Đề tài: Định lượng kháng nguyên Cyfra 21-1 bằng kỹ thuật Real-time PCR ppsx

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
Lớp: KSCNSH 06 - 01
LUẬN VĂN BÁO CÁO
Định lượng kháng nguyên Cyfra 21- 1
bằng kỹ thuật Real
SVTH: Đinh Thị Thu Hằng
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Mục lục
Mở đầu
Theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thư Thế giới (International
Agency for Research on Cancer_ IARC), ung thư phổi là nguyên nhân gây tử
vong hàng đầu trong số các bệnh về ung thư. Tổng số người chết vì ung thư phổi
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
2
2
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
hàng năm cao hơn tổng số người chết vì ung thư vú, ung thư ruột và ung thư
tuyến giáp, và đứng thứ hai trong tổng số tử vong vì bệnh sau các bệnh về tim
mạch. Các thống kê từ hiệp hội Ung thư quốc gia của Việt Nam cũng đưa ra
những cảnh báo tương tự, số bệnh nhân ung thư phổi gia tăng liên tục trong
những năm gần đây. Phần lớn bệnh nhân ung thư khi được phát hiện đã ở giai
đoạn cuối không chữa trị được, đa số bệnh nhân bị tử vong. Vì rất nhiều lí do
như: hút thuốc lá, môi trường sống bị ô nhiễm, thực phẩm không an toàn… nên
căn bệnh nguy hiểm này ngày càng trở nên phổ biến. Mặc dù đây là một căn
bệnh rất nguy hiểm nhưng nếu bệnh nhân được phát hiện sớm và được điều trị
theo những phác đồ thích hợp thì người bệnh vẫn có cơ hội được cứu sống, thậm
chí là khỏi bệnh. Ngoài những phương pháp chẩn đoán ung thư truyền thống
như: chụp hình phổi bằng X_quang, chụp CT Scan phổi….các nhà khoa học
đang nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra cách chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh
ung thư. Sự phát triển như vũ bão của ngành sinh học phân tử đã mở ra một
hướng mới trong nghiên cứu Sinh_Y_Dược học. Việc tìm ra những chỉ thị sinh

học đã giúp cho các bác sĩ chẩn đoán và phát hiện bệnh một cách nhanh chóng,
có độ chính xác cao hơn. Các chỉ thị sinh học có liên quan đến chẩn đoán bệnh
ung thư cũng đang được quan tâm. Trong đo, Cyfra21-1 là một chỉ thị có độ
nhạy tương đối cao đối với ung thư phổi và đang được nghiên cứu.
Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Định lượng kháng nguyên
Cyfra 21-1 bằng kỹ thuật Real-time PCR”. Để từ đó nghiên cứu và tạo ra một
bộ Kít định lượng để có thể chẩn đoán Ung thư phổi một cách nhanh chóng, có
độ chính xác cao.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
3
3
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1.Ung thư phổi
1.1.1. Khái niệm chung về ung thư phổi
Ung thư phổi còn được gọi là ung thư phế quản – phổi nguyên phát, gây ra do tế
bào ung thư phát triển từ biểu mô phế quản (hiếm khi phát triển từ biểu mô phế
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
4
4
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
nang). Ung thư phổi khi đã phát hiện được thường là một khối rắn chắc có đường
kính từ 2- 10cm, thậm chí còn lớn hơn. Mặt ngoài khối u thường gồ ghề, nhiều
múi, nhăn nhúm. Mặt cắt khối u thường đồng nhất, hay có mầu trắng như tổ chức
não.
1.1.2. Phân loại ung thư phổi
Tùy thuộc vào hình dạng quan sát được dưới kính hiển vi mà người ta phân chia
ung thư phổi thành hai loại chính: ung thư phổi tế bào nhỏ và ung thư phổi
không phải tế bào nhỏ. Mỗi loại ung thư phát triển theo những cách khác nhau và
được điều trị theo những phác đồ điều trị khác nhau.

- Ung thư phổi tế bào nhỏ (small_cell carcinoma) chiếm khoảng 20% trong số
các bệnh ung thư phổi, loại này thường phát triển ở phế quản – phổi (không ở
ngoại vi phổi). Mặc dù tế bào ung thư là những tế bào nhỏ, nhưng chúng phát
triển rất nhanh và tạo thành những khối u lớn, có khả năng lan rất xa trước khi có
triệu chứng lâm sàng. Nhiều trường hợp khi phát hiện không thể mổ được nữa,
tử vong nhanh. Đây là loại ung thư có quan hệ mật thiết với thuốc lá và là loại
ung thư ác tính nhất.[3]
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
5
5
Hình 1: Ung thư phổi
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
- Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (non small _cell carcinoma) chiếm
khoảng 80% trong số các bệnh ung thư phổi, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ
thường gặp hơn ung thư phổi tế bào nhỏ. Nó thường phát triển và lan chậm hơn
ung thư phổi tế bào nhỏ. Có ba loại ung thư phổi không phải tế bào nhỏ chủ yếu,
chúng được đặt tên theo loại tế bào mà từ đó ung thư phát triển.[3]
+ Ung thư tế bào tuyến (adenocarcinoma, AC): xuất phát từ tế bào tuyến
nhầy trong thành phế quản, chiếm tỷ lệ khoảng 30-45% trong các loại ung thư
phổi. Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở phụ nữ và những người không hút
thuốc.[3]
+ Ung thư tế bào sừng (squamous_cell carcinoma; SCC): hay xuất hiện ở phế
quản lớn và làm chít hẹp lòng phế quản.Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở
nam giới, chiếm tỷ lệ khoảng 30-35% trong các loại ung thư phổi.[3]
+ Ung thư tế bào lớn (large_cell carcinoma; LCC): hình thành gần bề mặt
phổi, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% trong các loại ung thư phổi.[3]
1.1.3. Triệu chứng của bệnh ung thư phổi
Những người mắc bệnh ung thư phổi thường có các triệu chứng sau:
- Ho không khỏi và ngày càng nặng hơn.
- Thường xuyên thấy đau ngực.

