Luận văn : PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH TÁC NHÂN GÂY BỆNH ĐỐM LÁ CÂY CẢI NGỌT TẠI TP. HCM BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ VÙNG 16S – 23S rDNA part 2 doc

8
Theo CPC (2001), Xanthomonas campestris pv. campestris sống sót qua mùa đông
trong đất, đặc biệt là các cây kí chủ nhiễm bệnh và các loài cỏ dại mọc gần ruộng trồng
cây họ thập tự, vi khuẩn có thể tồn tại tới 3 năm. Vi khuẩn xâm nhập vào hạt, lỗ khí
khổng và thủy khổng của cây. Vi khuẩn từ lá mầm ở cây con có thể lan truyền trực
tiếp lên các lá thật. Vi khuẩn xâm nhập vào cây qua sự hình thành giọt nƣớc tiết ra từ
lỗ thủy khổng trong giai đoạn buổi sáng (Ruisen và Gielink, 1993).
Nhiệt độ thích hợp cho sinh trƣởng của vi khuẩn là 25 – 30
o
C. Trong những điều
kiện nhƣ vậy, triệu chứng bệnh sẽ xuất hiện sau 7 – 14 ngày. Nhiệt độ thấp, triệu
chứng bệnh xuất hiện chậm. Triệu chứng bệnh không thể hiện rõ khi nhiệt độ dƣới
18 – 20
o
C. Vi khuẩn có thể sống sót trên bề mặt lá đến 73 ngày sau khi lá đƣợc chủng
bệnh bằng phƣơng pháp phun (Schultz và Gabrielson, 1986). Vi khuẩn có thể lây lan
từ cây này qua cây khác nhờ gió, mƣa và công cụ lao động.
2.1.5. Hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn gây bệnh
Các loài vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Xanthomonas thƣờng có phản ứng Gram
âm, háo khí, tế bào hình gậy (0,4 – 0,7 x 0,7 – 1,8 μm), tiêm mao đơn cực, không sản
sinh nitrates, phản ứng catalase dƣơng tính, tạo axít yếu từ các nguồn carbonhydrate.
Khuẩn lạc có màu vàng, nhầy, lồi và bóng trên môi trƣờng NGA và YDC agar.
Đối với các loài Xanthomonas, khuẩn lạc có thể mọc và phát triển ở nhiệt độ 35
o
C,
hóa lỏng gelatin, không tạo urease, sản sinh axit từ arabinose, glucose và manose
(N.W. Schaad, 1998).
2.1.6. Phƣơng pháp phân lập tác nhân gây bệnh
Theo Youfu Zhao (2000), đối với bệnh đốm lá họ thập tự do vi khuẩn thuộc giống

Xanthomonas, việc ly trích vi khuẩn tốt nhất từ các đốm lá mới bị nhiễm bệnh.
Sát trùng bề mặt bằng sodium hypochlorite 0,25% trong 30 giây, đốm bệnh đƣợc cắt
nhỏ trong giọt nƣớc tiệt trùng và cấy zích zắc dịch khuẩn lên môi trƣờng nutrient agar
(NA). Đĩa cấy ủ trong 28
o
C, sau 3 – 5 ngày đem quan sát khuẩn lạc. Chọn các khuẩn
lạc màu vàng, mọc tách rời để nghiên cứu.
Theo CPC (2001), vi khuẩn gây bệnh thực vật giống Xanthomonas có thể đƣợc
phân lập từ rìa vết bệnh (phần tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe ). Vi khuẩn đƣợc
cấy trên môi trƣờng Yeast dextrose calcium carbonate (YDC), Beef peptone agar + 5%
water soluble starch.


9
Theo Shaad, N.W. (1988), vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris có
thể đƣợc phát hiện bằng cách nuôi cấy trên môi trƣờng bán chọn lọc (semiselective
media). Các loại môi trƣờng bán chọn lọc chuyên biệt đƣợc sử dụng là SX agar, SM
agar, NSCAA, BSCAA. Các môi trƣờng này thƣờng dùng phân lập vi khuẩn
Xanthomonas campestris pv. Campestris trong đất và hạt giống.

2.1.7. Những nghiên cứu về phát hiện và dịnh danh tác nhân gây
bệnh bằng phƣơng pháp sinh học phân tử
Để đánh giá sự đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn Xanthomonas
campestris gây bệnh đốm lá trên cây họ thập tự, Youfu Zhao và ctv (2000) đã sử dụng
kỹ thuật rep-PCR với BOX primer BOXAIR [5’ –
campestris
carotae
Translucens
phaseoli
pruni
vesicatoria
oryzae
malvacearum
Manihotis
Begoniae
pelamgonii
fragaria
Môi trƣờng
+
–

