cầu này là do
GC.
Thời gian đáp tuyến phải ngắn, để nhạy cảm kịp thời với các qua trình xảy ra
của sự tách trong cột sắc ký.
Có tính linh hoạt cao và sử dụng dễ dàng, để chọn các tham số đo cho các
yêu cầu phân tích khác nhau.
Thích hợp được cho nhiều loại nhóm chất để theo dõi được nhưng hỗn hợp
mẫu có thành phần phức tạp.
Trong quá trình phát hiện nó không làm ảnh hưởng hay làm sai nồng độ chất
phân tích, hay ảnh hưởng cấu trúc của chất.
Detector nào thỏa mãn tốt các yêu cầu đó được gọi là lý tưởng. Tất nhiên
trong thực tế sự thỏa mãn hoàn toàn cao là khó. Tùy loại mẫu tách mà yêu cầu nào
được đặt lên hàng đầu.
Có nhiều kỹ thuật sắc ký khác nhau và cũng có nhiều cách phân chia và phân
loại, song cách phân loại theo bản chất chính của quá trình sắc ký ở trong cột tách
hiện nay được sử dụng nhiều hơn và hợp lý hơn. Theo cách phân loại này chúng ta
có 4 loại sắc ký:
Sắc ký khí
: là loại sắc ký sự tách các chất xảy ra ở trạng thái khí.
Sắc ký lỏng
: là loại sắc ký sự tách của các chất xảy ra ở thể lỏng. Pha động
là chất lỏng. Trong nhóm sắc ký này lại được chia thành: sắc ký hấp phụ pha
thường, sắc ký hấp phụ pha ngược, sắc ký trao đổi ion, sắc ký phân bố, sắc ký rây
phân tử.
Trong nhóm sắc ký lỏng, lại có sắc ký lỏng áp suất thấp (cổ điển) và sắc ký

lỏng áp suất cao (HPLC).

153

Sắc ký giấy
: là loại sắc ký sự tách xảy ra trên nền, giấy sắc ký nguyên liệu
tách (pha tĩnh).
Sắc ký lớp mỏng
: là loại sắc ký mà sự tách của chất xảy ra trên lớp màng
mỏng silica hay oxit nhôm có tính chất sắc ký, nó là pha tĩnh.
Trên đây là cơ sở lý thuyết chung của sắc ký, song trong giáo trình này
chúng ta chỉ nghiên cứu đi sâu vào hai loại sắc ký đầu tiên. Đó là sắc ký lỏng cao áp
(HPLC) và sắc ký khí (GC) .
9.5.

PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG

9.5.1. Nguyên tắc của sắc ký lỏng
Sắc ký lỏng là quá trình tách một hỗn hợp các chất ở trong cột tách sắc ký ở
trạng thái lỏng. Vì thế các chất mẫu phân tích phải hòa tan trong một chất lỏng nào
đó, thường là pha động của quá trình sắc ký. Nó thường thích hợp cho cả các chất
có nhiệt độ sôi cao cũng như thấp (trừ các chất ở điều kiện thường là khí). Sắc ký
lỏng có hai loại:
Sắc ký lỏng áp suất thường (cổ điển)
Sắc ký lỏng áp suất cao – HPLC.
Chúng đều giống nhau ở pha động là chất lỏng, có thể là một dung môi đơn,
hay hỗn hợp của 2 hoặc 3 dung môi theo những tit lệ nào đó.
Pha tĩnh trong sác ký lỏng có thể là chất rắn hay chất lỏng. Pha tĩnh rắn được
nhồi vào cột tạo thành cột chất nhồi có dạng của cột sắc ký. Pha tĩnh lỏng được giữ
trong cột sắc ký nhờ chất mang trơ, nó là một màng