- Ho ra máu.
- Khó thở, ngạt mũi, khản giọng.
- Phù nề vùng mặt và cổ.
- Mệt mỏi.
- Mất cảm giác ngon miệng, sút cân.
- Thường xuyên bị viêm phổi và viêm phế quản.
1.1.4. Chẩn đoán bệnh ung thư phổi
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
6
6
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Khi người bệnh bị nghi ngờ mắc ung thư phổi, các bác sĩ sẽ xem xét tiền sử
người bệnh, tiền sử hút thuốc, tiếp xúc với các chất ở môi trường tự nhiên và môi
trường lao động, các yếu tố di truyền… Sau đó, các bác sĩ có thể cho chụp
X_Quang lồng ngực, xét nghiệm tế bào trong đờm (quan sát dưới kính hiển vi
những tế bào lấy từ mẫu dịch nhầy ở phổi khi ho), đây là một xét nghiệm đơn
giản mà có thể có ích cho việc phát hiện ra bệnh ung thư phổi. Ngoài ra, con có
thể sử dụng kĩ thuật Sinh thiết (lấy một mẫu mô nhỏ ở phổi để quan sát dưới
kính hiển vi. Qua đó có thể cho biết một người có bị ung thử phổi hay không).
Một số thủ thuật dùng để lấy mẫu bệnh phẩm: nội soi phế quản, chọc hút bằng
kim, chọc dịch màng phổi, mở lồng ngực… Hiện nay, còn có thêm các xét
nghiệm mẫu máu, sử dụng các chỉ thị như Cyfra 21-1 để chẩn đoán bệnh.[1]
1.1.5. Các nguyên nhân dẫn đến bệnh ung thư phổi
Các công trình nghiên cứu hiện nay chưa cho biết chính xác nguyên nhân gây ra
ung thư phổi. Tuy vậy, người ta cũng xác định được những yếu tố gắn liền với
quá trình phát sinh bệnh như: hút thuốc lá, tiếp xúc nhiều với các hóa chất độc
hại như amiang, niken….
1.1.5.1. Nghiện hút thuốc lá, thuốc lào
Trong khói thuốc lá có chứa các chất Hydrocacbua thơm nhiều vòng, trong số đó
độc nhất là chất 3,4 benzopyrene với hàm lượng 0.5 µg/1 điếu thuốc lá

(P.Freour, 1979). Chất này đóng vai trò quan trọng trong phát sinh ung thư phổi.
Ngoài ra trong khói thuốc lá còn chứa các chất gây ung thư khác như
nitrosamine, benzanthracene. Các chất này cũng là nguyên nhân gây ra bệnh Ung
thư phổi.
Trong khóa họp vào tháng 11 năm 1982 tại Geneve, các chuyên gia về ung thư
phổi đã thống nhất kết luận rằng 80-90% nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi là
do hút thuốc lá. Tại Việt Nam, theo thống kê trên 389 bệnh nhân mắc ung thư
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
7
7
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
phổi đã được phẫu thuật thì: 70% số bệnh nhân có hút thuốc lào, 52% hút thuốc
lá, 10,49% hút cả thuốc lá và thuốc lào. Những người hút các loại khác và những
người hít phải khói thuốc lá (hút thuốc lá thụ động) cũng có nguy cơ tương tự.
Ngừng hút thuốc lá sẽ làm giảm đáng kể khả năng mắc ung thư phổi.
1.1.5.2. Radon
Radon là một chất khí phóng xạ không màu, không mùi và không nhìn thấy bằng
mắt thường. Trong tự nhiên radon có trong sỏi đá. Nó có thể làm tổn hại tới phổi
và từ đó có thể dẫn đến ung thư phổi. Những người làm việc trong hầm mỏ có
thể tiếp xúc với khí radon. Ở một số vùng ở Mỹ, người ta còn tìm thấy khí radon
ở trong những ngôi nhà.
1.1.5.3. Amiang
Amiang là tên gọi của một nhóm các chất khoáng, chúng tồn tại trong tự nhiên
dưới dạng sợi và được sử dụng trong một số nghành công nghiệp. Amiang có hai
nhóm chính là nhóm amphibole và nhóm serpentine. Nhóm amphibole khi hấp
thụ qua đường hô hấp và lưu lại trong phổi sẽ rất khó bị đào thải ra ngoài. Các
sợi thuộc nhóm amphibole là nguyên nhân chính gây ra các bệnh ung thư phổi, u
trung biểu mô.
1.1.5.4. Nghề nghiệp
Các thống kê bệnh học cho thấy, chất phóng xạ đóng vai trò quan trọng trong