–
V
–

V
–

–
–
–
–
+
–
+
SX
+
–
–
–
V
–
–
V
–
+
V
+
SM
+
V

–

+
V
–

+
V
–
V
–

V
–

+
+
+
BSCAA
V
+

(+)
V
+
V
–

V
+

–
V
+

–
(+)
V
+
MXP
–
–
–
V
–

+
V
–
–
–
V
V
V
XPS
a

+
+
+

+
V
+
–
+
+
(+)
+
+
XCS
V
–
+
V
+
(+)
V
ND
V
V
+
V

MD – 5
+
V
+
(+)
+
+

ND
+
V
+
+
+
Tween













Bảng 1.1 Sự phát triển của một số loài vi khuẩn
Xanthomonas trên môi trƣờng bán chon lọc



10
CTACGGCAAGGCGACGCTGACG – 3’]. Phản ứng rep – PCR trên các mẫu nghiên
cứu tạo sản phẩm là các đoạn DNA có kích thƣớc từ 0,3 – 4 kb cho phép đánh giá sự
tƣơng quan về mặt kiểu gen giữa các loài.

Hình 2.1 Sản phẩm rep – PCR trong nghiên cứu của Youfu Zhao và ctv.
Goncalves, E.R., và Rosato, Y.B (2002), trong nghiên cứu của mình về sự phát
sinh loài vi khuẩn Xanthomonas campestris đã dùng kỹ thuật PCR sử dụng cặp primer
Xan 1330 5’ – GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC – 3’
Xan 322 5’ – GGT TCT TTT CAC CTT TCC CTC – 3’
thiết kế dựa trên vùng rDNA 16S và 23S để khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS có
kích thƣớc 1,1 kb.



11

Hình 2.2 Cấu trúc vùng 16S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn Xanthomonas.
Said M.S. Massomo và ctv (2003) đã thực hiện nghiên cứu định danh vi khuẩn
Xanthomonas campestris pv. campestris trên cải bắp ở Tanzania bằng phƣơng pháp
chủng bệnh, phân tích methyl este acit béo, ELISA gián tiếp và rep – PCR. Vi khuẩn
sau khi phân lập đƣợc tiến hành phân tích sinh hóa; chủng bệnh bằng phƣơng pháp
châm kim tạo vết thƣơng, lây nhiễm trên lá mầm, phun dịch khuẩn trên cây trƣởng
thành. Acit béo đƣợc methyl hóa, ly trích và phân tích bằng máy sắc ký khí. Vi khuẩn
đƣợc xác định bằng kỹ thuật ELISA gián tiếp sử dụng kháng thể đơn dòng đặc hiệu.
Các dòng vi khuẩn sau khi xác định đƣợc tiến hành phân tích genomic fingerprinting
bằng kỹ thuật rep – PCR với primer
BOXAIR (5’ – CTACggCAAggCgACgCTgACg – 3’)
và REP – PCR dùng cặp primer:
REP 1R (5’ – IIIICgICgICATCIggC – 3’)
REP 2I (5’ – ICgICTTATggCCTAC – 3’).
Young Jin Park và ctv (2004) đã thực hiện nghiên cứu phát hiện vi khuẩn
Xanthomonas campestris pv. campestris bằng kỹ thuật PCR dựa trên cặp primer
XCF (5’ – CGATTCGGCCATGAATGACT – 3’) và
XCR (5’ – CTGTTGATGGTGGTCTGCAA – 3’) đƣợc thiết kế từ gen hrpF

của vi khuẩn Xanthomonas campestris pv. campestris để khuếch đại đoạn DNA có


12
kích thƣớc 535 bp. Nhóm nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm chứng minh tính
chuyên biệt và đặc hiệu của primer XCR, XCF bằng cách thực hiện phản ứng PCR
với nhiều thành phần hóa chất mà máy luân nhiệt khác nhau. Ngoài ra, kỹ thuật
DNA dot – blot cũng đƣợc thực hiện nhằm kiểm chứng sự hiện diện của gen hrpF
trong vi khuẩn, qua đó rút ra kết luận về sự bảo toàn của gen này.
2.2. Tổng quan nghiên cứu trong nƣớc
Cho đến nay, những nghiên cứu về bệnh đốm lá họ thập tự nói chung và cây cải
ngọt nói riêng còn khá ít. Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1999), bệnh đốm lá
súp lơ là do vi khuẩn Pseudomonas syringae pv. maculicola gây nên. Bệnh đƣợc phát
hiện lần đầu tiên ở Mỹ vào năm 1911. Triệu chứng bệnh trên các lá thật thƣờng là các
đốm nhỏ, tròn, góc cạnh, màu nâu tím hoặc đen. Trên lá mầm xuất hiện các đốm trong
giọt dầu, mép lá uốn cong. Đƣờng kính vết bệnh từ 1 – 3 mm.
Vi khuẩn gây bệnh hình gậy, hai đầu tròn, kích thƣớc khoảng 1,5 – 3 x 0,5 – 1 μm,
chuyển động nhờ vài ba lông roi ở một đầu. Khuẩn lạc trắng kem, tròn nhẵn, rìa gợn
sóng. Vi khuẩn có khả năng phát huỳnh quang, tạo NH
3
, khử nitrate, không phân giải
đƣờng thành axít, khí, không làm đông váng sữa, phân giải gelatin rất yếu, khả năng
yếu tạo H
2
S và indol.
Nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn sinh trƣởng là 24 – 25
o
C, nhiệt độ tối đa là 29
o
C,