(lớp) mỏng (1-3 µm bám xung quanh hạt chất mang. Loại pha tĩnh này có dung tích
nhỏ hơn loại pha tĩnh rắn xốp toàn phần. Do trạng thái của pha như thế nên có tên:
sắc ký lỏng – lỏng (LLC), sắc ký lỏng – rắn (LSC). Trong thực tế loại LSC được sử
dụng nhiều hơn.
Với sắc ký lỏng, việc thực hiện quá trình tách sắc ký có thể theo hai kĩ thuật
sau:
Kĩ thuật giữ thành phần và tốc độ pha động là hằng số.
Kĩ thuật gradient pha động. Ở đây có thể gradient từng bậc (tăng hoặc giảm),
hay gradient liên tục thành phần pha động, để chọn thành phần pha động trong
quá trình tách sắc ký để rửa giải các chất.
Trong sắc ký lỏng áp suất thường, thời gian tách lâu, tốn nhiều chất nhồi và
pha động, hiệu suất tách lại kém, việc tách các chất không gọn như sắc ký lỏng áp
suất cao (HPLC). Nó là kĩ thuật tách cổ điển. Do đó ở đây chúng ta chỉ bàn đến sắc
ký lỏng áp suất cao.

154

Trong HPLC, mẫu được bơm vào cột nhừ một van bơm mẫu, sau đó nhờ một
bơm cao áp bơm pha động chảy qua cột với một tốc độ xác định từ đầu đến cuối cột
tách. Qúa trình tách sắc ký của một hỗn hợp gồm hai chất A và B có thể được minh
họa như hình 1.1. Lúc đầu 2 chất A và B cùng trong một vùng trên cột, nhưng theo
thời gian chạy sắc ký hai chất dần đàn tách ra khỏi nhau, để đến cuối cột tách 2 chất
tách thành hai vùng riêng biệt và trên sắc đồ sắc ký chúng ta sẽ thu được hai pic sắc
ký riêng biệt.
9.5.2. Máy sắc ký lỏng cao áp
Máy sắc ký lỏng cao áp là một hệ thống trang bị để tực hiện quá trình sắc ký.
Nó bao gồm các bộ phận cơ bản sau đây:
1.

Van bơm mẫu (sample injection valve): Van bơm mẫu có chứa vòng mẫu

với thể tích nhất định, ví dụ 20, 50, hay 100 µl, dùng để bơm mẫu phân tích vào cột
Hình 9.7. Ví dụ về sự tách sắc ký hai chất A và B.

155

tách. Có nhiều loại van, nhưng loại van 6 chiều được sử dụng nhiều hơn, vì nó
thuận lợi hơn các loại khác.
2.

Cột sắc ký: Cột sắc ký HPLC làm bằng thép hay thủy tinh thạch anh có
vỏ thép để chịu áp suất cao. Cột HPLC thường có kích thước bình thường là 250
×
4mm; 150
×
4mm; 125
×
4mm; hay 250
×
1mm; 150
×
1mm, hoặc 50
×
1mm hay
50
×
2mm. Các loại cột có kích thước nhỏ hơn 5 cm (chiều dài) và 1 mm đường
kính gọi là microbore. Tất nhiên chiều dài của cột phụ thuộc vào cỡ hạt chủa chất
nhồi. Hạt càng to thì cột phải dài, để đảm bảo đủ số đĩa lý thuyết tối thiểu cho một
cột tách sắc ký. Chất nhồi đường kính hạt 5 µm, cần cột dài 125-150 mm là đủ,
nhưng nếu chất nhồi đường kính 7 – 10 mm, phải dùng cột dài 250 – 300 mm. Chất

nhồi đường kính 2-3 µm, chỉ cần cột dài 3-5 cm.
Cột tách là một bộ phận kết quả tách của một hỗn hợp chất mẫu là tốt hay
xấu, và với mỗi loại chất mẫu phải chọn một loại cột tách riêng cho nó. Đó là loại
chất nhồi – pha tĩnh (stationary phase).
3.

