Luận văn : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA part 3 pdf

26



Chƣơng 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả thu thập và phân lập mẫu vi khuẩn gây bệnh
Qua quá trình khảo sát thực tế tại các ruộng trồng rau, chúng tôi đã tiến hành lấy
mẫu và phân lập đƣợc tổng cộng 8 dòng vi khuẩn nhƣ sau:
Bảng 4.1 Danh mục các dòng vi khuẩn sử dụng trong đề tài

Tên mẫu
Nơi lấy mẫu
Cây kí chủ
1
CC1
Huyện Củ Chi
Cải ngọt
2
CC2
Huyện Củ Chi
Cải ngọt
3
CC3
Huyện Củ Chi
Cải ngọt
4
HM1
Huyện Hóc Môn
Cải ngọt

5
HM2
Huyện Hóc Môn
Cải ngọt
6
HM3
Huyện Hóc Môn
Cải ngọt
7
Q12 – 1
Quận 12
Cải ngọt
8
Q12 – 2
Quận 12
Cải ngọt
9
DC
vi khuẩn đối chứng
Xanthomonas axonopodis pv. citri
Bƣởi

Đốm bệnh do vi khuẩn
Đốm do bọ nhảy gây hại trên rau


27



Hình 4.1 Lá cải bị bệnh thu thập ngoài ruộng rau.











Hình 4.2 Vết bệnh trên lá cải thu thập ngoài ruộng chụp dƣới
kính hiển vi soi nổi.

Hình 4.3 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng thạch
(a) vi khuẩn ly trích từ lá bệnh trên môi trường PDA; (b) khuẩn lạc sau khi
phân lập trên môi trường YDC có màu vàng, lồi, bóng, nhầy.
a
b

28
4.2. Kết quả chủng bệnh trên rau cải ngọt trồng trong nhà lƣới
Cây kí chủ sạch bệnh trồng trong nhà lƣới sau khi chủng 4 ngày đƣợc tiến hành
quan sát triệu chứng. Kết quả cho thấy các dòng CC1, CC2, CC3, HM1, HM2 và
Q12 – 1 gây triệu chứng bệnh trên cây cải ngọt trồng trong nhà lƣới. So sánh vết bệnh
tạo ra trên lá cải thu thập ngoài ruộng và lá cải đƣợc chủng trong nhà lƣới, chúng tôi
nhận thấy không có sự khác biệt về triệu chứng.
Ở những lá cây nhiễm bệnh, qua hình chụp đốm bệnh dƣới kính hiển vi soi nổi,
ta có thể thấy rõ triệu chứng: từ vết thƣơng ban đầu, vi khuẩn xâm nhập các mô,
gây hoại tử các mô tế bào lá. Vết bệnh phát triển rộng dần tạo thành đốm màu nâu
đen rõ rệt.
Còn ở những lá không bị nhiễm, những tế bào tại vùng bị tổn thƣơng bị chết tạo
thành vết sẹo màu trắng, không có triệu chứng bệnh.

a
d
b
c


29
Hình 4.4 Vết bệnh sau khi chủng và vết thƣơng không bị nhiễm chụp
dƣới kính hiển vi soi nổi (a) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày; (b) vết thương
do kim châm tạo ra trên lá không bị bệnh; (c) đốm bệnh trên lá sau khi chủng 4 ngày
nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol; (d) vết sẹo ở lá chủng không nhiễm
bệnh nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol.


Đốm bệnh




Hình 4.5 Lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày, bên phải gân lá không bị nhiễm và
bên trái bị nhiễm (a) lá cải sau khi chủng bệnh 4 ngày; (b) lá cải sau khi chủng bệnh
4 ngày nhuộm bằng dung dịch Alcohollic lactophenol.

