Luận văn : XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH DANH VI KHUẨN GÂY BỆNH LOÉT TRÊN CÂY BƯỞI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ part 3 docx

23




chính xác 4 dòng phân lập đƣợc là Xanthomonas axonopodis pv.citri . (theo Dong Suk
Park và ctv, 2005).
XACF 5’ CGTCGCAATACGATTGGAAC 3’
XACR 5’CGGAGGCATTGTCGAAGGAA 3’
Bảng 3.4. Hỗn hợp thực hiện phản ứng PCR.

Bảng 3.4. Chu trình nhiệt phản ứng PCR







3.5.6. Điện di kiểm tra sản phẩm ly trích và sản phẩm PCR
 Dụng cụ và thiết bị

Hóa chất
- Cân kĩ thuật 4 số, ống đong - Agarose
- Lò viba - TAE 0,5X
- Khay đổ gel - Loading dye 6X
- Bồn và máy điện di - Ethidium bromide
- Máy chụp hình gel (Gel doc)
Thành phần
Nồng độ ban đầu
Nồng độ sau phản ứng

Thể tích (µl)
PCR buffer
10X
1X
2,5
dNTPs
25mM
0,2mM
0,2
MgCl
2

25 mM
1,5mM
1,5
Primer
100pM
10pM
0,25
Taq polymera se
5unit/1µl
2unit/1µl
0,4
DNA
<=100ng
<=50ng
1
H
2
O

19,25
Tổng cộng


25
Các bƣớc phản ứng
Nhiệt độ
Thời gian
Giai đoạn khởi động
Chạy chu kỳ (25 chu kỳ)
Tách DNA khuôn
Ủ và bắt cặp
Kéo dài
Giai đoạn kết thúc
94
o
C

94
o
C
60
o
C
72
o
C
72

o
C
5 phút

15giây
30giây
30giây
7phút
24




Bảng 3.6. Thành phần dung dịch TAE 50X
Thành phần
Thể tích 1 lít
Tris base 2M
242 g
Glacial acetic acid
57,1 ml
EDTA 0,5 M, pH 8.0
100 ml
 Quy trình thực hiện
1. Chuẩn bị gel agarose để điện di DNA
- Chuẩn bị dung dịch TAE 1X, cho dung dịch TAE 1X vào hộp điện di.
- Pha dung dịch agarose 0,8 %, gồm agarose và dung dịch TAE 1X.
- Đun sôi dung dịch agarose trên lò viba đến khi agarose tan hoàn toàn. Nếu
quá trình đun mất nhiều nƣớc thì cần bổ dung thêm dung dịch TAE 1X cho đủ
nồng độ yêu cầu.
- Để lên máy lắc cho dung dịch tan đều. Đợi đến khi nhiệt độ dung dịch

agarose xuống còn 55
0
C thì đổ vào khai điện di có cài sẳn lƣợc. Chiều dày gel
khoảng 5 mm là thích hợp.
- Sau khi gel cứng, di chuyển lƣợc ra khỏi gel và đặt khai vào bể điện di chứa
TAE 1X sau cho gel ngập trong dung dịch. Chú ý nhẹ tay tránh bọt khí.
2. Tiến hành chạy điện di
-Lấy một mẫu giấy parafilm, nhỏ những giọt loading buffer lên (mỗi giọt có thể
tích khoảng 2 l). Cho thêm 5 l DNA lên mỗi giọt loading buffer và trộn đều.
Dùng pipetman hút hỗn hợp DNA cho vào giếng của khai điện di.
-Đậy nắp gel và cho chạy điện di, dòng điện cung cấp: 100 vol, 250 mA, định
thời gian cho gel chạy (tùy vào sự duy chuyển của băng).
-Tắt điện, đem gel nhuộm Ethidium bromide và mang gel đi chụp ảnh với tia
UV thông qua phần mềm Quantity on.