Bơm cao áp
Là dụng cụ để bơm pha động qua cột tách với tốc độ xác định, phục vụ quá
trình rửa giải các chất ra khỏi cột sắc ký. Nó phải có độ ổn định và lặp lại cao của
tốc độ bơm. Có bơm 1 kênh, có bơm 2 kênh song song hoặc 2 kênh nối tiếp, và làm
việc trong vùng áp suất từ 0 – 400 bar. Nhưng bơm 2 kênh cho tốc độ ổn định hơn.
4.

Bộ gradient pha động
Bộ này chỉ cần khi thực hiện kĩ thuật tách với gradient pha động. Nó được
đặt trước bơm cao áp, để chuẩn bị gradient pha đọng với thành phần phụ hợp theo
yêu cầu để cho bơm cao áp bơm vào cột tách.
5.

Detector
Là bộ phận để thu nhận vàn phát hiện tín hiệu của chất phân tích, theo một
tính chất nào đó của nó, ví dụ như:
Sự hấp thụ quang phân tử vùng UV-VIS
Sự hấp thụ hay phát xạ của nguyên tử
Tính chất phát huỳnh quang của phân tử hay nguyên tử
Độ dẫn điện của các chất
Sự biến thiên của dòng điện giữa 2 điện cực
Độ dẫn điện của chất
Sự biến thiên chiết suất của dung dịch mẫu.

156

Nhưng dù loại nào nó cũng phải đạt được những yêu cầu nhất đinh (xem mục
9.4 ở trên). Và cứ ứng với mỗi một loại tính chất đó thì ta có một loại detector. Ví
dụ như detector phổ hấp thụ nguyên tử UV-VIS (190-1000nm), detector huỳnh
quang, detector đo độ dẫn của dung dịch v.v…
6.

Bộ phận ghi nhận kết quả
Có thể là: Máy tự ghi (recorder), đây là trang bị được dùng phổ biến nhất
Máy intergrator. Máy printer. Hay computer với màn video.
Những hệ máy HPLC hiện đại và hoàn chỉnh, hiện nay luôn có gắn
computer và có cài các chương trình chạy sắc ký, hệ thống bơm mẫu tự động, …
Sơ đồ khối của một hệ thống máy HPLC được mô tả trong hình 9.8.
Bảng 9.3
.
Các loại detector và tính năng của nó
Loại detector Độ nhạy Tính năng
vùng t. tính
Ứng dụng
Phổ UV
Phổ UV-VIS
Phổ huỳnh quang
Chiết suất (RI)
Đo độ dẫn điện
Độ dẫn điện
Cực phổ (Amp.)
Phổ MS
> 1 ng
>1 ng

>0.01 ng
>100 ng
>10 ng
>1 µg
>0.1 ng
>0.01ng
10
3
10
3
10
4
10
4
10
4
10
4
10
4
10
4
phổ biến
phổ biến
vừa
ít dùng
vừa
ít dùng
ít dùng
ít (mới)

157

9.5.3. Pha tĩnh trong HPLC
Pha tĩnh trong HPLC (hay còn gọi là chất nhồi cột) cũng có 4 loại, tương ứng
với các loại sắc ký đó, đó là các loại chất nhồi của sắc ký:
Hấp phụ gia thường (NP-HPLC)
Hấp phụ pha ngược (RP-HPLC)
Trao đổi ion (IE-HPLC)
Phân bố - sắc ký chiết (P-HPLC)
Rây phân tử (GEL-HPLC)
Tuy có 4 loại, nhưng cũng được chế tạo trên 3 chất nền là silica, oxit nhôm
và cao phân tử hữu cơ (polystyrene). Nhưng silica vẫn là chủ yếu (chiếm 30%), sau
đó là nền oxit nhôm. Pha tĩnh cũng có pha tĩnh rắn và pha tĩnh lỏng. Pha tĩnh lỏng
thường là các chất hữu cơ được giữ ở trong cột tách nhờ các hạt chất mang trơ. Nó
tạo thành một lớp màng mỏng xung quanh các hạt chất mang có độ dày 1 – 3 µm.
Hình 9.8.
Sơ đồ nguyên tắc của hệ máy HPLC

