TIỂU LUẬN:ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN BẰNG KỸ THUẬT RAPD-PCR pot

0

ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
WX








Đề tài:
ĐỊNH LOẠI SÁN LÁ GAN LỚN BẰNG KỸ
THUẬT RAPD-PCR




Sinh viên thực hiện: Giáo viên hướng dẫn:
Lê Thanh Vương TS Nguyễn Ngọc Hải

T.p Hồ Chí Minh, tháng 10 n

1



I. Đặt vấn đề
Sán lá gan lớn là một trong những ký sinh trùng nguy hiểm nhất đối
với người và gia súc (cừu, bò, dê và động vật nhai lại khác, lợn thỏ, hải ly,
chó, mèo và kangaroo.Hai loài thường ký sinh ở người và gia súc là F.
hepatica và F. gigantica thuộc giống Fasciola. Hai loài này giống nhau ở
nhiều đặc điểm hình thái, sinh thái, sinh học nên việc định loại chúng trên cơ
sở phân biệt hình thái rất dễ nhầm lẫn. Bệnh nhân khi phát hiện nhiễm sán lá
gan lớn vẫn không thể kết luận tác nhân gây bệnh là F. hepatica hay F.
gigantica.
Điều này có thể gây hậu quả nghiêm trọng, nhất là đối với F.
gigantica chưa thích nghi hoàn toàn với đời sống ký sinh ở người và một số
động vật khác, nên tỉ lệ sán phát triển đến trưởng thành rất thấp. Hơn nữa,
thời gian sán phát triển đến trưởng thành cũng khá dài và là thời kỳ gây bệnh
tích nặng cho chủ. Vì vậy phương pháp chẩn đoán bệnh sán lá gan lớn qua
tìm trứng sán là không thích hợp. Phương pháp chẩn đ
oán bệnh sán lá gan
lớn trên cơ sở miễn dịch là rất thích hợp. Vấn đề quan trọng hàng đầu là phải
xác định chính xác loài gây bệnh để có các chẩn đoán miễn dịch đặc hiệu và
tạo cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo để phòng trị sán lá gan lớn
cho cả người và gia súc.
Phương pháp RAPD-PCR dựa trên cơ sở phản ứng PCR với mồi ngẫu nhiên
(kích thước khoảng 10 nucleotide) giúp định loại sán lá gan dựa vào s

ự đa
hình các đoạn DNA được nhân bản.
II. Tổng quan tài liệu
1. Giới thiệu sán lá gan lớn
Sán lá gan lớn hình chiếc lá, có kích thước 30 x 10-12mm ở trâu bò. Sán ký
sinh trong đường mật trâu bò, nhưng trong nhiều trường hợp, chúng có thể
ký sinh lạc chỗ như trong cơ bắp, dưới da Trong cơ thể ký chủ như người
và ngựa, sán lá có thể được tìm thấy trong phổi, dưới da hay nơi khác.

2

Hình: Sán lá gan lớn

3



2. Sự phát triển và vòng đời của sán lá gan lớn
Sán trưởng thành đẻ trứng theo phân ra ngoài. Trứng sán lá gan lớn có
kích thước 140 x 80 mm. Trứng xuống nước, trứng sán lá gan lớn nở ra ấu
trùng lông và ký sinh trong ốc, phát triển thành ấu trùng đuôi, rời khỏi ốc và
bám vào các thực vật thủy sinh để tạo nang trùng bơi tự do trong nước.
Người hoặc trâu bò ăn phải thực vật thủy sinh hoặc uống nước lã có ấu trùng
sẽ bị
nhiễm sán lá gan lớn.