phát sinh bệnh ung thư. Những người thường xuyên tiếp xúc với các chất phóng
xạ, niken, cromat, amian và các chất sinh ra do chưng cất hắc ín thường dễ bị
ung thư. Các chất này cũng là nguyên nhân dẫn đến Ung thư phổi ở những người
không hút thuốc (chiếm khoảng 15-20%).
Nghiên cứu của Doll (1958) cho thấy: công nhân làm việc trong công nghiệp
niken bị chết do Ung thư phổi là 26%, cao hơn 9 lần so với những công nhân làm
việc trong các ngành công nghiệp khác.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
8
8
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
1.1.5.5. Môi trường
Các nhà nghiên cứu đã tìm ra mối liên kết giữa bệnh ung thư phổi và sự phơi
nhiễm với một số chất gây ô nhiễm môi trường không khí nhất định (ví dụ: các
sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình đốt dầu Diezen và những nguyên liệu hóa
thạch). Tuy nhiên, mối quan hệ này vẫn chưa được xác định một cách rõ ràng và
vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu.
Nhiều thống kê cho thấy, tỉ lệ mắc ung thư phổi ở các thành phố công nghiệp,
đặc biệt là các thành phố có ngành công nghiệp hóa chất cao hơn hẳn so với các
vùng nông thôn. Trong bầu khí quyển của các thành phố này có chứa nhiều chất
độc hại như benzopyren… Các chất này kích thích và gây ra phản ứng với lớp
niêm mạc của đường hô hấp làm cho quá trình tiết chất nhầy bị chậm lại, sau đó
biểu mô bị bong ra, rồi lại được tái sinh. Những chu kì như vậy liên tiếp diễn ra
đã kích thích sự tăng sản của tế bào đáy, dị sản của tế bào biểu mô đẫn đến sự
hình thành và phát triển của các tế bào ung thư.
1.1.5.6. Các yếu tố khác
Ngoài những nguyên nhân trên, các nhà khoa học còn phát hiện thấy virus là
nguyên nhân gây Ung thư phổi ở khỉ. Điều này đặt ra câu hỏi: liệu ung thư phổi
có phải do virus gây ra không? Đây vẫn là một ẩn số lớn đối với các nhà khoa
học.

Tiền sử bản thân người bệnh cũng là một nguyên nhân gây ung thư phổi. Một
người đã mắc ung thư phổi một lần có nguy cơ mắc ung thư phổi lần hai cao hơn
so với một người chưa bao giờ mắc bệnh ung thư phổi.Bỏ hút thuốc sau khi được
chẩn đoán ung thư phổi có thể ngăn ngừa nguy cơ bị ung thư phổi lần hai.
Các nhà nghiên cứu vẫn tiếp tục tìm hiểu những nguyên nhân gây ra bệnh ung
thư phổi và tìm kiếm những cách thức để phồng chống căn bệnh này. Chúng ta
đã biết, cách tốt nhất để phòng chống bệnh ung thư phổi là bỏ hút thuốc lá, càng
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
9
9
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
bỏ hút thuốc lá sớm thì càng tốt. Thậm chí, nếu bạn đã hút thuốc lá trong một
thời gian dài thì việc bỏ hút thuốc lá cũng vẫn không bao giờ là quá muộn.
1.2. Kháng nguyên Cyfra 21-1
1.2.1. Kháng nguyên
1.2.1.1. Định nghĩa
Kháng nguyên được định nghĩa là một chất tương tác với các phân tử kháng thể
và thụ thể kháng nguyên trên các tế bào lympho. Một chất gây miễn dịch là một
kháng nguyên được cơ thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phản
ứng miễn dịch thích ứng. Để đơn giản hóa, kháng nguyên và chất gây miễn dịch
đều được xem là kháng nguyên.[2,3]
1.2.1.2. Bản chất hóa học của kháng nguyên
Về bản chất hóa học, kháng nguyên là những phân tử protein có khối lượng phân
tử lớn (kể cả các protein cộng hợp như các glycoprotein, lipoprotein và
nucleoprotein) và các polysaccharide (kể cả lipopolysaccharide). Các kháng
nguyên protein và polysaccharide này được tìm thấy trên bề mặt của virus, tế
bào vi khuẩn, nấm, đơn bào và tế bào người.[3]
1.2.1.3. Nguồn gốc kháng nguyên
1.2.1.3.1. Kháng nguyên ngoại sinh
Kháng nguyên ngoại sinh là kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài do:

hít, ăn, tiêm. Bằng quá trình nhập nội bào hoặc thực bào, các kháng nguyên này
được đưa vào tế bào trình diện kháng nguyên (ACP) và được xử lí thành các
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
10
10
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
mảnh nhỏ. Sau đó các ACP trình diện các mảnh nhỏ này cho tế bào Lympho T
giúp đỡ (CD4+) bằng cách dung phân tử phù hợp mô loại II trên bề mặt của
chúng. Một số tế bào Lympho T đặc hiệu cho phức hợp peptide: MHC. Chúng
trở nên hoạt hoá và bắt đầu tiết Cytokine. Cytokine là các chất có khả năng hoạt
hoá Lympho bào T độc tế bào (CLL), tế bào Lympho B tạo kháng thể, đại thực
bào và các tế bào khác.
1.2.1.3.2. Kháng nguyên nội sinh
Kháng nguyên nội sinh là các kháng nguyên được sản xuất bên trong tế bào, là
kết quả của quá trình chuyển hoá tế bào bình thường, hoặc do nhiễm khuẩn nội
bào hay nhiễm virus. Sau đó các mảnh kháng nguyên được trình diện trên bề mặt
tế bào trong phức hợp phân tử phù hợp mô loại I. Nếu tế bào Lympho T CD8+
độc tế bào nhận ra chúng, các tế bào Llympho T này bắt đầu tiết các loại độc tố
khác nhau gây ly giải hoặc chết theo chương trình (apoptosis) tế bào bị nhiễm.
Để giữ tế bào độc tế bào khỏi giết nhầm các tế bào vốn chỉ sản xuất protein của
chính nó, các tế bào lympho T tự đáp ứng được loại ra khỏi quá trình miễn dịch
qua cơ chế dung nạp trung ương (cũng được biết là quá trình chọn lọc âm tính
xảy ra ở tuyến ức). Chỉ những Lympho bào T độc tế bào nào không phản ứng
với peptide của chính nó (peptide này được trình diện trong tuyến ức qua phân tử
MHC loại I) mới được phép vào máu.
Có một ngoại lệ không thuộc ngoại sinh lẫn nội sinh được gọi là trình diện chéo.
1.2.1.4. Kháng nguyên khối u
Kháng nguyên khối u là các kháng nguyên được trình diện bởi các phân tử MHC
I trên bề mặt tế bào khối u. Đôi khi các kháng nguyên này chỉ được trình diện
bởi các tế bào khối u và không có ở tế bào thường. Trong trường hợp này, chúng

được gọi là kháng nguyên đặc hiệu khối u và thường là kết quả của một đột biến
đặc hiệu cho khối u. Phổ biến hơn, các kháng nguyên này được trình diện ở tế
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
11
11
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
bào khối u lẫn tế bào thường, khi đó chúng được gọi là kháng nguyên liên hệ
khối u. Nếu lympho bào T độc bào nhận ra kháng nguyên này, chúng có thể tiêu
diệt tế bào khối u trước khi tế bào khối u tăng sinh và di căn.
Kháng nguyên khối u cũng có thể có trên bề mặt khối u ở dạng thụ thể bị đột
biến. Trong trường hợp này chúng bị nhận diện bởi tế bào B.
1.2.1.5. Các loại kháng nguyên
-Miễn dịch nguyên: kháng nguyên loại này kích thích đáp ứng miễn dịch khi
được đưa vào trong cơ thể. Miễn dịch luôn luôn là một đại phân tử (protein,
polysaccharide). Khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của nó phụ thuộc vào
tính lạ đối với vật chủ, kích thước phân tử, thành phần hoá học và tính không
đồng nhất (vd: phân tử protein chứa nhiều loại amino axit khác nhau).
-Dung nạp nguyên: kháng nguyên loại này kích thích tình trạng không đáp
ứng miễn dịch đặc hiệu do hình dạng phân tử của nó. Khi thay đổi hình dạng, nó
có thể trở thành miễn dịch nguyên.
-Dị ứng nguyên: đây là chất gây phản ứng dị ứng. Chúng có thể xâm nhập
vào cơ thể qua nhiều con đường như: ăn, hít, tiêm hoặc tiếp xúc với da.
Tế bào trình diện với kháng nguyên của chúng qua phân tử phù hợp mô. Các tế
bào miễn dịch khác nhau có thể được hoạt hoá tuỳ thuộc vào kháng nguyên được
trình diện và loại phân tử phù hợp mô.
1.2.2. Kháng nguyên Cyfra 21-1
Trên thế giới hiện nay có khá nhiều chỉ thị sinh học liên quan đến ung thư phổi,
trong đó các nhà khoa học đang rất quan tâm đến một chỉ thị mới, có độ nhạy
cao với ung thư phổi là Cyfra 21-1 nằm trong nhóm chỉ thị Cytokeratin, một cấu
trúc trong bộ khung tế bào.