nhiệt độ gây chết là 47
o
C, nhạy cảm với tác động của ánh sáng mặt trời và khô hạn.
Vi khuẩn xâm nhiễm qua lỗ khí khổng, vết thƣơng. Thời kỳ ủ bệnh là khoảng
4 – 6 ngày. Bệnh phát triển thuận lợi trong điều kiện ẩm độ cao (90%), nhiệt độ
17 – 25
o
C. Bệnh có thể lan truyền qua bọ nhảy.
Ở trên cây cải bông và một số rau ăn lá nhƣ cải thìa, cải xanh, cải ngọt, bệnh đốm lá
do vi khuẩn Xanthomonas spp. gây nên thƣờng xuất hiện trong vụ đông xuân.
Trên cải bông, bệnh xuất hiện nhiều hơn so với các giống cải khác (Trần Thanh Tùng,
1997).
Theo Phạm Văn Biên và Mai Thị Vinh (1998, 2000), bệnh đốm lá cải bông vùng
trồng rau thành phố HCM do vi khuẩn Pseudomonas spp. gây nên. Bệnh thƣờng xuất
hiện trên cải bông trồng trong vụ đông xuân. Bệnh phát sinh gây hại nặng vào những
năm có thời tiết nóng ẩm. Giống Xanthomonas spp. thƣờng gây bệnh cháy lá chữ V


13
trên cải bắp, cải bông vùng Củ Chi, Hóc Môn, Bình Chánh. Bệnh cũng thƣờng xuất
hiện trong vụ đông – xuân, khoảng từ tháng 11 – 2.
Trong giống Xanthomonas spp. có một loài gây bệnh đốm lá cải bông đƣợc phát
hiện trong năm 1998 ở vùng rau Vĩnh Lộc B, Bình Chánh, Tp. HCM. Triệu chứng
bệnh ban đầu là các đốm nhỏ vàng sáng ở các lá thấp gần mặt đất, các đốm này trông
gần giống với đốm do bọ nhảy gây hại. Bệnh thƣờng nặng hơn vào giai đoạn cuối vụ.
Tỷ lệ bệnh giai đoạn phát triển thân lá khoảng 21%, nhƣng ở giai đoạn ra bông , bệnh
có thể lên tới 50% (Mai Thị Vinh, 1998).
Nhìn chung, số công trình nghiên cứu về tác nhân cũng nhƣ các đặc tính sinh học,
sinh lý, sinh hóa, dịch tễ học của bệnh đốm lá cải ngọt nói riêng và bệnh đốm lá cây họ
thập tự nói chung ở Việt Nam còn khá ít.

2.3. Vùng 16S – 23S rDNA ITS (rDNA intergenic spacer) và gen hrpF
(hypersensitive reaction and pathogenicity)
2.3.1. Gen hrpF (hypersensitive reaction and pathogenicity)
Để xâm nhập và gây bệnh trên cây kí chủ, các loài vi khuẩn thƣờng có hệ thống
riêng tiết ra các loại enzyme (pectinases, cellulases, proteases) và các chất độc (Beattie
và Lindow, 1994). Ngoài ra còn có sự tham gia của hệ thống các gen hrp. Gen này
hiện diện trong hầu hết các loài vi khuẩn Gram âm ngoại trừ Agrobacterium
(Lindgren, 1986). Gen này tạo cho vi khuẩn khả năng xâm nhập và nhân sinh khối
trong cây nhiễm (susceptible plant), đồng thời tạo phản ứng siêu nhạy cảm
(hypersensitive reaction) ở cây kháng (resistant plant). Phản ứng siêu nhạy cảm là một
đáp ứng phòng vệ của cây kí chủ, thể hiện bằng sự hoại tử ở mô bị nhiễm (Klement,
1982). Tổ hợp gen này bao gồm 21 gen và 2 gen điều tiết là hrpX, hrpG nằm bên
ngoài. Các gen hrp mã hóa các protein hrp. Các protein này là thành phần của hệ
thống phóng tiết loại III (type III secretion system) cho phép tiết ra các loại protein
gây độc (Van Gijsegem, 1993 và Van den Ackerveken, 1996).
2. 3.2. Ribosome DNA (rDNA)
rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong các
nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA đƣợc quan tâm nghiên cứu vì nó là một gen
có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen nằm
liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa, ribosom


14
hầu nhƣ tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn phân tử
rDNA tƣơng đối bảo tồn nên đƣợc xem là cơ sở để tìm ra sự tƣơng đồng và các khác
biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những
oligonucleotide có tính bảo tồn cao đƣợc sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại
các vùng tƣơng đƣơng dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng đƣợc
thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật
(Van de Peer và ctv, 1996).