158

Các hạt chất mang trơ là các hạt silica đã được hoạt hóa cho mất tính hấp phụ. Nó
trơ trong quá trình sắc ký. Vì thế trong kỹ thuật HPLC cũng có:
Sắc ký lỏng – lỏng
Sắc ký lỏng – rắn
Pha tĩnh rắn là các hạt có hình cầu hay là các mảnh có đường kính từ 3 – 10
µm. Phổ biến nhất hiện nay là cở 5 – 7 µm. Nên silica là nguyên liệu chính để chế
tạo pha tĩnh trong HPLC.
Pha tĩnh của HPLC hấp phụ pha thường là các silica trung tính (silica trần).
Trên bề mặt của nó còn chứa nhiều nhóm phân tực – OH (hình 1.3a). Nhóm này ưa
nước, và để liên kết cầu hidro với các phân tử nước, làm giảm hoạt tính sắc ký của
pha tĩnh. Loại này để tách các chất không phân cực và ít phân cực. Pha động của
loại pha tĩnh này là những chất kỵ nước (không ưa nước); nghĩa là không hòa tan
nước. Ví dụ như CHCl
3
, benzene, CCl
4
, etylacetat, n-hexan, n-pentan, v.v… (bảng
2.4).
Pha tĩnh của HPLC hấp thụ pha ngược là các silica trung tính đã được alkyl
hóa nhóm OH trên bề mặt bằng các nhóm alkyl của mạch cacbon C
3
, C
8,
C
18
hay
nhân phenyl. Vì thế loại chất nhồi này có bề mặt không phân cực. Nó thuộc loại
chất nhồi kỵ nước (hình 9.9) . Nghĩa là nước không ảnh hưởng đến tính chất bề mặt

của nó. Pha động cho loại sắc ký này là nước có hòa tan thêm các chất hữu cơ, ví dụ
như methanol, acetonitril được trộn với nước theo tỉ lệ phù hợp.
Hình 9.9.
Cấu trúc của pha tĩnh trong HPLC


159

Tất nhiên các tính chất, đặc trưng, cấu trúc của hạt pha tĩnh đều có ảnh
hưởng đến hiệu quả sắc ký. .
Các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất sắc ký có rất nhiều, ví dụ như độ xốp
của pha tĩnh, thành phần, tốc độ của pha động, …
Bảng 9.4.
Vài ví dụ về pha tĩnh trong HPLC.
Tên pha tĩnh Loại nhóm thế Trên nền Loại pha
ODS-Hypersil
Lichrosorb RP18
Micropack CH
Lichrosorb RP8
Zorback-ODS
ODS-Sil X-I
C
18

C
18

C
18

C
8
C
18

C
18

Silica
Silica
Silica
Silica
Silica
Silica
Hấp phụ RP
ntr.
ntr.
ntr.
ntr.
ntr.
Hypersil
Partisil
Lichrosorb-Si60, Si100
Zorbac-Sil
µ-Porasil
Silica
Silica
Silica
Silica
Silica

Hấp phụ NP
ntr.
ntr.
ntr.
ntr.
Partisil 10SCX
Lichrosorb KAT
Aminex-A28

Silica
Silica
Polyme hữu cơ
Trao đổi ion
ntr.
ntr.
9.5.4. Pha động trong HPLC
Pha động trong sắc ký lỏng cao áp (HPLC) tùy thuộc vào mỗi loại chất nhồi
cột khác nhau. Nó có thể là một dung môi đơn, hỗn hợp của 2 hay 3 dung môi trộn
với nhau theo tỉ lệ phù hợp. Song với bất kỳ loại sắc ký nào thì yêu cầu của dung
môi làm pha động cũng phải thỏa mãn những yêu cầu nhất định như:
Phải trơ và không có tác dụng hóa học với pha tĩnh
Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc ký
Hòa tan tốt hỗn hợp chất mẫu
Phù hợp với loại detector đã chọn để phát hiện chất phân tích