25




XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Phân lập, xác định gram vi khuẩn gây bệnh loét ở cây bƣởi da láng và bƣởi
đƣờng cam
Chúng tôi đã tiến hành phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn trên các cây ký chủ khác
nhau và bằng dung dịch KOH 3% đã xác định đƣợc tât cả là gram âm.
Bảng 4.1. Kết quả phân lập và xác đinh gram
Địa điểm thu mẫu

Cây ký chủ
Dòng vi
khuẩn
Đặc tính
Tỉnh Đồng Nai
Bƣởi Da Láng


XBDL1
XBDL2
XBDL3
Gram âm
Gram âm
Gram âm
Bƣởi đƣờng Cam
XBĐC3
Gram âm
4.2 Kết quả nuôi cấy vi khuẩn gây bệnh loét trên môi trƣờng PGA và YDC
Bảng 4.2. Hình thái vi khuẩn phân lập đƣợc từ bƣởi Da Láng và Đƣờng Cam

Dòng vi khuẩn
PGA
YDC
XBDL1
Vàng, sáp, tròn vun
Vàng sữa, sáp, tròn vun
XBDL2
Vàng lợt, sáp, tròn vun
Vàng sữa, sáp, tròn vun
XBDL3
Vàng, sáp, tròn vun
Vàng sữa, sáp, tròn vun
XBĐC3
Vàng đậm, sáp, tròn vun
Vàng chanh, sáp, tròn vun
26




XBDL1 XBDL2 XBDL3 XBĐ C3
Hình 4.1. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc trên môi trƣờng
PGA ở nhiệt độ 28
o
C sau 48 giờ.

Hình 4.2. Sự phát triển của các dòng vi khuẩn phân lập
đƣợc trên môi trƣờng YDC ở nhiệt độ 28
o
C sau 48 giờ.
Dựa vào hình thái của khuẩn lạc có thể thấy rõ 4 dòng vi khuẩn có thể chia 2
nhóm: nhóm XBDL1, XBDL2, XBDL3 có màu sữa trên môi trƣờng YDC và nhóm có
màu vàng chanh là XBĐC3. Trên môi trƣờng PGA cũng có sự phân biệt về màu sắc
tƣơng tự nhƣng chƣa rõ rệt.
4.2. Chủng bệnh bệnh nhân tạo
Tiến hành chủng bốn dòng vi khuẩn trên lá Da Láng. Kết quả là cả bốn dòng
đều tạo vết bệnh. (Bảng 4.3)
Dựa trên kết quả chủng bệnh, có thể kết luận:
-Dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 khi chủng trên lá Da Láng tạo vết
bệnh rõ chứng tỏ dòng vi khuẩn phân lập đƣợc là dòng có khả năng gây bệnh.
-Dòng vi khuẩn phân lập trên trái bƣởi Đƣờng Cam khi chủng trên lá Da Láng
vẫn có khả năng gây bệnh. Nhƣ vậy, ký sinh và ký chủ chƣa có tính chuyên biệt cao.
Để khẳng định chính xác đặc tính này cần phải tiến hành chủng nhân tạo trên nhiều ký
chủ khác nhau.
- Khi so sánh vết bệnh chủng trên lá Da Láng giữa hai dòng XBDL2 và XBDL3
dƣới kính hiển vi, độ phóng đại 40 lần nhận thấy có sự khác biệt rõ rệt. Dòng XBDL2
gây vết bệnh phồng, mọng nƣớc, viền xanh (hình 4.3.(c)) trong khi dòng XBDL3
không phồng, hơi lõm, viền xanh đậm lan ra, gờ nhẹ (hình 4.3.(d)). Điều này chứng tỏ
tính độc khi gây bệnh của hai dòng này khác nhau. Để xác định rõ đặc tính này, tiến
hành tiếp các thí nghiệm mức sinh học phân tử để tìm ra sự khác biệt này. (hình 4.3)
27

Bảng 4.3. Khả năng nhiễm bệnh của 4 dòng vi khuẩn: XBDL1, XBDL2, XBDL3,
XBĐC3 trên lá da láng.
Giống
Thời gian
xuất hiện
bệnh
Tổng số đốm
bệnh/ Tổng số
vết thƣơng
Mô tả triệu
chứng bằng
mắt thƣờng
Triệu chứng bệnh qua kính
hiển vi (độ phóng đại 4x10)
XBDL1
3 ngày
96%
Gờ nhẹ
Viền màu xanh, mọng nƣớc,
bên trong sùi nhẹ.
XBDL2
2 ngày
95%
Gờ nhẹ
Viền màu xanh đậm, mọng
nƣớc, bên trong vết bệnh sùi
lên cao.
XBDL3

3 ngày
98%
Gờ nhẹ
Vết bệnh lan rộng, xung
quanh viền màu xanh đậm,
bên trong không sùi.
XBĐC3
3 ngày
90%
Gờ nhẹ
Vết bệnh phồng nhẹ, viền màu
xanh, bên trong không sùi.