1.2.2.1. Cytokeratin
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
12
12
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Cytokeratin thuộc họ sợi trung gian, đặc biệt hữu ích trong chẩn đoán bất thường
ở tế bào, chẳng hạn như ung thư. Bởi vậy, các nhà ung thư học hiện nay đang
tích cực nghiên cứu kỹ hơn về cấu trúc và vai trò của Cytokeratin, nhằm tìm ra
giải pháp chống lại sự hoành hành của căn bệnh toàn cầu – Căn bệnh ung thư.
Cấu trúc sợi đã được quan sát trong nhân và tế bào chất từ rất lâu. Nhưng chỉ
ngần đây, những kiến thức về chức năng thực sự của bộ khung tế bào mới được
tìm hiệu cặn kẽ và chi tiết. Ở tế bào nhân chuẩn, bộ khung tế bào được tạo thành
từ 3 loại cấu trúc sợi, khác nhau về hình thái: vi sợi (microfilament), sợi trung
gian (intermidiatefilament) và vi ống (microtubules). Bộ khung xương tế bào
hợp nhất được hình thành từ hệ thống 3 loại sợi là yếu tố then chốt trong một quá
trình như phân bào, vận động và tương tác tế bào với tế bào.
Trong cấu trúc sợi, họ protein sợi trung gian là phức tạp nhất, bao gồm vài trăm
thành viên khác nhau. Dựa trên những đặc điểm như sự tương đồng về trình tự
và cách biểu hiện, người ta phân loại chúng thành một vài nhóm. Sợi trung gian
nhóm I và II tạo thành Cytokeratine (theo thứ tự là các protein axit và bazo),
trong khi đó sợi trung gian nhóm III gồm các protein axit dạng sợi desmin,
vimentin và glial. Loại IV bao gồm các sợi protein thần kinh (NF-L, NF-M và
NF-H) và internexin, còn protein nhóm V được gọi là các lamin nhân (chỉ cở
nhân tế bào). Các protein cytokeratin còn lại đôi khi được xếp vào nhóm VI,
gồm có felensin và phakinin.
Cytokeratin biểu mô (sợi trung gian nhóm I và II) được hình thành trong quá
trình phát sinh và có liên quan gần gũi về mặt sinh hóa và miễn dịch. Ngày nay,
hơn 20 loại Cytokeratin khác nhau đã được biết đến và được chia thành các
nhóm I và II dựa vào tính tương đồng trình tự. Các Cytokeratin từ 1-8 tạo thành
nhóm II (53-68 kDa, các thành phần protein trunng tính đến bazo), còn

Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
13
13
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Cytookeratin 9-20 tạo thành nhóm I (40-56 kDa, các protein axit), trong đó các
Cytokeratin 8, 18, 19 có nhiều nhất ở các tế bào biểu mô đơn giản.
Các Cytokeratin khi giải phóng khỏi các tế bào đang tăng sinh hoặc chết theo
chương trình, tạo ra các chỉ thị hữu ích cho khối u biểu mô ác tính, phản ánh rõ
nét hoạt động của tế bào. Những chỉ thị này xuất hiện đặc trưng cho các
Cytokeratin nhất định và sự giải phóng tiểu đơn vị của chúng diễn ra liên quan
đến apoptosis.[9,11,13,14]
1.2.2.1.1. Cấu trúc chung của một Cytokeratin
Một Cytokkeratin điển hình bao gồn 3 vùng: vùng đầu N (không xoắn), vùng
trung tâm (chủ yếu có cấu trúc xoắn) và đầu C (không xoắn).
Phần xoắn ở vùng trung tâm (chủ yếu là cấu trúc xoắn alpha) gồm 300-320 axit
amin có tính bảo tồn về trình tự và được chia thành 4 vùng khác nhau: 1A, 1B,
2A và 2B. Thành phần axit amin của cá vùng xoắn được bảo toàn về kích thước
và chứa các trình tự axit amin lặp lại ở phần dư. Các đoạn xoắn tách biệt nhau
nhờ các vùng liên kết ngắn hơn là L1, L1-2 và L2.[9,11,13,14,15]
1.2.2.1.2. Biểu hiện của Cytokeratin
Cytokeratin biểu hiện khác nhau ở các dạng tế bào biểu mô, ở quy mô phát triển
và quá trình biệt hóa của các mô. Trong suốt quá trình biến đổi của tế bào từ bình
thường thành tế bào ác tính, đặc tính của Cytokeratin thường được duy trì. Ưu
điểm này làm cytokeratin được ứng dụng như các chỉ thị khối u. Những biến đổi
sau khi dịch mã của các vùng ở trung tâm rất hiếm thấy, nhưng những biến đổi
này xuất hiện khá nhiều ở vùng đầu N và C, bao gồm sự phosphoryl hóa,
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
14
14
Hình 2: Cấu tạo của Cytokeratin

Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
glycosyl hóa và sự vận chuyển glutamine hóa. Những biến đổi này làm tăng tính
tan và gây ra sự sắp xếp lại các sợi.
Trong bộ khung, Cytokeratin là điển hình cho tính tan rất thấp, nhưng khi lưu
thông người ta nhận thấy rằng các Cytokeratin đều bắt nguồn từ các sợi protein
nguyên vẹn bị biến tính một phần tạo thành các phức hệ nhỏ hoặc các polymer
protein lớn. Các phân tử Cytokeratin nguyên vẹn không tham gia trong lưu
thông. Thời gian bán hủy của sợi Cytokeratin trong lưu thông khoảng 10-15h,
phụ thuộc vào kích thước sợi. Quá trình giải phóng sợi Cytokeratin tan vào lưu
thông diễn ra rất phức tạp và chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn.
Trong lúc giải phóng tự khối u, có thể nhận ra Cytokeratin với một lượng lớn
trong dịch thể gồm: máu, nước tiểu, dịch tế bào và dịch màng phổi. Thông
thường trong các cá thể khỏe, nông độ Cytokeratin lưu thông rất thấp. Nồng độ
tăng một cách đặc biệt trong những người bệnh có bệnh Ung thư biểu mô.[10]
1.2.2.2. Cyfra 21-1
Cyfra 21-1 là một phân đoạn của cytokeratin 19 (đặt tên theo chữ viết tắt của
cytokeratin fragment) tiết ra mạnh khi tế bào biểu mô phổi tăng sinh bất thường.
Cytokeratin 19 có cấu trúc giống các cytokeratin khác với kích thước khoảng 40
kDa, gồm 400 axit amin. Gene mã hóa cho cytokeratin 19 nằm trên nhiễm sắc
thể 17 có kích thước 4667bp với 6 exon mã hóa cho mARN kích thước 1382bp.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
15
15
Hình 3: Sơ đồ gene mã hóa cho Cytokeratin 19
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Fujita.J và các cộng sự cho rằng, sở dĩ cytokeratin 19 (40kDa) mất một phần đầu
C để trở thành Cyfra 21-1 (37kDa) có liên quan đến vị trí Met-Asp nhậy cảm với
một số protease.[12,16]
1.3. Kháng thể
1.3.1. Đinh nghĩa

Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ
thể tấn công các tác nhân gây bệnh. Kháng thể là các Immunoglobiulin (có bản
chất glycoprotein), do các tế bào Lympho B, các tương bào (biệt hoá từ Lympho
B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ.
(Vd: các vi khuẩn hoặc virut).[3]
1.3.2. Cấu tạo
Các kháng thể có cấu trúc hình chữ Y, có hai bộ “cành” gắn vào một “thân”.
Các đầu của Y (Fab) được gọi là các vùng biến đổi, ở phía đầu các cành chứa các
vùng gắn kết kháng nguyên (vùng quyết định bổ trợ, CDR) và thân (Fc) là một
vùng hằng định. Các vùng hằng định chứa “lẫy khởi động” chức năng phản ứng
lại kích thích bằng việc gắn kết các phức hệ của tế bào khác của hệ miễn dịch.
Kháng thể thực hiện các chức năng cơ bản như liên kết đặc hiệu với kháng
nguyên, hoạt hoá các bổ thể, hoạt hoá các tế bào miễn dịch.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
16
16
Hình 4: Cấu tạo của kháng thể
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
1.3.3. Phân loại kháng thể
1.3.3.1. Kháng thể đa dòng
Là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một
kháng nguyên cho trước. Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng
thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên. Đáp ứng như vậy gọi
là đa dòng. Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác
nhau
1.3.3.2. Kháng thể đơn dòng
Là những kháng thể được tổng hợp từ một dòng tế bào Lympho B. Chúng chỉ
nhận biết một epitope đặc hiệu trên một kháng nguyên cho sẵn.[3]
Để tăng hiệu quả điều trị của các kháng thể đơn dòng, các nhà khoa học đã
kết hợp các gene tái tổ hợp mã hoá các kháng thể đơn dòng có vùng gắn kết với

cùng một vị trí (một epitope) của kháng nguyên. Các kháng nguyên đơn dòng có
thể là:
- Kháng thể đơn dòng chuột
- Kháng thể đơn dòng khỉ
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
17
17
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
- Kháng thể đơn dòng gà
- Kháng thể đơn dòng người
1.3.3.3. Phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng
- Kỹ thuật hybridoma
- Tạo mảnh kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật gene
- Kỹ thuật phage display (được dùng để tạo kháng thể đơn dòng dạng đơn
chuỗi_scFv).
1.3.3.4. Kháng thể đơn chuỗi (scFv)
Cùng với sự phát triển của công nghệ sản xuất kháng thể, các mảnh kháng
thể được tạo ra bằng kỹ thuật sinh học đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Kháng
thể đơn chuỗi (scFv) là một trong những kháng thể phổ biến nhất.
Kháng thể đơn chuỗi bao gồm vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (V
L
và V
H
) của phân tử kháng thể hoàn chỉnh được nối với nhau bằng linker
polypeptide linh động.
So với kháng thể đơn dòng thì kháng thể đơn chuỗi (scFv) có một số ưu điểm
sau:
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
18
18