Hình: Sơ đồ phát triển và vòng đời của sán lá gan

Ấu trùng sán lá gan lớn chết ở nhiệt độ 60-70
0
C nhưng nếu chúng ta ăn rau
sống, hoặc ăn lẩu tái, trần tái chưa đủ nhiệt độ 40-50 độ C thì ấu trùng sán lá
gan vẫn sống được.
3. Đặc điểm bệnh sán lá gan lớn
Khi người bị nhiễm ấu trùng sán lá gan vào bộ phận tiêu hóa, ấu trùng
đó sẽ theo máu di hành đến gan và cư trú ở đó. Nhưng đối với một số trường

hợp, ấu trùng theo đường máu cư trú ở các cơ quan khác như
phổi, dưới da
thì chúng vẫn phát triển được thành sán lá gan. Sán lá gan lớn hấp thu chất
dinh dưỡng của người qua máu. Đối với người, việc chẩn đoán bệnh sán lá

4
gan lớn bằng phương pháp tìm trứng trong phân là khó vì chúng thường cư
trú ở các thùy gan. Tuy nhiên, 2-10% bệnh nhân có thể tìm thấy dấu vết sán
lá gan qua phân.

Còn đối với trâu bò sán lá gan cư trú trong ống mật. Do vậy, phương
pháp tìm trứng trong phân rất dễ dàng. Động vật nhai lại (trâu, bò, cừu ) bị
nhiễm sán lá gan là mãn tính. Khi bị nhiễm, chúng ít khi có triệu chứng sốt
mà biểu hiện chủ yếu là sút cân, gầy yếu.
Thông thường, động vật mắc bệnh này ở giai đoạn di hành của ấu
trùng sán lá gan lớn thường kéo theo các vi khuẩn hiếm khí dẫn đến nguy cơ
tử vong cao.
Do các loài độ
ng vật trên thường ăn cỏ ngoài đồng, uống nước ao hồ
nên tỷ lệ mắc sán lá gan rất cao. Theo con số điều tra của Viện Thú y Quốc
gia qua nhiều năm bằng phương pháp tìm trứng trong phân, trên các vùng
núi cao, tỷ lệ động vật ăn cỏ bị nhiễm sán lá gan chiếm từ 40- 90%. Số liệu
này cho thấy tỷ lệ nhiễm bệnh sán lá gan lớn ở động vật ăn cỏ rất cao.
Bệ
nh sán gan lớn gây tổn thất kinh tế nghiêm trọng do làm tổn thương
gan và giảm năng suất thịt, sữa.
4. Phòng tránh bệnh sán lá gan lớn
Đối với người, để phòng tránh bệnh sán lá gan lớn, cần rửa sạch các
loại rau thủy sinh (rau trồng trong nước), ăn chín, uống sôi.
Đối với trâu, bò, dê hàng năm cần phải cho tẩy giun sán. Cần xử lý phân

của của những loài động vật này trước khi sử dụng làm phân bón lót bằng
cách mang ủ trướ
c khi bón trực tiếp cho đồng ruộng và rau màu nhằm hạn
chế ấu trùng Fasciola gigantica phát triển và bám vào rau màu.
5. Giới thiệu kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase chain reaction) là phản ứng nhân bản trình tự DNA
quan tâm trong test tube (Nguyễn Thái Thủy, 2004).

5
Phn ng PCR c thc hin trong mỏy luõn nhit, lp li khong
30 50 chu k. Phn ng PCR gm ba chu k nh hỡnh 5 vi cỏc thnh
phn phn ng nh sau:
Taq polymerase
dNTP
Primer
DNA mu
Buffer
Kt qu phn ng c c qua bng in di c nhum vi Ethidium
bromide.
ADN ủớch
1 Bieỏn tớnh (94
o
C)
2 Baột caởp (55-65
o
C)
3 Keựo daứi (72
o
C)
1

2
3
4
n

Hỡnh 5: Cỏc giai on ca phn ng PCR
6. Gii thiu k thut in di trờn gel agarose

S di chuyn ca cỏc phõn t mang in trong in trng gi l in di.
in di hay in di trờn gel (electrophoresis hay gel electrophoresis) ỏp
dng trong sinh hc phõn t l mt k thut phõn tớch cỏc phõn t DNA,
RNA hay protein da trờn cỏc c im vt lý ca chỳng nh kớch thc,
hỡnh dng hay im ng in tớch (isoelectric point). K thut ny s dng
mt dung dch m (buffer) d
n din v to in trng u, mt bn gel
(thng l agarose hay polyacrylamide) úng vai trũ l th nn phõn tỏch
cỏc phõn t, v cỏc cht nhum khỏc nhau (ethidium bromide, bc, xanh
Coomassie) phỏt hin v trớ cỏc phõn t trờn gel sau khi in di.