Theo Goncalves, E.R., và Rosato, Y.B (2002), rDNA 16S và 23S có tính bảo toàn
cao. Ngƣợc lại, vùng ITS tiến hóa nhanh hơn và có nhiều biến động. Do đó, các
primer đƣợc thiết kế dựa trên trình tự các vùng bảo toàn để khuếch vùng ITS, dùng
trong các nghiên cứu về sự đa dạng di truyền, nguồn gốc phát sinh cũng nhƣ quan hệ
giữa các loài. Ngoài ra, vùng ITS còn đƣợc sử dụng giải trình tự, đối chiếu với dữ liệu
trên ngân hàng gen để định danh sinh vật.




















15
Chƣơng 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm
3.1.1.Thời gian

Đề tài đƣợc thực hiện trong thời gian từ ngày 06/02/2006 đến 30/07/2006
3.1.2. Địa điểm
- Tiến hành lấy mẫu bệnh tại các vùng trồng rau trọng điểm ở Tp HCM: Củ Chi,
Hóc Môn, quận 12.
- Phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh tại Phòng Nghiên Cứu Bảo Vệ Thực Vật,
Viện Khoa Học Kỹ Thuật Nông Nghiệp Miền Nam (IAS).
- Chủng bệnh trên cây rau cải ngọt trong nhà lƣới thuộc Bộ môn Bảo Vệ Thực
Vật, ĐH Nông Lâm Tp HCM.
- Ly trích DNA và tiến hành phản ứng PCR, đọc trình tự tại Trung Tâm Phân
Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, ĐH Nông Lâm Tp HCM.
3.2. Vật liệu
Mẫu bệnh phẩm thu thập từ các vùng trồng rau trọng điểm ở Tp HCM: Củ Chi, Hóc
Môn, quận 12.
Đề tài sử dụng dòng vi khuẩn đối chứng Xanthomonas axonopodis pv. citri gây
bệnh ung thƣ trên cây bƣởi.
3.3. Hóa chất
Các hoá chất đƣợc sử dụng trong đề tài này đƣợc sản xuất bởi Công ty Sigma,
Merk, Amersham Biosence và Bio Rad.
3.3.1. Các hoá chất dùng để ly trích DNA từ vi khuẩn
Phenol
Chloroform
Isoamyl
Isopropanol
Ethanol 100%
Ethanol 70%
RNAse 1mg/ml
Hỗn hợp Phenol: Chloroform: Isoamyl (25:24:1).
Dung dịch TE 1X vô trùng: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH 8,0

16
– Dung dịch đệm ly trích DNA
Tris (trisma bazơ): chất đệm, giữ ổn định pH tránh tổn hại DNA
EDTA: tạo phức Mg
++
, gây bất hoạt enzyme phân hủy DNA trong quá trình
tách chiết
SDS: 20 % : phá vỡ và tẩy sạch màng tế bào, màng nhân để phóng thích DNA.
- Dung dịch CTAB: dùng để kết tủa polysaccharide và tạp chất khác.
10 g CTAB.
100 ml NaCl 0,5 M.
3.3.2. Các hoá chất dùng trong điện di
Gel agarose, thƣờng sử dụng gel có nồng độ 1% agarose.
Đệm TAE 0,5X dùng để pha gel agarose và làm dung dịch đệm trong chạy điện
di với thành phần nhƣ sau:
Tris HCl 4,48 g
Na
2
EDTA 0,5M (pH8,0) 2ml
Glacial acetic acid 1,14 ml
Nƣớc cất vừa đủ 1 lít
Dung dịch nhuộm gel là Ethidium bromide 1%.
Ladder 1 kp.
Ladder 1,5 kb.
DNA loading buffer.
3.3.3. Hoá chất cho phản ứng PCR (do công ty Bio - Rad cung cấp)
Taq DNA polymerase nồng độ 5UI/µl.
Dung dịch đệm 10X: đi kèm với Taq.
dNTPs 10 mM.
MgCl

2
50 mM.
Primer: đƣợc tổng hợp bởi công ty IDT (Mỹ).
Xan 1330 5’ – GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC – 3’
Xan 322 5’ – GGT TCT TTT CAC CTT TCC CTC – 3’
(nguồn: Young Jin Park và ctv, 2004)
XCF 5’ – CGATTCGGCCATGAATGACT – 3’
XCR 5’ – CTGTTGATGGTGGTCTGCAA – 3’


17
(nguồn: Goncalves, E.R và Rosato, Y.B, 2002)
3.3.4. Môi trƣờng
Môi trƣờng PDA.
Môi trƣờng YGC.
Môi trƣờng lỏng LB.
( thành phần và cách chuẩn bị môi trƣờng: xem phụ lục)
3.4. Dụng cụ, thiết bị
Các dụng cụ và thiết bị
cần thiết cho một phòng
thí nghiệm sinh học phân tử.
Kính lúp.
Kính hiển vi và kính
hiển vi soi nổi.
Que cấy, đèn cồn.
Tủ mát.
Tủ lạnh -20
o
C.
Máy đo pH.