Hình 5: Cấu tạo của kháng thể và kháng thể đơn chuỗi
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
- Chúng dễ dàng được sản xuất với số lượng lớn và giá thành.
- Kích thướng nhỏ của chúng cho phép chúng dễ dàng xâm nhập vào mô và khối
u rắn, có tính hướng đích cao.
- Kháng thể đơn chuỗi dễ dàng được dung hợp với một protein khác như enzym
hap protein phát huỳnh quang để tạo thành phân tử hoàn chỉnh dùng cho những
thử nghiệm miễn dịch.
1.4 Phương pháp Real-time PCR
1.4.1. Kỹ thuật PCR
1.4.1.1. Định nghĩa
PCR là tên gọi tắt của phản ứng chuỗi polymedase (Polymedase Chain Reaction =
PCR) để nhân các bản của đoạn DNA trong ống nghiệm.
1.4.1. 2. Nguyên lý
Phản ứng chuỗi polymedase (PCR) được Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên và đã
góp phần đem lại cho Mullis giải thưởng Nobel y học và sinh lý năm 1993. PCR
là quá trình tương đối đơn giản cho phép nhân nhanh 1 số lượng không hạn chế
nguyên bản 1 đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn. Quá trình
nhân bản bằng Enzyme này bao gồm 3 bước lặp lại nhiều lần.
- Bước 1: Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng cao
nhiệt độ lên 94-95
o
C trong khoảng thời gian ngắn.
- Bước 2: Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 40-60
o
C. Hai
đoạn mối là các oligonucletid dài khoảng 18-24 bazo sẽ tiếp hợp theo nguyên tắc
bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.
- Bước 3: Phản ứng polymedase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai
phản ứng DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử

ban đầu.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
19
19
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc thù, phản ứng tổng hợp được thực hiện ở
72
o
C
Loại polymedase thường dùng trong PCR là loại chịu nhiệt (Taq DNA
polymedase) được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus hoặc chủ yếu là
enzyme tái tổ hợp.
Như vậy, mỗi vòng phản ứng sẽ có 2 lần số lượng DNA của đoạn DNA cần nhân
được tổng hợp, hệ số nhân bản tính theo số chu kỳ n là 2
n
.[6]
Vd: Sau 20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản của 1 đoạn DNA được nhân lên.
1.4.2. Kỹ thuật Real-time PCR
1.4.2.1. Nguyên lý
Real-time PCR là PCR tại thời điểm thực, nghĩa là quá trình khuếch đại DNA
đang diển ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp. Real-time PCR gồm
hai quá trình diễn ra đồng thời:
- Quá trình khuếch đại DNA bằng PCR
- Đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành.
Hệ thống Real-time PCR bao gồm máy chu trình nhiệt (PCR) được nối với
máy phát hiện quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Nguyên lý chủ yếu của
Real-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh
quang (fluorescent reporter). Hàm lượng sản phẩm PCR bắt đầu tăng lên cao từ
chu kỳ ngưỡng (C
T

: threshold cycle) tương quan chặt chẽ với hàm lượng DNA
đích ban đầu. Người ta thường sử dụng 3 dạng đầu dò để định lượng DNA bằng
Real-time PCR:
- Các chất liên kết DNA như: SYBA Green…
- Các đầu dò thủy phân như: TaqMan, Beacons, Scorpions….
-Các loại đầu dò lai như: Light Cycler…
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
20
20
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Chu kỳ ngưỡng: là chu kỳ mà tại đó phần mềm máy tính bắt đầu đọc được
ΔRn, deltaRn là tham sử dụng trong định lượng. Giá trị C
T
là 40 hay hơn 40 có
nghĩa là không diễn ra sự khuếch đại và không thể tính toán được lượng sản
phẩm.[6]
1.4.2.2. Cơ chế hoạt động của Real-time PCR
Số chu kỳ PCR và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng tỷ lệ với lượng sản
phẩm khuếch đại trong ống.
Sự khuếch đại thể hiện qua 2 giai đoạn: giai đoạn một theo hàm mũ và giai đoạn
hai bão hoà không theo hàm mũ.
-Trong giai đoạn một, lượng sản phẩm PCR gần như được gấp đôi sau mỗi
chu kỳ. Khi phản ứng tiếp diễn, các thành phần phản ứng được sử dụng.
- Trong giai đoạn hai, một hay nhiều thành phần đã trở nên cạn kiệt, phản ứng
bắt đầu chậm lại và bước vào giai đoạn bão hoà.[6]
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
21
21
Hình 6: Đồ thị khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền
huỳnh quang

Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
1.4.2.3. Ưu điểm của Real-time PCR
Ưu điểm chính của Real-time PCR so với PCR truyền thống là cho phép xác
định số lượng bản sao khuôn mẫu ban đầu với sự chính xác và độ nhậy cao trong
một phạm vi biến thiên rộng. Kết quả của Real-time PCR có thể là kết quả định
tính (hiện diện hay vắng mặt một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản
sao DNA). Thêm vào đó, dữ liệu của Real-time PCR có thể được đánh giá mà
không cần phải điện di trên gel để kiểm tra, giúp tiết kiệm thời gian và gia tăng
số lượng thực hiện. Việc tiến hành và đánh giá dữ liệu trong một hệ thống ống
đóng kín giúp làm giảm nguy cơ ngoại nhiễm và loại bỏ những thao tác sau phản
ứng khuếch đại.
Real-time PCR sử dụng để định lượng DNA được gọi là PCR định lượng.[6]
CHƯƠNG II:
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Sinh phẩm
- Thư viện thực khuẩn thể Griffin.1 (Human Synthetic V
H
, v
L
scFv
Library)_Trung tâm nghiên cứu protein (Cambridge, Anh).
- Hyperphage
- Vi khuẩn E.coli chủng TG1.
- Kháng thể: Kháng thể cộng hợp kháng M13 (anti-M13 horseradish
peroxidase-conjugate, Amersham Biosciences, Pícâty, NJ, USA).
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
22
22
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01