6
DNA hay RNA thường tích điện âm. Trong điện di trên gel, mẫu được cho
vào các giếng ở gần cực âm và DNA hay RNA sẽ di chuyển về phía cực
dương. sự di chuyển tỉ lệ nghịch với kích thước phân tử, phân tử càng nhỏ di
chuyển càng nhanh.
Điện di trên gel là phương pháp hữu dụng trong các phân tích sinh hoá học.

Hình: gel
Agarose: cấu tạo
mạng lưới cấu trúc ba chiều, cầu nối hydrogen giữa các
thành phần. Là polysaccharide tự nhiên được phân lập từ tảo biển, có kích

thước lỗ gel lớn thích hợp cho phân tách các phân tử có kích thước lớn và
điện di dựa trên độ tích điện.
Dùng để phân tách các protein > 500 kDa và các DNA có kích thước lớn
hơn 2000 bp.



7



Hình: Một số thiết bị điện di


7. Kỹ thuật RAPD-PCR
Các kỹ thuật phân tử như PCR và các biến thể của nó được sử dụng
cho việc chẩn đoán bệnh ký sinh và nhận dạng các ký sinh trùng, phát triển
kháng nguyên đặc hiệu cho các xét nghiệm huyết thanh học và nghiên cứu
các phản ứng miễn dịch ở người bệnh.
RAPD là viết tắt của Random Amplification of Polymorphic D
NA.
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những pimer
ngắn khoảng 10 cặp nucleotide đã biết trước trình tự khuếch đại DNA một
ngẫu nhiên.

Nguyên tắc: khi hai cá thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện
phản ứng RAPD-PCR ở điều kiện như nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn
DNA bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng nhau. Khi có đột
biến làm thêm hoặc mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên thì sản phẩm
khuếch đại sẽ khác nhau về số lượng đoạn DNA và chiều dài khác nhau của

các đ
oạn giữa các cá thể. Do đó kỹ thuật RAPD có thể phát hiện đột biến.
Kỹ thuật này giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội.
Quy trình thực hiện RAPD-PCR
- Ly trích DNA
- Lựa chọn mồi
- Tối ưu hoá mồi và thực hiện phản ứng PCR
- Chọn các primer khuếch đại ổn định nhất
- Điện di trên gel agarose
- So sánh kết quả giữa các mẫu
PCR thông thường:

8

Hình: Phản ứng PCR đã biết trình tự đoạn gene cần khuếch đại
Tuy nhiên, trong RAPD phân tích, trình tự mục tiêu (sẽ được khuếch
đại) là chưa biết. Mồi được thiết kế với một trình tự tùy ý, kích thước 10
nucleotide. Sau đó thực hiện một phản ứng PCR và chạy điện di trên gel
agarose để đọc kết quả nếu có các phân đoạn DNA được khuếch đại trong sự
hiện diện c
ủa mồi tùy ý.
Trong hình này mô tả một phản ứng RAPD, một đoạn lớn của DNA
được sử dụng làm mẫu trong một phản ứng PCR có chứa nhiều bản sao của
một mồi ngẫu nhiên duy nhất.