Tủ cấy vô trùng.
Tủ ủ nhiệt.
Máy lắc.
Máy ly tâm lạnh.
Máy khuấy từ.
Bộ điện di.
Máy PCR.
Máy vortex.
Máy chụp hình gel
(Bio –Rad).
Máy đọc trình tự ABI PRISM 3100.
3.5. Phƣơng pháp
3.5.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu bệnh
Mẫu bệnh đƣợc thu thập tại các vùng trồng rau ở Củ Chi, Hóc Môn và quận 12.
Quan sát trên các ruộng rau cải ngọt, khi phát hiện các lá có triệu chứng bệnh (xuất
hiện các đốm nhỏ có kích thƣớc 1 – 2 mm màu nâu đen, phân biệt với vết đốm tròn do
bọ nhảy gây nên), tiến hành lấy mẫu lá, rửa kỹ bằng nƣớc sạch, bọc trong giấy thấm,
cho vào bao ni lông. Mỗi ruộng lấy từ 3 – 4 lá. Mẫu lá lấy từ các ruộng khác nhau
đƣợc kí hiệu riêng và đƣợc coi là một dòng bệnh.
Mẫu sau khi thu thập đƣợc ủ ẩm tạo ẩm độ thích hợp cho vi sinh vật phát triển trƣớc
khi đem phân lập.
3.5.2. Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật từ mẫu bệnh
Mẫu lá đƣợc rửa sạch đất cát bằng nƣớc vòi, thấm khô bằng giấy lọc. Các vết bệnh
mới xuất hiện, còn nhỏ đƣợc chọn để phân lập. Mỗi mẫu bệnh cắt 1 đốm mới xuất hiện


18
triệu chứng (kích thƣớc nhỏ, vết bệnh có màu xanh giọt dầu). Khử trùng bề mặt bằng
NaCLO 0,3% và cồn 70% để loại bỏ các sinh vật biểu sinh, sau đó dùng dao mổ cắt
nhỏ vết bệnh ngâm vào nƣớc cất vô trùng. Để 5 – 10 phút sau cho vi khuẩn đi từ mô lá

vào trong nƣớc cất.
* Cấy vi khuẩn:
Hút 1 ml dịch khuẩn ở trên nhỏ vào đĩa petri, cấy trang trên môi trƣờng bằng trang
cấy thủy tinh chữ L. Mỗi đốm bệnh đƣợc cấy 3 lần lặp lại (9 đĩa). Đem các đĩa đã cấy
đặt vào tủ định ôn ở 28
o
C trong 24 – 48 giờ. Sau thời gian nuôi cấy, lấy ra quan sát và
chọn các khuẩn lạc. Phân loại khuẩn lạc bằng hình dạng, màu sắc và kiểu mọc. Chọn
các khuẩn lạc màu vàng, lồi, bóng, nhầy mọc riêng rẽ để cấy ria lên môi trƣờng YGC
3.5.3. Phƣơng pháp chủng bệnh trên rau cải trồng trong nhà lƣới
3.5.3.1. Phƣơng pháp trồng cây kí chủ
Để chủng bệnh, phải trồng cải ngọt sạch bệnh trong nhà lƣới.
Giống cải ngọt để trồng đƣợc mua từ các công ty giống cây trồng bao gồm 3 giống:
Số 4, Hai mũi tên đỏ và H&V.
Giá thể trồng: vật liệu làm giá thể trồng bao gồm xơ dừa, rơm rạ hoai mục, tro trấu.
Các thành phần trộn theo tỷ lệ 1:1:1, hỗn hợp này sau đó trộn với đất trồng theo tỷ lệ
1:1 tạo giá thể hoàn chỉnh. Toàn bộ giá thể đƣợc hấp khử trùng ở nhiệt độ 121
o
C.
Xử lý hạt giống: trƣớc khi gieo, ngâm hạt trong nƣớc ấm 50
o
C sau đó đem gieo
vào khay gieo sạch. Khay gieo có kích thƣớc 50 cm x 30 cm, chứa khoảng 200 lỗ.
Cây con sau khi mọc 10 ngày đem trồng ra khay xốp với kích thƣớc lỗ lớn.
Khi cây cải 20 ngày tuổi có khoảng 3 – 4 lá thật thì tiến hành chủng bệnh.
3.5.3.2. Chủng bệnh
Để xác định dòng vi khuẩn gây bệnh, chủng bệnh tiến hành theo phƣơng pháp
châm kim tạo vết thƣơng trên bề mặt lá. Trên mỗi lá châm thành hàng ở phần thịt lá
dọc hai bên gân chính, mỗi bên châm khoảng 5 – 7 vết. Một bên sẽ đƣợc chủng vi
khuẩn, bên kia không chủng để làm đối chứng so sánh.