4.3. Kết quả ly trích và pha loãng DNA vi khuẩn
a
b

30
Quá trình ly trích DNA vi khuẩn có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu. DNA
thu đƣợc phải đáp ứng đƣợc yêu cầu về hàm lƣợng và độ tinh sạch. Sau khi tiến
hành tách chiết theo đúng quy trình 8 mẫu vi khuẩn, chúng tôi thu đƣợc kết quả
nhƣ sau:

Hình 4.6 Kết quả ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn (genomic DNA)
1: CC1, 2: CC2, 3:CC3, 4: HM1, 5: HM2, 6: Q12-1, 7: DC.
Qua kết quả điện di ta thấy DNA ly trích có chất lƣợng tốt, lƣợng mẫu nhiều và ít
tạp nhiễm. Tuy nhiên, để chuẩn bị tốt cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành pha
loãng nhằm hịêu chỉnh nồng độ mẫu DNA bằng dung dịch TE. Kết qủa thu đƣợc thể
hiện qua band diện di:

Hình 4.7 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA.
DNA thu
đƣợc
Phần tạp
nhiễm


31
Thông thƣờng, sản phẩm ly trích phải qua giai đọan tinh sạch bằng enzyme RNAse
nhằm đảm bảo cho phản ứng PCR không bị tạp nhiễm. Tuy nhiên, dựa vào hình trên,
chúng tôi nhận thấy DNA thu đƣợc có độ thuần khiết cao, do đó, không cần thiết phải
tinh sạch. Hơn nữa, quá trình tinh sạch sẽ làm gãy DNA ở một mức độ nào đó.
4.4. Kết quả phản ứng PCR
4.4.1. Kết quả phản ứng PCR khuếch đại vùng ITS
Phản ứng PCR chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nồng độ DNA, nhiệt độ bắt cặp
của primer, nhiệt độ kéo dài, sự cân đối giữa các thành phần của phản ứng. Sau khi

hoàn thiện đƣợc quy trình phản ứng PCR đáng tin cậy cho việc khuếch đại đoạn gen
trong vùng ITS, chúng tôi tiến hành phản ứng trên các mẫu DNA đã ly trích. Kết quả
thu đƣợc rất khả quan. So sánh với thang DNA chuẩn 1,5kb, chúng tôi nhận thấy sản
phẩm PCR từ các dòng thu đƣợc là đoạn có kích thƣớc 1,1kb. Kích thƣớc sản phẩm
hoàn toàn trùng khớp với nghiên cứu của Goncalves, E.R. và Rosato, Y.B.



Hình 4.8 Kết quả khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA
1: CC1, 2: CC2, 3: CC3, 4: Ladder 1,5kb, 5: HM1, 6: HM2, 7: Q12-1, 8: DC.

Sản phẩm PCR này sẽ đƣợc tinh sạch và đọc trình tự. Trình tự DNA có đƣợc sẽ so
sánh với dữ liệu trên ngân hàng gen để định danh vi khuẩn gây bệnh.
1,1kb


32
4.4.2. Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR
Chọn hai mẫu CC1 và HM2 để tiến hành tinh sạch theo quy trình GFX PCR and
Gel band Purification Kit (Amersham Company).


Cf1 HM2


Hình 4.9 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR.
4.4.3. Kết quả PCR vùng hrpF
Theo Young Jin Park và ctv (2004), primer XCR và XCF thiết kế dựa trên trình tự
gen hrpF có tính chuyên biệt cao, dùng để khuếch đại đoạn DNA trong vùng hrpF của
vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris có kích thƣớc 535 bp. Chúng tôi đã

thực hiện phản ứng PCR dùng cặp mồi trên đối với các dòng vi khuẩn CC1, CC2,
HM1, HM2 và Q12 – 1. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
- Các dòng CC1, CC2, HM2 và Q12 – 1 tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp, hoàn toàn
phù hợp với báo cáo của Young Jin Park và ctv (2004). Do đó, có thể kết luận các
dòng vi khuẩn này là Xanthomonas campestris pv. campestris.
- Dòng đối chứng Xanthomonas axonopodis pv. citri không tạo sản phẩm khuếch đại.
- Riêng dòng HM2 tạo sản phẩm có kích thƣớc 1 kb. Tuy là kết quả dƣơng tính nhƣng
chƣa thể có kết luận định danh đối với dòng vi khuẩn này.