160

Trong sắc ký hấp phụ pha thường (NP-HPLC), vì pha tĩnh là chất phân cực,
nên pha động là những chất không phân cực hay ít phân cực. Ví dụ n-hexan, n-
heptan, benzene, tetrachlocacbon, chloroform, …Nói chúng đó là các dung môi hữu

cơ. Các dung môi này thường kỵ nước. Hệ sắc ký này thường được sử dụng để tách
và phân tích các hỗn hợp hiđrocacbon, các chất hữu cơ không phân cực hay ít phân
cực.
Trong sắc ký hấp phụ pha ngược (RP-HPLC), vì pha tĩnh không phân cực
hay rất ít phân cực, nên pha động phân cực. Pha động trong loại sắc ký này đều trên
nền nước cất có thêm các dung môi hữu cơ tan tốt trong nước như methanol,
acetonitril, izo-butanol, …Phổ biến nhất là hỗn hợp của (methanol + nước) theo tỉ lệ
nhất định tùy theo mỗi loại hỗn hợp mẫu cân sắc ký. Hệ sắc ký này phù hợp cho sự
tách sắc ký của nhiều loại hỗn hợp mẫu, như hyđrocacbon, nhóm các chất mạch
vòng, hợp chất tự nhiên, các phenol, các amin, amino-axit, …Phạm vi sử dụng của
RP-HPLC phong phú và đa dạng hơn nhiều loại NP-HPLC.
9.5.5. Sự lưu giữ trong cột
Các chất phân tích được lưu giữ trong cột tách bao lâu là được quyết định bởi
các yếu tố:
Bản chất của chất phân tích, như cấu trúc phân tử, các nhóm thế và vị trí của
chúng, …
Bản chất và các đặc trưng của pha tĩnh trong cột tách, như cỡ hạt, độ xốp,
kích thước lỗ xốp, …
Pha động như bản chất của các dung môi làm pha động, thành phần và tốc độ
của pha động, pH của pha động
Nhiệt độ cột tách.
Tất cả các yếu tố đó ảnh hưởng trong những mức độ nhất định đến hiệu quả
sắc ký của một hỗn hợp chất và chỉ khi chon được những điều kiện phù hợp nhất,
thì chúng ta mới thu được kết quả sắc ký tốt.
9.5.6. Tối ưu hóa điều kiện sắc ký
Tối ưu hóa các điều kiện sắc ký là nghiên cứu chọn lọc các điều kiện sắc ký
phù hợp nhất cho một hỗn hợp mẫu phân tích để thu được hiệu quả tách cao nhất
của sự tách các chất. Nghĩa là các chất có trong hỗn hợp mẫu được tách nhau hoàn
toàn. Giải quyết vấn đề này bao gồm những cong việc như sau dựa theo tính chất
của hỗn hợp chất mẫu:

1.

Chọn pha tĩnh phù hợp theo các tính chất và đặc trưng như loại, độ xốp,
cỡ hạt, kích thước cột chứa pha tĩnh, …

161

2.

Chọn pha động phù hợp. Nó bao gồm chọn dung môi làm pha động,
thành phần của chúng, tốc độ pha động, và chất đện Ph, chất tạo phức, nếu cần cho
sự tách đạt hiệu quả cao. Ví dụ như trong sắc ký trao đổi ion.
3.

Chọn loại detector và các thông số của nó để phát hiện chất phân tích với
hiệu quả cao (độ nhạy và độ chọn lọc cao).
4.

Lượng mẫu bơm vào cột tách
5.

Nhiệt độ của cột tách trong quá trình sắc ký
6.