Các dòng vi khuẩn chọn chủng đƣợc cấy trên môi trƣờng PDA để thu sinh khối.
Dùng tăm bông khử trùng lấy sinh khối vi khuẩn từ khuẩn lạc trên đĩa chấm vào vết
thƣơng để lây nhiễm vi khuẩn vào mô lá.


19
Khay cải sau chủng đƣợc ủ ẩm bằng cách bọc trong túi ni lông có miệng để tạo độ
ẩm thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn và tránh sự lẫn tạp các dòng với nhau.
Sau 3 – 4 ngày, quan sát triệu chứng và ghi nhận kết quả. Lá nhiễm bệnh khi xung
quanh vết châm có sự hoại tử mô tế bào (khác biệt với vết châm đối chứng ở đối diện
gân lá).
Để quan sát triệu chứng, hình thái và phản ứng của tế bào lá sau khi chủng. Chúng
tôi tiến hành nhuộm lá bằng dung dịch Alcohollic lactophenol (thành phần và cách pha
dung dịch: xem phần phụ lục).
Phƣơng pháp nhuộm lá đƣợc mô tả nhƣ sau:
- Cho lá cải cần nhuộm vào ống nghiệm, mỗi ống 2 lá.
- Rót dung dịch Alcohollic lactophenol vào ống nghiệm đến khi ngập lá.
- Đƣa ống nghiệm vào nồi nƣớc đang sôi, đến khi thấy bọt khí nổi lên thì lấy ra.
- Để ống nghiệm ở nhiệt độ phòng cho đến khi bọt khí ngừng nổi.
- Đổ bỏ dung dịch và rửa lá bằng nƣớc cất.
- Mẫu lá sau đó đƣợc để khô tự nhiên.
- Lƣu mẫu ở 4
o
C.
Mẫu lá xác định có nhiễm bệnh đƣợc đem phân lập vi khuẩn gây bệnh. Các bƣớc
phận lập đƣợc tiến hành nhƣ phƣơng pháp đƣợc trình bày ở mục 3.5.2.
3.5.4. Phƣơng pháp ly trích DNA từ vi khuẩn
Vi khuẩn đƣợc nhân sinh khối trong môi trƣờng LB lỏng. Sau 48 giờ nuôi cấy, thu
sinh khối và tiến hành ly trích.
Ly trích DNA theo phƣơng pháp sử dụng CTAB:

1. Thu sinh khối vi khuẩn bằng cách ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4
o
C. Rửa sinh khối
vi khuẩn đƣợc với 1 ml nƣớc cất 2 lần vô trùng, đánh tan bằng vortex (rửa 2 – 3 lần).
Ly tâm 10 000 vòng/ 5 phút/ 4
o
C.
2. Hòa tan sinh khối vi khuẩn thu đƣợc trong 567 µl dung dịch TE, đánh tan bằng
vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10%, trộn đều bằng vortex. Sau đó ủ ở 37
o
C khoảng
1 – 2 h.
3. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5M, hòa tan thật kỹ bằng vortex.
4. Thêm 80 µl dung dịch CTAB/NaCl (1/10 thể tích), pha trộn (đánh tan bằng vortex),
ủ 65
o
C trong 10 phút.


20
5. Chiết xuất dung dịch DNA với 500 µl dung dịch phenol / chloroform / isoamyl
alcohol (25:24:1). Trộn đều bằng cách lắc tay, ly tâm 14 000 vòng/ 10 phút/ 4
o
C.
6. Thu hết dung dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới .
7. Thêm 780 µl dung dịch hỗn hợp chloroform / isoamyl alcohol (24:1).Hòa lẫn đều
bằng lắc tay, ly tâm 12 000 vòng/10 phút/4
o
C.
8. Thu lấy dịch bên trên cho vào ống ly tâm mới. Kết tủa DNA với isopropanol

(2/3 thể tích dung dịch thu đƣợc), ủ ở - 20
o
C/ 30 phút. Sau đó ly tâm 12 000 vòng/ 10
phút/4
o
C. Lấy kết tủa sau ly tâm.
9. Rửa kết tủa bằng ethanol 70% ở -20
o
C, ly tâm 13 000 vòng/10 phút/4
o
C. Đổ cồn
ra hết, làm khô bằng cách cho cồn bay hơi.
10. Hòa tan kết tủa trong 40 µl dung dịch TE, đem giữ mẫu ở tủ mát 4
o
C trong suốt
thời gian tiến hành đề tài.
3.5.5. Phƣơng pháp PCR
3.5.5.1. Khuếch đại vùng 16S – 23S rDNA ITS của vi khuẩn
Phản ứng tiến hành với cặp mồi không chuyên biệt đƣợc thiết kế nhằm khuếch đại
trình tự vùng ITS (intergenic spacer sequence) nằm giữa vùng rDNA 16S và 23S
(Goncalves và Rosato, 2002):
- Xan 1330 5’ – GTT CCC GGG CCT TGT ACA CAC – 3’
- Xan 322 5’ – GGT TCT TTT CAC CTT TCC CTC – 3’
Thành phần của phản ứng đƣợc thiết lập bao gồm:
Bảng 3.1 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần
Nồng độ
Nồng độ sau cùng
Thể tích ( l)
PCR buffer