33

Hình 4.10 Kết quả khuếch đại đoạn DNA vùng hrpF
1: HM1, 2: HM2, 3: CC1, 4: Ladder 1kb, 5: CC2, 6: Q12 – 1, 7: DC.

Chƣơng 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Kết thúc đề tài, chúng tôi đã thiết lập đƣợc quy trình phân lập và định danh vi
khuẩn gây bệnh đốm lá trên cây cải ngọt tại Tp. HCM. Quy trình đƣợc thực hiện nhƣ
sau:
Thu thập mẫu bệnh tại các vùng trồng rau trọng điểm của Tp. HCM: Tiến
hành khảo sát trên ruộng rau, thu thập các mẫu lá xuất hiện các đốm nhỏ màu
nâu đen, rửa sạch đất cát, ủ ẩm trong bao ni lông cho vi khuẩn phát triển trƣớc
khi phân lập.
Phân lập vi khuẩn từ các đốm bệnh trên lá: Rửa sạch lá bằng nƣớc vòi, mỗi
mẫu bệnh chọn các đốm bệnh còn mới màu xanh giọt dầu để phân lập. Khử
trùng bề mặt, cắt nhỏ mẫu bệnh ngâm vào nƣớc cất vô trùng 5 – 10 phút. Hút
dịch khuẩn cấy trang lên môi trƣờng PDA, ủ ở 28
o
C trong 24 – 48 giờ. Chọn

các khuẩn lạc tròn, màu vàng, nhầy, bóng để phân tích.
Chủng bệnh trên cây cải ngọt sạch bệnh trồng trong nhà lƣới bằng phƣơng
pháp tạo vết thƣơng bằng cách xâm kim và nhiễm vi khuẩn trên vết thƣơng.
535 bp
1 kb


34
Ly trích DNA từ vi khuẩn bằng phƣơng pháp sử dụng CTAB với sinh khối vi
khuẩn tăng sinh bằng môi trƣờng LB lỏng.
Phƣơng pháp PCR khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA có kích thƣớc 1,1 kb sử
dụng cặp primer Xan1330 và Xan322 làm vật liệu giải trình tự. Thực hiện
phản ứng với thành phần nêu trong Bảng 3.1 theo chu trình nhiệt Bảng 3.2.
Phƣơng pháp PCR dùng cặp primer XCF và XCR khuếch đại đoạn DNA
trong vùng hrpF . Thành phần phản ứng và chu trình nhiệt nhƣ trình bày ở
Bảng 3.1 và Bảng 3.3. Phản ứng tạo sản phẩm có kích thƣớc 535 bp khẳng
định vi khuẩn gây bệnh thuộc loài Xanthomonas campestris pv. campestris.
Chúng tôi đã xác định đƣợc các dòng CC1, CC2, HM1 và Q12–1 gây bệnh đốm lá
trên cây cải ngọt tại Tp. HCM là vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris.
5.2. Đề nghị
Tiến hành khảo sát, nghiên cứu ở quy mô rộng với số lƣợng mẫu phân tích lớn hơn
trên các cây rau họ thập tự. Cụ thể là mở rộng địa bàn (Đồng Bằng Sông Cửu Long,
Lâm Đồng, Long An và các tỉnh có canh tác rau), nghiên cứu trên phổ kí chủ rộng hơn
(cây họ thập tự).
Hoàn thành đề tài ở mức giải trình tự vùng 16S – 23S rDNA của vi khuẩn gây
bệnh, đối chiếu với dữ liệu ngân hàng gen, giúp quy trình định danh có cơ sở.
Nghiên cứu đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn gây bệnh bằng kỹ thuật RFLP.

35













TÀI LIỆU THAM KHẢO

TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2000. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản
nông nghiệp, Thành phố Hồ Chí Minh. Trang 195 – 231.

2. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục.
Trang 197 – 206.
3. Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân, 1999. Bệnh vi khuẩn và virút hại cây trồng.
NXB Giáo Dục Hà Nội. Trang 99 – 100.
4. Mai Thị Vinh và Phạm Văn Biên, 1985. Bệnh hại rau cải ở một số vùng rau
ngoại thành Tp Hồ Chí Minh. Thông báo khoa học, Viện Khoa Học Kỹ
Thuật Nông Nghiệp Miền Nam.
5. Nguyễn Văn Thắng và Trần Khắc Thi, 1996. Sổ tay người trồng rau . Nhà
xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội, 114 trang.
6. Trần Thanh Tùng, 1997. Những bệnh hại quan trọng trên một số loại rau
trồng phổ biến tại Tp Hồ Chí Minh và biện pháp phòng trừ. Thông báo
khoa học, Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam.


36
TÀI LIỆU NƢỚC NGOÀI
7. Bradbury, J.F., 1986. Guide to plant pathogenic bacteria. Wallingford, UK:
CAB International.
8. Gaetan, S., and Lopez, N., 2005. First outbreak of bacterial leaf spot
caused by Xanthomonas campestris on Canola in argentina. Plant Disease.
89: 683 – 684.
9. Goncalves, E.R., and Rosato, Y.B., 2002. Phylogenetic analysis of
Xanthomonas species based upon 16S-23S rDNA intergenic spacer
sequences. Inetrnational Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology. 52: 355 – 361.
10. John P. Curran, 2002. Automated DNA sequencing (ABI PRISM 3100).
Training Manuals/Protocols.
11. Klement, Z., 1982. Hypersensitivity. Phytopathogenic Prokaryotes. Pages
149 – 177.
12. M. S. Krause, M.S., De Ceuster, T.J.J., Tiquia, S.M., Michel Jr.F.C.,

Madden, L.V., and Hoitink, H.A., 2003. Isolation and characterization of
rhizobacteria from composts that suppress the severity of bacterial leaf spot
of radish. Phytopathology. 93: 1292 – 1300.
13. Massomo, S.M.S., Hanne Nielsen, Mabagala, R.B., Keld Mansfield – Giese,
John Hockenhull, and Mortensen, C.N., 2003. Identification and
characterisation of Xanthomonas campestris pv. campestris strains from
Tanzania by pathogenicity tests, Biolog, rep – PCR and fatty acid methyl
ester analysis. European Journal of Plant Pathology. 109: 775 – 789.
14. Moffett, M.L., Trimboli, D., and Bonner, L.A., 1976. A bacterial leaf spot
disease of several Brasssica varieties, Aust. Plant Pathology. Soc. 5: 30 –
32.
15. Pernezny, K., and Dickstein, E., 2003. An outbreak of bacterial leaf spot
disease of cabbage in Southrn Florida caused by Xanthomonas campestris
pv. armoraciae. Plant Disease. 87: 872 – 873.
16. Ruissen, M.A., and Gielink, A.J.,1993. The development of black rot in
cabbage as a result of difference in guttation between cultivars. Proceedings


37
of the Eight International Conference on Plant Pathogenic Bacteria, 9-12
June 1993, Versailles, France. Pages 178 – 185.
17. Shaad, N.W., 1994. Laboratory guide for identification of plant pathogenic
bacteria, second edition. APS PRESS, The American Phytopathological
Society. 165 pages.
18. Steven T. Koike, Azad, H.R., and Cooksey, D.A., 2001. Xanthomonas leaf
spot of cantip: a new disease caused by pathovar Xanthomonas campestris.
Plant Disease. 85: 1157 – 1159.
19. Van den Ackerveken, G.F., Marois, E., and Bonas, U. 1996. Recognition of
the bacteria avirulence protein AvrBs3 occurs inside the host plant cell.
Cell. 87: 1307 – 1316.