Hình: phản ứng RAPD-PCR
Trong ví dụ này, có 2 sản phẩm:

9
• Một sản phẩm được tạo bởi PCR khuếch đại trình tự DNA nằm ở giữa
cặp mồi 2 và 5.
• B là sản phẩm được tạo ra bởi PCR khuếch đại trình tự DNA nằm ở
giữa cặp mồi 3 và 6.
• Không có sản phẩm PCR là sản phẩm của cặp mồi ở vị trí 1 và 4 vì
hai mồi này quá xa nhau.
• Không có sản phẩm PCR được tạo ra bởi các mồi t
ại các vị trí 4 và 2
hoặc các vị trí 5 và 3 bởi vì các cặp primer không được định hướng
thích hợp.
Tìm sự khác nhau giữa các bộ gene sử dụng kỹ thuật RAPD
Nếu các mẫu DNA (gen) được thu nhận từ các nguồn khác nhau, có
thể sẽ có sự khác biệt trong trình tự DNA của hai mẫu.
Giả sử có một sự thay đổi trong trình tự mồi bắt cặp ở vị trí số 2:
Trong hình này, mồi không thể bắt cặp ở vị trí số 2, vì thế không tạo ra sản
phẩm, chỉ có sản phẩm B được tạo ra.
Khi chạy điện di sản phẩm 2 phản ứng RAPD ở trên, trên gel agarose, kết
quả như sau:

10

Sự khác biệt số band khi điện di sản phẩm RAPD cho phép phân biệt được
hai cá thể khác nhau, các giống khác nhau.

III. Vật liệu và phương pháp
1. Phân lập ký sinh trùng
Sán lá gan lớn Fasciola hepatica đã thu được từ gan của bò và cừu,
được rửa nhiều lần với phosphate-buffered saline (PBS) pH 7,4 và sau đó ủ

trong hệ đệm tương tự ở 37 ° C trong 3 giờ để loại bỏ hết vật chất của ký
chủ. Sau đó các ký sinh trùng được rửa sạch với PBS nhiều lần.


2. Chiết tách DNA
Việc khai thác của DNA được thự
c hiện theo các bước được mô tả
trước đó bởi KAPLAN et al., MC Manus và Bowles; Vargas et al Phương
pháp đã được chỉnh sửa như sau:
Các mẫu ký sinh trùng được đồng nhất trong một dung dịch phân giải
(8% triton 100X, 0,25 M Sucroza, 50 mm EDTA, pH 7,4). Dung dịch đồng
nhất được ly tâm 10000 vòng/ phút trong 10 phút, ở 4°C. DNA bộ gen được
tách ra bởi SDS-proteinase K, enzym này sẽ phá vỡ các polypeptide thành
các đơn vị nhỏ hơn, sau đó dễ dàng tách bởi phenol chloroform. DNA phục
hồi được hòa tan trong 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH 7,6 (Tris-EDTA
đệm) và RNA được loại bỏ bằ
ng cách ủ với RNAse ở 37 ° C trong 1h, sau
đó kết tủa lần thứ hai bởi phenol cloroform và ethanol.
Dịch huyền phù được bảo quản ở -20°C.
3. Lựa chọn mồi
Để tối ưu hóa các điều kiện PCR, ba mồi (5'-TCG TCG CATT -3
'(OSA09), 5'-AGC AGC AGGC -3' (OSA 10) và 5'-GGG TAA CGCC -3

11
'(OSA 11 )) đã được lựa chọn ngẫu nhiên để khuyếch đại DNA của Fasciola
hepatica có nguồn gốc ở bò và cừu.
4. Tối ưu hóa
Sự cần thiết tối ưu hóa các điều kiện là để việc khuếch đại có thể thu
nhận đầy đủ và tái bản nhiều band mẫu cho DNA bộ gen của mỗi ký sinh
trùng (5ng). Nồng độ DNA được xác định nhờ ultraviolet absorbance