Hình.4.3. Các triệu chứng bệnh sau khi chủng vi khuẩn lên lá non bƣởi Da
Láng (a) không chủng vi khuẩn; (b) chủng dòng XBDL1, (c) chủng dòng
(e)
(d)
(c)
(a)
(b)

28




XBDL2; (d) chủng dòng XBDL3; (e) chủng dòng XBĐC3. Tổng số vết
thương là 50

ix



4.3. Sắc ký định danh vi khuẩn gây bệnh
Tiến hành sắc ký bản mỏng trên các dòng: XBDL1, XBDL2, XBDL3, XTĐC3
và một dòng đối chứng âm là Erwinia sp. Mục đích của chạy sắc ký bản mỏng là để
khẳng định các dòng phân lập đƣợc là Xanthomonas sp.
Kết quả khi chƣa chụp UV: đối chứng âm không ra, dòng XBDL1, XBDL2,
XBDL3, XBĐC3 đều có vệt màu vàng.
Kết quả khi chụp UV: chỉ có một dòng XBDL1 phát sáng rõ rệt nhất, các dòng
XBDL2, XBDL3, XBĐC3 chỉ có vệt mờ nhƣng giá trị Rf >0.45 theo mục 3.4.3 Rf=0.45
mới khẳng định đƣợc đó là Xanthomonas sp. Nhƣ vậy, dựa vào kết quả sắc ký không thể
kết luận dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 là Xanthomonas sp. Để có thể định
danh đƣợc bốn dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 chúng tôi thực hiện khuếch đại
vùng 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi Xan1330 và Xan332 (M.H.R Khoodoo và ctv,
2005).

Hình 4.4. Kết quả sắc ký : (a) không chụp UV ; (b) chụp UV. (-) dòng
Erwinia sp;1 dòng XBDL3;2 dòng XBĐC3; 3 dòng XBDL1; 4 dòngXBDL2
4.4 Ly trích DNA tổng số
Tiến hành ly trích DNA từ 4 dòng XBDL1, XBDL2, XBDL3, XBĐC3 đã đƣợc
nhân sinh khối. Mỗi dòng tiến hành ly trích 2 lần, kết quả thể hiện ở hình 4.5



Rf=0.5
(a)
(-) 1 2 3 4

(b)
(-) 1 2 3 4
1 2 3 4 1 2 3 4
DNA tổng số

x

Hình 4.5. DNA tổng số ly trích theo quy trình 3.4.4 (Sambrook và ctv, 2001
đã có cải tiến).
Ghi chú: 1 dòng XBDL1, 2 dòng XBDL2, 3 dòng XBDL3, 4 dòng XBĐC.
Nhận xét: Qua hình 4.5 cho thấy quy trình ly trích theo mục 3.4.4 (Sambrook và
ctv, 2001 đã có cải tiến) đã ổn định, nhƣng kết quả chƣa sạch. Ngoài DNA tổng số còn
có DNA bị gãy, phần tạp nhiễm trong quá trình ly trích tạo thành vệt sáng cuối giếng.
Các dòng XBDL1, XBDL3 là bị tạp nhiễm nhiều nhất. Để thực hiện phản ứng PCR,
DNA tổng số phải đƣợc pha loãng xuống.
4.5. Thực hiện PCR với cặp mồi Xan1330 và Xan 332 trên vùng ITS
Tiến hành phản ứng PCR theo 3.4.5.1 thu đƣợc kết quả nhƣ hình 4.6