20. Van Gijsegem, F., Genin, S., and Boucher, C.A., 1993. Conservation of
secretion pathways for pathogenicity determinants of plant and animal
bacteria. Trends Microbiol. 1: 175 – 180.
21. Veronique Hugouvieux, Barber, C.E., and Daniel, M.J., 1998. Entry of
Xanthomoas campestris pv. campestris into hydathodes of Arabidopis
thalian leaves: a systems in bacterial pathogenis. Molecular Plant –
Microbe Interaction. 11: 537 – 543.
22. Vicente, I.G., Everett, B., and Robert, S.J., 2006. Identification of isolates
that cause z leaf spot of brassica as Xanthomonas campestris pv. raphani
and pathogenic and genetic coparison with related pathovars.
Phytopathology. 96: 735 – 745.
23. Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000. Bacterial leaf spot of
leaf crucifery in Oklahoma caused by pathovars of Xanthomonas
campestris. Plant disease. 84: 1008 – 1014.
24. Youfu Zhao, Damicone, J.P., and Bender, C.L., 2000. Bacterial leaf spot of
leafy crucifer in Oklahoma caused by Pseudomonas syringae pv.
maculicola. Plant Disease. 84: 1015 – 1020.
25. Yuong Jin Park, Byuong Moo Lee, Jang Ho-Hahn, Gil Bok Lee, and Dong
Suk Park, 2004. Sensitive and specific detection of Xanthomonas


38
campestris pv. campestris by PCR using species specific primer based on
HrpF gene sequence. Microbiological Resarch. 159: 419 – 423.

PHỤ LỤC
1. Cách thức pha một số hóa chất cần thiết
Pha Phenol
- Hòa tan 100 g phenol (tinh thể) đặt trong bồn ủ nhiệt ở 65
0
C (phải bịt kín
dụng cụ đựng phenol khi hòa tan).
- Sau khi phenol đã tan hoàn toàn, thêm vào 100 ml dung dịch bazơ 0.5M, pH8.
- Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi hỗn hợp tách thành
hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên một cách cẩn thận. Lƣu ý các thao tác này nên
thực hiện ở trong tủ hood và phải luôn giữ phenol trong tối để tránh oxy hóa và nguy
hiểm đến sức khỏe.
- Tiếp tục cho vào 100 ml dung dịch tris HCl 0.5M, pH8.
- Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dịch tách làm
hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên.
- Lập lại chu kỳ này một lần nữa. Sau đó phủ lên trên dung dịch phenol thu
đƣợc một lớp TE 1X (50 ml).
- Bảo quản phenol trong tối (dùng bình đựng có màu tối hoặc bịt kín bình bằng
giấy bạc).
Pha dung dịch TE 1X
Thành phần gồm: 10 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH8
Trƣớc hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8.
Cho dung dịch Tris HCl và EDTA vào nƣớc tinh sạch.
Khuấy đều và chuẩn độ pH đến 8.
2. Thành phần môi trƣờng
Chuẩn bị môi trƣờng PDA (potato dextrose agar):
Nguyên liệu Liều lƣợng

- Khoai tây gọt sạch vỏ 500 g
- Dextrose 10 g
- Agar 15 g
- Nƣớc cất 1 lít


2
Khoai tây cắt thành miếng, cho vào 1 lít nƣớc đun sôi trong 40 phút.
Lọc, thêm nƣớc cho đủ 1 lít, cho dextrose, agar vào, khuấy tan bằng máy khấy từ, dịch
môi trƣờng cho vào bình tam giác 250 ml, đem khử trùng bằng nồi hấp ở 121
o
C trong
30 phút. Sau khi hấp, để nguội đến 50
o
C và đổ vào đĩa petri.
- Môi trƣờng YGC:
Glucose 5g
Yeast extract không có agar 5 g
Calcium carbonate 40 g
Agar 15g
Nƣớc 1 lít
- Môi trƣờng LB:
NaCl 10g
Yeast extract 5g
Peptone 10g
Nƣớc 1 lít
Hòa tan lần lƣợt các chất trong nƣớc bằng máy khuấy từ. Hấp ở 121
o
C trong 20 phút.
3. Pha dung dịch Alcohollic lactophenol

Hóa chất
Tỉ lệ thể tích
Lactic acid
1
Phenol
1
Glycerol
1
Nƣớc
1
Ethanol
8









3