- Kháng nguyên: Kháng nguyên Cyfra 21-1 (Phòng Công nghệ Tế bào Động
vật - Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa học Việt Nam).
- Mẫu máu do bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Phổi Trung Ương cung cấp.
- Cặp mồi:
+ CyfprobF: 5'-GGC GGT AGT GCA CTT GAG A-3'
+ CyfprobR: 5'-AAG GGT GAC AGG TGA GGA GA-3'
+ Probe N
o
115: GA CCC AGA
2.1.2. Hoá chất
Kháng sinh (Ampicilin, Kanamycine), cao nấm men, Tryptone, Agar,
Agarose, NaCl, TAE, PBS, TMB, H
2
SO
4
, PEG, ……
2.1.3. Trang thiết bị
- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, CHLB Đức).
- Máy Real-time PCR (Roche).
- Máy đo nồng độ Nanodrop.
- Máy đo ELISA.
- Máy xác định trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (ABI,
Mỹ).
- Máy lắc ổn nhiệt; Bể ổn nhiệt; Tủ lạnh (4
o
. -20
o
. -80
o
).

- Máy đo pH; Máy voltex; Tủ cấy vô trùng; Pipetman các loại.
- Các trang thiết bị khác thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm gene_Viện
Công nghệ Sinh học_Viện khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
23
23
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Các chủng vi sinh vật được nuôi cấy trong bình tam giác với thể tích từ 20-
50ml chứa 5-15 ml môi trường thích hợp cho từng loại.
Bình nuôi cấy được đặt trong máy lặc ổn nhiệt ở 37
o
C hoặc 30
o
C với tốc độ
220 vòng/phút.
2.2.2 Phương pháp tạo phage_DNA
2.2.2.1. Chuẩn bị
- Box cấy vô trùng
- Môi trường 2xTY
- Kháng sinh: Ampicilin
- Glucose 20 %
- Pipetman các loại
- Đèn cồn
- Ống phancol
2.2.2.2 Tiến hành
Các bước tiến hành phải được làm trong box cấy vô trùng để tránh bị nhiễm.
- Lấy 50ml môi trường 2xTY vào ống phancol;
- Bổ sung vào môi trường 100μg/ml Ampicilin và 1% glucose;

- Sau đó bổ sung tiếp vào môi trường 50μ phagemid;
- Nuôi lắc trong 2 giờ ở 37
o
C (đến khi OD
600
= o,5);
- Cho hyper phage vào với mật độ 1 vi khuẩn/20 hyper phage;
- Ủ trong nước 30 phút cở 37
o
C (không lắc);
- Ly tâm các tế bào nhiễm ở 3300g trong 10 phút;
- Loại bỏ dịch, thu phần cặn tế bào;
- Lấy 30 ml môi trường 2xTY, bổ sung 25μg/ml Kanamycine và 100μg/ml
Ampicilin;
- Hòa lại cặn tế bào thu được ở trên vào trong môi trường;
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
24
24
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
- Nuôi lắc qua đêm ở 30
o
C;
- Ly tâm dịch nuôi cấy qua đêm ở 10800g trong 10 phút;
- Thu dịch nổi chứa phage;
- Kết tủa các hạt phage bằng cách cho thêm 1/5 thể tích PEG/NaCl;
- Để ở 4
o
C trong ít nhất 1 giờ;
- Sau đó, ly tâm 10800g trong 30 phút;
- Loại bỏ dịch sau ly tâm, thu phần cặn;

- Hòa lại cặn trong 40ml H
2
0;
- Bổ sung thêm 8ml PEG/NaCl, trộn đều và để 20 phút ở 4
o
C;
- Ly tâm 10800g trong 30 phút, loại bỏ phần dịch và thu phần cặn;
- Hòa cặn trong 2,5 ml PBS;
- Ly tâm 11000g trong 10 phút để loại các mảnh vụn tế bào còn sót lại;
- Thu phần dịch nổi phía trên.
2.2.3. Phương pháp xác định nồng độ phage
- Lấy 10μl dịch phage ở trên để pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau: 10
-
2
,10
-4
,10
-6
,10
-8
,10
-10
;
- Chủng TG1 được nuôi trong khoảng 2 giờ đến khi đo OD
600
= 0,6. Lấy 490μl
dịch cho vào ống doff;
- Sau đó, bổ sung 10μl dịch phage pha loãng ở các nồng độ vào;
- Đem ủ 30 phút ở 37
o

C trong bể ổn nhiệt;
- Lấy 100μl dịch cấy trải trên đĩa thạch, để qua đêm trong tủ 37
o
C;
- Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa thạch;
Nồng độ phage= (a/b).(c/d)/m
Trong đó: a: số khuẩn lạc có trên đĩa thạch
b: thể tích dung dịch dùng để trải đĩa
c: thể tích dịch nuôi
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
25
25