spectrophotometry tại bước sóng 260nm. Lượng bức xạ tia tử
ngoại hấp thu
bởi dung dịch DNA tỷ lệ thuận với lượng DNA trong mẫu. Sự hấp thu tia tử
ngoại cũng được sử dụng để kiểm tra độ tinh sạch của DNA mẫu. Phản ứng
này được thực hiện trong một thể tích 50 μL chứa 10X dung dịch đệm (500
mM KCI, 200 mM Tris-HCl pH 8,4), 2,0 mM MgCI, 20,4 μm dNTPs
(Promega, Hoa Kỳ). Mỗi ống phản ứng có 2 đơn vị của Taq polymerase.
DNA được khuếch đạ
i trong 75 chu kỳ với một bước biến tính ở 94
o
C trong
5 giây, mồi bắt cặp lúc 36 ° C trong 30 giây, và bước kéo dài ở 72
0
C trong
10 giây.
5. Điện di sản phẩm PCR
Điện di trên gel agarose
1,4% agarose gel được nhuộm màu với bromua ethidium trước khi quan sát
và chụp ảnh. Nó được sử dụng như là chỉ thị trọng lượng phân tử một cái
thang 100 pb.
IV. Kết quả
Kết quả của nghiên cứu này cho thấy rằng mồi khác nhau cho các
đoạn DNA khác nhau (Bảng I). Những doạn khác nhau này đặc trưng cho
loài F. hepatica có nguồn gốc từ bò và cừu.


Các kích thước của các đoạn DNA của F.hepatica từ bò và cừu được khuếch
đại bằng mồi OSA-09 tương ứng khoảng 700 bp và bp 150 (Hình 1).

12

Sử dụng OSA-10 mồi, chỉ có doạn DNA (150 bp) từ F. hepatica trên cừu đã
được phát hiện, trong khi không có đoạn khuếch đại của F. hepatica trên bò
(Hình 2).


13
Cuối cùng, sau khi khuếch đại của mồi OSA-11, 2 đoạn ADN khoảng 200
và 400 bp đã thu được chỉ từ F. hepatica trên bò và không có band DNA của
F. hepatica trên cừu được phát hiện (hình 3).


V. Thảo luận
Việc xác định các loài gần gũi dựa trên đặc điểm hình thái có thể khó
khăn. Điều này đặc biệt là trường hợp cho các loài động vật thân mềm như
sán lá ký sinh. Tuy nhiên, tiến bộ gần đây trong sinh học phân tử, đặc biệt là
khuếch đại vùng ADN đặc trưng thông qua phản ứng PCR có thể cho phép
để phân biệt các có loài quan hệ gần gũi bằng cách so sánh DNA của chúng.
DNA prode cũng như PCR primer dự
a trên khu vực biến động của
chuỗi DNA ribosome đã được phát triển để phát hiện và định loại các loài
Fasciola.
Kỹ thuật RAPD-PCR cho phép khuếch đại của khu vực ngắn của bộ
gen của một sinh vật mà không có thông tin về trình tự trước, nên rất thuận
tiện trên các đối tượng mà bộ gen chưa được biết rõ. Kỹ thuật này có một
tiềm năng lớn trong phân biệt giống, phân biệt cá thể và lập b
ản đồ di truyền.
Trong nghiên cứu này, 3 mồi ngẫu nhiên đã cho các đoạn DNA có kích
thước khác nhau theo nguồn gốc các loài trên ký chủ khác nhau.
Phân biệt những đoạn đặc trưng cho F. hepatica có nguồn gốc từ bò và cừu.

Với primer OSA-09, một đoạn dài 150 bp DNA được thu được từ

14
F. hepatica trên cừu, trong khi một đoạn DNA độ dài 700 bp đã được xác
định từ F. hepatica trên bò. Các kết quả này tương đồng với báo cáo trước
đó. Từ đó kết luận rằng RAPD-PCR kỹ thuật có thể chứg minh về mối quan
hệ di truyền giữa Fasciola hepatica có nguồn gốc và cừu và cũng để xác định
cụ thể các loài giun sán ký sinh.
VI. Tài liệu tham khảo