10X
1X
2,5
dNTP
1 mM
100 M
0,5
MgCl
2

25 mM
1,5 mM
0,75
Primer
5 M
0,25 M
2
DNA
25 ng / l
1,25 ng / l
1
Taq polymerase
5 unit / l
0,1 unit / l
0,2
H
2
O

18,05
Tổng cộng


25


21

Chu kỳ nhiệt của phản ứng đƣợc thiết lập theo bảng sau:
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan322
Giai đoạn
Nhiệt độ (
0
C)
Thời gian
Số chu kỳ
Biến tính
94
5 phút
1
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
94
58
72
1 phút
45 giây
1 phút

30
Hoàn thành
72
10 phút
1
Giữ mẫu
4
30 phút
1

3.5.5.2. Khuếch đại đọan DNA trong gen hrpF
Với thành phần nhƣ trên, phản ứng PCR đƣợc thực hiện với cặp mồi chuyên biệt,
đƣợc thiết kế dựa vào trình tự gen hrpF (Young Jin Park và ctv, 2004).
- XCF 5’ CGATTCGGCCATGAATGACT 3’
- XCR 5’ CTGTTGATGGTGGTCTGCAA 3’
Quy trình nhiệt của phản ứng nhƣ sau:
Bảng 3.3 Quy trình nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi XCF và XCR

3.5.6. Phƣơng pháp điện di và đọc kết quả
3.5.6.1. Điện di trên gel agarose
Cho 0,125 gram agarose vào 12,5 ml dung dịch 0,5X TAE
Giai đoạn
Nhiệt độ (
0
C)
Thời gian
Số chu kỳ
Biến tính
94

5 phút
1
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
94
58
72
15 giây
15 giây
30 giây

35
Hoàn thành
72
5 phút
1
Giữ mẫu
4
30 phút
1


22
Đun sôi hỗn hợp trên khoảng 2 phút trong lò viba (đun 2 lần, mỗi lần
1 phút)
Để nguội đến nhiệt độ khoảng 50
0
C.
Đổ gel vào bể điện di (đặt lƣợc tạo giếng trƣớc khi đổ gel), chú ý tránh

bọt khí trên gel.
Để nguội ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, cẩn thận rút lƣợc ra khỏi gel,
cho dung dịch 0,5X TAE vào bể điện di sao cho bảo đảm ngập gel
khoảng 1 – 1,5 cm.
Trộn 5 l sản phẩm PCR với 2 l loading dye 6X trên mặt giấy paraffin.
Cho hỗn hợp vào các giếng của gel: gồm có giếng thang chuẩn, giếng
đối chứng và các giếng chứa các mẫu cần xác định, vận hành máy điện
di trong 30 phút ở 100 V và 250 mA.
3.5.6.2. Đọc kết quả điện di
Sau khi điện di ngâm gel trong hỗn hợp ethidium bromide 1 l/ml và
TAE 0,5X trong 15 phút.
Rửa lại bằng nƣớc nhiều lần và đặt vào máy chụp gel hiệu Bio-Rad
(phần mềm Quantity one 2000).
Ethidium bromide liên kết với DNA sẽ phát sáng dƣới tia UV, kết quả sẽ
xuất hiện những băng sáng trên gel.
3.5.7. Phƣơng pháp xác định trình tự gen từ sản phẩm PCR
3.5.7.1. Chuẩn bị khuôn DNA
* Tinh sạch sản phẩm PCR
Sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch theo quy trình của GFX PCR and Gel band
Purification Kit (Amersham). Mục đích của việc tinh sạch là loại bỏ các hóa chất dƣ
thừa cũng nhƣ các sản phẩm ký sinh có thể có trong sản phẩm PCR mà quá trình điện
di không thể phát hiện đƣợc. Quy trình tinh sạch gồm các bƣớc nhƣ sau:
Điện di 15 l sản phẩm PCR trên gel tan ở nhiệt độ thấp (low melting agarose).
Cân một ependorf 1,5 ml và ghi nhớ khối lƣợng.
Sử dụng một mũi dao sạch để cắt band chứa đoạn DNA cần tinh sạch từ gel
(thao tác này đƣợc tiến hành dƣới tia UV trong phòng tối), cắt càng sát band chứa


23
DNA càng tốt, chuyển phần gel chứa DNA vào ependorf đã đƣợc cân từ trƣớc, dùng

đầu tip sạch cắt phần gel chứa DNA thành nhiều mảnh nhỏ hơn.
Cân ống ependorf chứa sản phẩm PCR, xác định khối lƣợng của miếng gel.
Thêm 10 l capture buffer cho mỗi 10 g gel (khả năng tối đa của cột dùng cho tinh
sạch là 300 l buffer và 300 mg gel).
Vortex nhẹ và ủ ở 60
0
C cho đến khi agarose tan hoàn toàn, thƣờng khoảng
10 – 15 phút.
Trong quá trình ủ, cho một GFX column vào collection tube.
Sau khi agarose hoàn toàn tan, li tâm 400 vòng/phút trong 10 giây để tập trung mẫu
xuống phần đáy của ependorf.
Chuyển toàn bộ mẫu vào GFX column (chú ý thao tác nhẹ bằng cách cho mẫu chảy
nhẹ theo thành column). Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 1 phút.
Li tâm 10000 vòng/phút trong vòng 30 giây.
Lấy GFX column ra, bỏ phần dịch lỏng trong collection tube, cho GFX column vào
collection tube trở lại.
Thêm 500 l wash buffer vào (thêm từ từ theo thành column), li tâm 10000
vòng/phút trong vòng 30 giây.
Lấy GFX column ra khỏi collection tube, chuyển vào một eppendoft 1,5 ml đã
đƣợc làm lạnh.
Thêm 15 l elution buffer trực tiếp vào giữa màng lọc trong GFX column. Để ở
nhiệt độ phòng trong 1 phút.
Ly tâm tốc độ 10000 vòng/phút trong 1 phút để thu mẫu DNA tinh sạch.
* Định lƣợng DNA tinh sạch
DNA sau khi tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng cách chạy điện di sản phẩm tinh
sạch cùng với DNA mass và pha loãng tới nồng độ cần thiết (John P. Curran, 2002).
Bảng 3.4 Lƣợng DNA tối ƣu cho phản ứng đọc trình tự
Sản phẩm PCR
Lƣợng
100-200 bp

200-500 bp
500-1000 bp
1-3 ng
3-10 ng
5-20 ng


24
1000-2000 bp
10-40 ng

3.5.7.2. Phản ứng đọc trình tự sử dụng BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing
Kit (Applied Biosystems)
* Thành phần hóa chất
Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự đƣợc thể hiện trong bảng sau:
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho mỗi phản ứng đọc trình tự
Sản phẩm PCR
Lƣợng
BDT mix
Buffer
DNA khuôn (580 bp)
Primer
Nƣớc khử ion
4 l
2 l
1 l
1 l
2 l
Tổng số
10 l

* Chu kỳ nhiệt của phản ứng đọc trình tự
Đặt các ống tube vào Thermal cycler và cài đặt thể tích 10 l.
Làm nóng các ống tube ở 95
0
C trong 5 phút.
Bƣớc 1:95
0
C trong 30 giây
Bƣớc 2: 50 - 55
0
C trong 10 giây 25 chu kỳ
Bƣớc 3: 60
0
C trong 4 phút
Hạ nhiệt độ xuống 4
0
C và duy trì cho tới khi tinh sạch.
3.5.7.3. Tinh sạch sản phẩm khuếch đại
Mục đích của việc tinh sạch là để loại bỏ dye terminator còn dƣ trƣớc khi điện di.
Sử dụng phƣơng pháp tinh sạch của Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa – Sinh:
Bổ sung 5 l EDTA 125 mM pH 8 vào mỗi ống sản phẩm PCR. Spin nhẹ.
Thêm vào 60 l ethnol 100 %.
Ủ tại nhiệt độ phòng 15 phút.
Ly tâm 4500 vòng/phút trong 45 phút


25
Thu tủa sau đó rửa tủa bằng 60 l ethanol 70 %.
Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút.

Loại dịch thu cặn.
Làm khô bằng máy speed vac.
Thêm vào 10 l Hidiformamide.
Biến tính ở 95
0
C trong 3 phút.
3.5.7.4. Chạy điện di và ghi nhận tín hiệu trên máy sequencer
Sản phẩm DNA sau khi khuếch đại đƣợc load vào các cột mao dẫn chứa
polymer để điện di phân tích kết quả.
Kết quả thu đƣợc từ tín hiệu huỳnh quang sẽ đƣợc ghi nhận bằng phần mềm của
máy sequencer.
3.5.7.4. Quy trình tóm tắt các bƣớc đọc trình tự

















Hình 3.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình đọc trình tự sản phẩm PCR.

Sản phẩm PCR
Tinh sạch
GFX PCR DNA and gel
band Purification kit
Phản ứng đọc trình tự
Hóa chất:
BDT mix
Buffer
DNA khuôn
Primer
Nƣớc khử ion

Chu kỳ nhiệt:
95
0
C/5 phút
95
0
C/30 giây
55
0
C/10 giây
60
0
C/4 phút

25
chu kỳ
Tinh sạch

Điện di, ghi nhận tín hiệu