Hình 4.6.cho thấy sản phẩm PCR của 4 dòng phân lập đƣợc có cùng kích thƣớc
với dòng Xanthomonas sp đã đƣợc phân lập và định danh trên cây cải ngọt. Dòng
1.1kb
1 2 3 4 5
Hình 4.6. Sản phẩm PCR đoạn 16s-23s rDNA ITS
Ghi chú: 1- sản phẩm PCR của Xanthomonas sp đã
được định danh.
sử dụng sản phẩm này như đối chứng dương;
2- sản phẩm PCR của dòng XBDL1
3-sản phẩm PCR của dòng XBDL2

4-sản phẩm PCR của dòng XBDL3
5-sản phẩm PCR của dòng XBĐC3



xi



Xanthomonas sp này đã đƣợc định danh chính xác là Xanthomonas campestris pv.citri
cùng thời gian thực hiện đề tài. Để xác định rõ loài của 4 dòng gây bệnh có 2 phƣơng
pháp là giải trình tự hoặc tiếp tục thực hiện phản ứng PCR trên đoạn primer chuyên
biệt. Với điều kiện hiện có, chúng tôi tiếp tục thực hiện phản ứng PCR trên hrpW gen
với cặp primer chuyên biệt là XACR và XACF ( Dong Suk Park và ctv).
4.6 Thực hiện PCR với cặp mồi XACR và XACF trên hrpW gen
Thực hiện phản ứng theo mục 3.4.5.2 nhƣng kết quả không thành công. Tiếp
tục thực hiện phản ứng đồng thời thay đổi nồng độ thành phần nhƣng kết quả vẫn
không ra. Do đó, chƣa thể khẳng định 4 dòng phân lập đƣợc từ bƣởi Da Láng và bƣởi
Đƣờng Cam tại Đồng Nai là Xanthomonas. axonopodis pv. citri.
Nhận xét lý do kết quả không thực hiện đƣợc:
-Chất lƣợng DNA mẫu chƣa tốt, còn tạp nhiều.
-Nguồn vi khuẩn phân lập còn ít.
 Dựa vào kết quả đạt đƣợc có thể rút ra thảo luận: phƣơng pháp sinh học
phân tử có thể hổ trợ cho phƣơng pháp định danh bằng nuôi cấy, thử nghiệm sinh
hóa. Phƣơng pháp sinh học phân tử cụ thể là phƣơng pháp PCR, giải trình tự có thể
định danh ở mức loài, tìm ra loài mới, nghiên cứu đƣợc sự đa dạng di truyền: năm
2002, Edmilson R.Goncalves và ctv đã tiến hành phân tích mối quan hệ di truyền giữa
17 loài Xanthomonas.sp bằng thực hiên phản ứng PCR và đọc trình tự sản phẩm
PCR.Phản ứng đƣợc thực hiện với cặp mồi Xan1330 và Xan332 đƣợc thiết kế trên
đoạn 16s-23s rDNA ITS.

Dựa trên kết quả phân tích và thực hiện các thí nghiệm có thể đƣa ra những
bƣớc cơ bản để định danh dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây có múi dựa trên kỹ
thuật sinh học phân tử. Các bƣớc cơ bản đó là :(Hình 4.7)






xii

(5b)
(5a)
(4)
(3b)
Phân lập, nuôi cấy, quan sát hình thái đặc trƣng trên các môi trƣờng khác
nhau, xác định gram (N.W. Schaad và ctv, không rõ năm )

Chủng bệnh nhân tạo để kiểm tra lại triệu chứng gây bệnh của dòng vi
khuẩn phân lập đƣợc ( N.W. Schaad và ctv, không rõ năm )

Kiểm tra sinh hóa
(N.W. Schaad và R. E.
Stall, không rõ năm )

Thực hiện sắc ký bản mỏng dựa vào sắc tố
đặc trƣng để nhận biết dòng
Xanthomonas.sp (N.W. Schaad và R. E.
Stall, không rõ năm )
Thực hiện phản ứng PCR trên 16s-23s r DNA ITS
với cặp primer Xan1330, Xan332 (M. H. R.
Khoodoo và ctv, 2005)

Giải trình tự sản phẩm PCR, đối
chiếu kết quả trên http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST
Tiến hành PCR trên vùng hrpW gen với
cặp mồi chuyên biệt XACR và XACF
cho phép xác định nhanh Xanthomonas
axonopodis pv. citri
( Dong Suk Park và ctv, 2006)
Hình 4.7. Các bƣớc cơ bản để định danh dòng vi khuẩn gây bệnh loét trên cây
có múi dựa trên kỹ thuật sinh học phân tử.