Chế độ gradient có cần không?, …
Thực hiện nghiên cứu chọn được các điều kiện nói trên phù hợp, tức là công
việc tối ưu các điều kiện sắc ký. Nghĩa là xây dựng một quy trình tách sắc ký các
chất trong một hỗn hơp mẫu phân tích.
9.5.7. Phân tích định tính trong HPLC
Chúng ta biết rằng trong một (thông số đặc trưng) để phát hiện định tính một

chất trong hỗn hợp mẫu. Vì thế nguyên tắc của phân tích định tính theo HPLC là:
Trong điều kiện sắc ký đã chọn, dùng các chất chuẩn để xác định thời gian
lưu của các chất phân tích theo sắc đồ bơm mẫu riêng của tưng chất. như thế ta lập
được thời gian lưu của mỗi chất, ví dụ như đối với các chất A, B, C, D,…ta có các
thời gian lưu tương ứng là t
A,
t
B
, t
C
, t
D
, …
Do đó đến khi phân tích mẫu chưa biết, ta cũng bơm mẫu và ghi sắc đồ của
mẫu phân tích và nếu có một chất có thời gian lưu trùng với t
B
thì ta nói chất chưa
biết đó là chất B

9.5.8. Phân tích định lượng
Nguyên tắc của phân tích định lượng trong HPLC là dựa trên cơ sở trong một
phạm vi nhất định của chất phân tích thì chiều cao hay diện tích của pic sắc ký là có
quan hệ tỉ lệ thuận với nông độ của nó ở trong mẫu theo biểu thức:
H = k.C (9.9a)
Hay là S = k.C (9.9b)
Trong đó H là chiều cao và S là diện tích của pic sắc ký của chất. Trong hai
biểu thức này, quan hệ tuyến tính giữa S và C rộng hơn quan hệ tuyến tính giữa H
và C. Còn k là hằng số của các điều kiện thực nghiệm của quá trình sắc ký. Vì thế
trong một điều kiến sắc ký xác định thì nó sẽ không đổi. Do đó nguyên tắc của
phương pháp phân tích định theo kĩ thuật HPLC là:

Chuẩn bị một dãy mẩu chuẩn cùng với các mẫu phân tích trong cùng một
điều kiện.

162

Chọn một quy trình phù hợp để chạy sắc ký dãy mẫu chuẩn và các mẫu phân
tích.
Thừ sắc đồ thu được, xác định giá trị H (hay S) của các chất phân tích ở
trong các mẫu và các mẫu phân tích tương ứng. Ví dụ như trong bảng sau:
Dãy các chuẩn Mẫu phân tích

Mẫu
C
1
C
2
C
3
C
4
C
5
C
X1
C
X2
C
X3
Gía trị H H
1

H
2
H
3
H
4
H
5
H
X1
H
X2
H
X3

Gía trị S S
1
S
2
S
3
S
4
S
5
S
X1
S
X2
S

X2
- Sau đó dựng đường chuẩn H – C (hay S – C). Rồi từ các đường chuẩn này.
Và các giá trị H
x
hay S
x
chúng ta dễ dàng phát hiện được nồng độ của chất phân tích
9.5.9. Vài ứng dụng của HPLC
Hiện nay sắc ký lỏng cao áp được áp dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
khác nhau. Vì nó có nhiều ưu việt hơn sắc ký cổ điển, ví dụ như:
Độ nhạy cao
Khả năng tách được nhiều loại hỗn hợp chất
Tốc độ phân tích lớn
Nhanh chóng cho kết quả
Tốn ít mẫu
Song về mặt trang bị so với sắc ký cổ điển, thì kĩ thuật HPLC cần có các
trang bị đắt tiền hơn.
Các lĩnh vực đã và đang sử dụng HPLC nhiều là:
Công nghiệp hóa học, hóa dầu
Công nghiệp thực phẩm, nông nghiệp, thuốc trừ sâu
Y học, lâm sàng
Hóa sinh và hóa hợp chất tự nhiên
Công nghệ dược phẩm, …
9.6. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ KHÍ
9.6 1 Nguyên tắc
Sắc ký khí là quá trình tách các chất trong cột tách ở trạng thái khí, chất
mang mẫu là chất khí. Vì thế chỉ có thể để tách được hỗn hợp các chất khí hay các
chất lỏng hoặc chất rắn có thể dễ dàng hóa khí ở dưới 250
0
C, khi bơm mẫu vào cột