(1)
(2)
(3a)

xiii



Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
- Đã phân lập đƣợc 4 dòng vi khuẩn gây bệnh theo mục 3.4.1.
- Phƣơng pháp chủng bệnh nhân tạo theo mục 3.4.2 thể hiện tất cả các dòng
phân lập đƣợc đều có khả năng gây bệnh, có thể sử dụng trên các đối tƣợng là cây có
múi.
- Thực hiện đƣợc phƣơng pháp sắc ký bản mỏng theo quy trình 3.4.3. Tuy
nhiên, kết quả không nhƣ mong muốn chƣa thể khẳng định các dòng đƣợc phân lập là
Xanthomonas sp. Nhƣng sản phẩm PCR trên vùng 16s-23s rDNA ITS với cặp mồi

Xan1330 và Xan 332 (theo M. H. R Khoodoo và ctv, 2005) cho thấy 4 dòng đều có
băng sản phẩm bằng nhau và bằng sản phẩm PCR của dòng Xanthomonas
campestrispv.citri đã đƣợc định danh trên cùng cặp mồi.
- Quy trình ly trích theo mục 3.4.4 đã ổn định.
- Quy trình thực hiện phản ứng PCR trên đoạn 16s-23s rDNA ITS theo mục
3.4.5.1 cho kết quả ổn định.
* Nhƣ vậy, dựa trên kết quả các bƣớc tiến hành chỉ kết luận đƣợc rằng dòng vi
khuẩn gây bệnh loét trên cây bƣởi Da Láng, bƣởi Đƣờng Cam ở huyện Vĩnh Cữu, tỉnh
Đồng Nai là do Xanthomonas sp. .
5.2 Đề nghị
- Tiến hành đọc trình tự sản phẩm PCR trên đoạn 16s-23s rDNA để định danh
rõ loài vi khuẩn gây bệnh.
-Tiến hành phân lập nhiều dòng gây bệnh trên nhiều đối tƣợng cây có múi, ở
nhiều nơi khác nhau. Tiến đến phân tích đa dạng di truyền, tìm và định danh loài mới.
-Tiến hành tinh sạch DNA ly trích trƣớc khi thực hiện phản ứng PCR trên hrp
gen.




xiv



Phần 6. TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt
1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử: Những nguyên
tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh,
Việt Nam.

2. Đƣờng Hồng Dật, 1976. Sổ tay bệnh hại cây trồng tập1. NXB Nông Thôn, Việt
Nam.
3. Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản Giáo Dục.
4. Nguyễn Thị Tiến Sỹ, 2005. Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự da dạng di
truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau,
luận văn tốt nghiệp bộ môn Công Nghệ Sinh Học trƣờng Đại Học Nông Lâm
tp.HCM
5. GS.TS Trần Thế Tục, 1998. Giáo trình cây ăn quả, NXB Nông Nghiệp, Hà
Nội, Việt Nam.
6. Vi Thị Thanh Hƣờng, 2005. Nghiên cứu tác nhân và biện pháp phòng trừ
bệnh loét trên cây bưởi ở xã Tân Bình - huyện Vĩnh Cửu -tỉnh Đồng Nai, luận
văn tốt nghiệp khoa Nông Học trƣờng Đại Học Nông Lâm tp.HCM.
7. Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nông nghiệp,
NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam.
.
Tiếng Anh

8. Dong Suk Park, Jae Wook Hyun, Young Jin Park, Jung Sun Kim, Hee Wan
Kang, Jang Ho Hahn, Seung Joo Go, 2006, Sensitive and specific detection of
Xanthomonas axonopodis pv.citri by PCR using pathovar specific primers
based on hrpW gene sequences; Microbiological Research 161:145-149.

xv



9. Elmilson .R. Goncalves and Yoko B. Rosato, 2002. Phylogenetic analysis of
Xanthomonas species based upon 16S-23S r DNA intergenic spacer
sequences, International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, 52: 355-361.

10. Marcos C Alegria, Cassia Docena, Leticia Khater, Carlos H.I. Ramos. Ana
C.R. da Silva and Chuck S.Farah, 2004, Identified for the regulatory and
structural components and substrates of the Type III secretion system of the
phytopathogen Xanthomonas axonopodis pathovar citri, 186(18):6186-6197.
11. M.H.R.Khoodoo, F. Sahin, M.F. Donmez, Y. Jaufeerally Fakim, 2005.
Molecular characterization of Xanthomonas strains isolated from aroids in
Mauritius. Systematic and Applied Microbiolog 28: 366-380.
12. Jung Gun Kim, Byoung Keun Park, Chang Hyun Yoo, Eun Kyung Jeon,
Jonghe e Oh and Ingyu Huang, 2003. Characterization of the Xanthomonas
axon -opodis pv. glycines hrp pathogenicity Island. American Society for
Microbiology 185(10):3155-3166.
13. Sambrook Joseph and Rusell W.David, 2001. Molecular Cloning A
Laboratory Manual. Volume 1. 3
rd
edition, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, New York.

Trang web.
"








xvi

Phần 7. PHỤ LỤC
1. Môi trƣờng PGA (Potato Glucose Agar)
Trong 1lit
Khoai tây 200g
Glucose 20g
Agar 18-20g
2. Môi trƣờng YDC (Yeast extract Dextrose Calcium carbonate)
Yeast extract 10g
Dextrose 20g
Calcium carbonate 20g
Agar 15g
3. Môi trƣờng SX
Tinh bột (khoai tây) 10g
Beef extract 1.0g
Ammonium chloride 5.0g
Dipotassium phosphate 2.0g
Methyl violet 2B 2ml
Agar 15.0g
Sau khi hấp khử trùng thêm Cycloheximide 5ml
4. Môi trƣờng SM
KH
2
PO
4
1.0g
Na
2
HPO
4

2.6g
NH
4
Cl 1.0g
NaCl 2.0g
MgSO
4
.7H
2
O 0.2g
CaCl
2
.2H
2
O 67.0ml

xvii



Glucose 1.0g
L-Methionine 0.2g
Khoai tây 10g
Methyl violet 2B 1.0ml
Methyl green 2.0ml
Trace element solution 1.0ml
Triphenyltetrazolium chloride1.0ml
Cycloheximide 50.0 mg
Agar 20.0g
5. Môi trƣờng NSCAA

Nutrient aga r 23.0g
Tinh bột 15.0g
Aga r 15.0g
Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào: Cycloheximide 5ml
Nitrofurantin 1.0ml
Vancomycin 1.0ml
6. Môi trƣờng XTS
Nutrient aga r 23.0g
Gluco se 5.0g
Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào Cycloheximide 2.0ml
Gentamycin 0.5ml
Cephalexin 1.0ml

7. Môi trƣờng MD-5
D-cellobiose 10.0g*
K
2
HPO
4
3.0g

xviii



Na
2
H
2
PO

4
1.0ml
NH
4
Cl 1.0g
MgSO
4
.7H
2
O 0.3g
Cycloheximide 0.2g*
Agar 15.0g
Thêm* vào sau khi hấp tiệt trùng.
8. Môi trƣờng XCS agar
Lactose 10.0g
D (+) trehalose 4.0g
K
2
HPO
4
0.8g
KH
2
PO
4
0.8g
NH
4
Cl 1.0g
Yeast extract 0.5g

Agar 15.0g
Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào Tobramycin 1.0ml
Ampicillin 0.5ml
Vancomycin 0.5ml
Cycloheximide 5.0ml
9. M ôi tr ƣ ờng TWEEN
Pepton 10.0g
Potassium bromide 10.0g
Calcium cloride 250.0mg
Aga r 15.0g
Sau khi hấp tiệt trùng thêm vào Tween 80 10.0g
Cephalexin 25.0mg
5-Fluorouracil 6.0mg

xix



Tob ramycin 0.4mg
Cyclohexinmide 75.0mg