163

ở dạng lỏng. Nếu là chất rắn thì phải hòa tan trước trong một dung môi phù hợp tạo
ra dung dịch mẫu rồi mới bơm vào cột sắc ký để hóa khí chúng. Với các chất ở
nhiệt độ hóa hơi cao hơn 250
0
C, phải hóa hơi trước trong buồng hóa hơi riêng có
nhiệt độ cao ở đầu cột sắc ký, sau đó mới dẫn vào cột tách. Tất nhiên, với các chất
loại này, việc sắc ký là rất phức tạp và khó khăn.
Trong sắc ký khí, pha tĩnh cũng là chất rắn. Nó được nhồi đầy vào cột tách
(cột thường), hoặc chỉ là một lớp mỏng bám vào thành trong của cột sắc ký (sắc ký
mao quản). Còn pha động là một chất khí, hay một hỗn hợp hai chất khí. Chất khí
này mang mẫu vào cột để thực hiện quá trình tách. Nó chuyển động (hay dẫn vào)
liên tục trong suất quá trình tách với một tốc độ xác định.
Với sắc ký khí, việc thực hiên quá trình sắc ký có thể theo hai kĩ thuật:
Giữ nhiệt độ hằng số trong suốt quá trình tách.
Thực hiện gradient nhiệt độ trong quá trình tách.
Khi tách một hỗn hợp phức tạp chứa nhiều chất có nhiệt độ sôi khác nhau
lớn, như các hợp chất tự nhiên, các dược phẩm, …Qúa trình gradient nhiệt độ là rất
cấn thiết vì quá trình này tạo điều kiện để các chất tách ra khỏi nhau.
9.6.2. Máy sắc ký khí
Máy sắc ký khí là một hệ thống trang bị để thực hiện quá trình sắc ký. Nó
bao gồm 6 phần cơ bản:
9.6.2.1. Hệ thống cung cấp khí cho quá trình sắc ký, gồm các regulator, flow meter,
gas valves. Hệ thống này phải cấp được dòng khí ổn định cần thiết theo yêu cầu của
quy trình phân tích sắc ký.
9.6.2.2 Bộ xylanh bơm mẫu vào cột (sample Valve), có thể bơm được một lượng
mẫu chính xác vào cột trong vùng thể tích từ 5-100 µl, và lặp lại được tốt.
9.6.2.3. Cột tách sắc ký. Đây là phần quan trọng nhất, nó quyết định hết quả của sự

tách một hỗn hợp tốt hay xấu. Đó là pha tĩnh, chất nhồi cột (packing materials). Tất
nhiên, đối với mỗi loại sắc ký, chất nhồi khác nhau về bản chất. Cột sắc ký làm
bằng thép, hợp kim đồng, có chiều dài từ 3-5m, đường kính 2,5-4 mm. Cột mao
quản làm bằng thủy tinh, chiều dài từ 15-100m, đường kính 0,25-1 mm.
9.6.2.4. Hệ lò nung cột tách và hệ điện tử điều khiển lò nung: có nhiệm vụ làm nóng
cột hoặc theo chế độ nhiệt độ không đổi hay chế độ gradient nhiệt độ của sự tách
sắc ký yêu cầu.
9.6.2.5. Detector: là nộ phận để phát hiện, nhận biết các chất phân tích dựa theo
nhứng tính chất vật lý hóa học nào đó, và ứng với mỗi một tính chất của sự phát
hiện, người ta có một loại detector nhất định, ví dụ: