Luận văn : PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƯƠNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR part 3 pdf

4.1.3. Kết quả tách đơn bào tử
Để chuẩn bị tốt nguồn nấm cho các thí nghiệm kế tiếp, tôi đã tiến hành tách
đơn bào tử với mục đích tạo ra khuẩn lạc đồng nhất về mặt di truyền. Do bào tử
của nấm Corynespora cassiicola có kích thước lớn nên có thể quan sát và tiến hành
tách đơn bào tử rất dễ dàng trên kính hiển vi quang học.
Bảng 4.2: Các dòng nấm đƣợc tách đơn bào tử
STT
đƣợc mã hóa
Kí hiệu
của dòng vô tính cao su
Tên dòng vô tính
cao su
1
RRIV2
LH82/122
3
26/20
LH9/0023
6
29/93
LH99/0053
7A
4/48
LH99/0081
7B
4/48
LH99/0081
11
28/37

LH99/0093
12
19/38
LH99/0098
14
4/84
LH99/0131
19
32/86
LH99/0337
23
1/24
LH99/0374
28
2/55
LH99/0412
30
30/88
LH99/0431
35
21/55
LH99/0617
42
7/70
LH99/0679
52
19/82S
LH99/0050
53
29/93S

LH99/0053
54
28/81S
LH99/0112
55
22/25S
LH99/0216
59
7/8S
LH99/0636
60
22/70S
LH99/0675
62
10/11S
LH99/0757
63
10/34S
LH99/0778
64
16/28S
LH99/0672
65
RRIV4



Nấm Corynespora cassiicola là một loại nấm rất khó phát sinh bào tử trên môi
trường nhân tạo (có thể do môi trường nuôi cấy chưa thích hợp hoặc do chế độ ánh
sáng không thích hợp). Do đó, để có bào tử chúng tôi đã tiến hành kích thích cho

nấm này phát sinh bào tử bằng cách:
- Tạo vết thương trên bề mặt khuẩn lạc bằng kim lưỡi mác hoặc lame vô trùng.
- Sau đó tiến hành ủ khuẩn lạc trong tối 3 ngày.
- Rồi đem khuẩn lạc chiếu sáng 3 ngày liên tiếp, khuẩn lạc sẽ phát sinh bào tử.
Bào tử nấm Corynespora cassiicola có màu nâu nhạt, hình bầu dục, nhiều vách
ngăn, chiều dài biến thiên (có thể dài tới 700 m) (Phan Thành Dũng, 2004;
Nguyễn Thị Huệ, 1997). Chúng tôi đã tiến hành tách đơn bào theo quy trình ở Mục
3.3.1.4. Tuy nhiên, do một số nguyên nhân như số lượng mẫu lớn, nấm khó sinh
bào tử trên môi trường nhân tạo, thời gian thực hiện ngắn… nên chúng tôi chỉ tiến
hành tách thành công được một số dòng nấm (xem Bảng 4.2).
Đồng thời trong quá trình tách đơn bào tử, tôi nhận thấy khuẩn lạc hình thành
từ 2 đơn bào tử của một số dòng nấm có nhiều điểm khác nhau như hình dạng, kích
thước, màu sắc (Hình 4.4). Như vậy rất có thể có nhiều dòng nấm cùng ký sinh
trên một ký chủ tại thời điểm phân lập nấm nhưng cũng có thể chỉ là sự thay đổi
màu sắc khuẩn lạc của một dòng nấm. Chúng tôi đã mã hóa hai khuẩn lạc (có màu
sắc) thu được từ một dòng nấm thành hai dòng khác nhau để đánh giá sự khác biệt
về mặt di truyền. Và ký hiệu là A và B.

Hình 4.4: Sự khác biệt giữa 2 khuẩn lạc thu đƣợc từ 2 đơn bào tử của một
dòng nấm
7A
7B



4.1.3. Kết quả nhân sinh khối
Bào tử thu được sau khi tách đơn bào tử sẽ phát triển thành khuẩn lạc. Tiến
hành chuyển sinh khối sợi nấm từ đĩa petri sang bình tam giác để tăng nhanh sinh
khối. Các bình tam giác này chứa môi trường PGA lỏng và được lắc ở 160
vòng/phút, ở nhiệt độ 28

o
C. Sau khoảng 3 – 4 ngày, khi sinh khối đã đạt được
lượng cần thiết ta tiến hành thu sinh khối (Hình 4.5).

Hình 4.5: Sinh khối nấm sau 4 ngày lắc
Trong quá trình nhân sinh khối, đã thu nhận được sinh khối có 2 màu khác
nhau là màu đen và màu vàng. Có thể giải thích là do chế độ ánh sáng chưa phù
hợp nên sinh khối có màu sắc khác nhau. Vấn đề thường gặp trong giai đoạn này là
rất dễ bị nhiễm khuẩn, đặc biệt là trong ngày thứ nhất và thứ hai. Tuy theo dõi từng
ngày trong quá trình lắc nhưng do lắc liên tục nên rất khó phát hiện bị nhiễm khuẩn
trong khi lắc. Để đảm bảo không bị nhiễm khuẩn, trước khi thu sinh khối ta tiến
hành quan sát dịch lỏng trên kính hiểu vi quang học để kiểm tra sự có mặt của vi


khuẩn (chỉ là phương pháp tương đối). Thông thường, mẫu bị nhiễm khuẩn sẽ bị
đục trong khi lắc.
4.2. Kết quả ly trích và tinh sạch DNA sợi nấm
Các dòng nấm Corynespora cassiicola sau khi nhân sinh khối sẽ thu nhận sợi
nấm và tiến hành li trích DNA tổng số. DNA của sợi nấm được li trích theo qui
trình của Lee & Taylor (1990). Kết quả li trích DNA tổng số cho kết quả khá tốt,
số lượng tạp (chủ yếu là RNA, protein) tương đối ít (Hình 4.6). DNA sau khi li
trích sẽ được tinh sạch và pha loãng đến mức độ có thể chạy được PCR (band
DNA xuất hiện trên gel điện di ở dạng vệt (track)).

Hình 4.6: Kết quả li trích của 24 dòng nấm khác nhau
Ghi chú:
L1: 1 (LH82/122) L6:11 (LH99/0093) L11: 28 (LH99/0412)
L2: 3 (LH9/0023) L7: 12 (LH99/0098) L12: 30 (LH99/0431)
L3: 6 (LH99/0053) L8: 14 (LH99/0131) L13: 35 (LH99/0617)
L4: 7A (LH99/0081) L9: 19 (LH99/0337) L14: 42 (LH99/0679)

L5: 7B (LH99/0081) L10: 23 (LH99/0374) L15: 52 (LH99/0050)
L16:53 (LH99/0053) L19: 59 (LH99/0636) L22: 63 (LH99/0778)
L17: 54 (LH99/0112) L20: 60 (LH99/0675) L23: 64 (LH99/0672)
L18: 55 (LH99/0216) L21: 62 (LH99/0757) L24: 65 (RRIV4)


Theo Hình 4.6 thì độ đậm hay nhạt của band DNA có thể là do số lượng sợi
nấm sử dụng không đều hoặc do chất lượng sợi nấm sau khi nhân sinh khối hoặc
do đèn chụp UV không tốt.
Tiến hành lấy sản phẩm li trích đem tinh sạch thu được kết quả tinh sạch sản
phẩm DNA ly trích là rất tốt (Hình 4.7).
Hình 4.7: DNA tổng số đã tinh sạch
Ghi chú:
L1: 3 (LH9/0023) L6: 14 (LH99/0131) L11: 52 (LH99/0050)
L2: 7A (LH99/0081) L7: 23 (LH99/0374) L12: 53 (LH99/0053)
L3: 7B (LH99/0081) L8: 28 (LH99/0412) L13: 54 (LH99/0112)
L4: 11 (LH99/0093) L9: 35 (LH99/0617) L14: 55 (LH99/0216)
L5: 12 (LH99/0098) L10: 42 (LH99/0679) L15: 59 (LH99/0636)
L16: 60 (LH99/0675) L17: 62 (LH99/0757) L18: 63 (LH99/0778)
L19: 64 (LH99/0672) L20: 65 (RRIV4)
Tuy nhiên, trong quá trình tinh sạch có 4 dòng nấm không cho kết quả tốt. Đó là
các dòng: 1, 6, 19, 30. Điều này có thể được giải thích là do lượng DNA mẫu sử
dụng tinh sạch không tốt hay quá ít. Do đó, khi điện di kết quả tinh sạch không cho
kết quả như mong muốn. Chúng tôi đã tiến hành tinh sạch lại nhưng vẫn không
thành công.
4.3. Kết quả khuếch đại vùng ITS của nấm nhờ PCR
Hiện nay, để nghiên cứu sự đa dạng di truyền của các dòng nấm phương pháp
thông dụng nhất là đánh giá trên vùng gene mã hóa cho các rRNA. Vùng gene này
nằm cả trong nhân và ty thể, chúng mã hóa cho hai tiểu đơn vị lớn rRNA và tiểu

đơn vị nhỏ rRNA 5,8S. Trong vùng gene này có chứa các vùng bảo tồn và các
vùng có khả năng biến dị.
Các vùng gene mã hóa cho các tiểu đơn vị có tính bảo tồn cao hơn các vùng
gene nằm xen kẽ các trình tự mã hóa đó. Hai vùng thường được sử dụng để nghiên
cứu tính đa dạng di truyền là hai vùng có tính biến dị cao đó là vùng ITS (internal
transcribed spacers) và vùng IGS (intergenic spacers).
Vùng ITS là vùng không có chức năng mã hóa nhưng có khả năng biến dị, nằm
giữa các vùng mã hóa có tính bảo tồn cao. Do vậy mà vùng ITS được sử dụng rất
nhiều trong nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể.
Trong nghiên cứu này, tôi sử dụng 2 primer là ITS A và ITS B (được thiết kế
bởi Silva và cộng sự, 1998) để khuếch đại đoạn DNA nằm giữa đầu 3’ của rDNA
18S và đầu 5’ của rDNA 28S. Hai primer này khuếch đại đặc trưng một đoạn DNA
có kích thước 540 bp của vùng ITS nấm.
Kết quả đã khuếch đại được đoạn DNA nằm giữa 2 primer. Khi tiến hành PCR
theo chu trình nhiệt và hàm lượng primer trong phản ứng của Silva và cộng sự
(1998), tôi có thu được đoạn DNA có kích thước 540 bp.





Hình 4.8: Sản phẩm PCR theo quy trình cũ của Silva và cộng sự (1998)
Tuy nhiên, theo Hình 4.8 thì lượng sản phẩm tạp là tương đối lớn. Sản phẩm
tạp này có thể do nhiều nguyên nhân như lượng DNA mẫu cao, nhiệt độ bắt cặp
thấp, số lượng chu kỳ nhiều, lượng primer và dNTPs cho một phản ứng quá
nhiều… Và tôi đã tiến hành thay đổi một vài yếu tố trong phản ứng PCR và đã thu
được sản phẩm rất đặc hiệu, không có tạp (Hình 4.9). Trong các yếu tố của phản
ứng PCR được khảo sát thì tôi nhận thấy cần phải tăng nhiệt độ bắt cặp và giảm
Tạp

Sản phẩmPCR


lượng primer trong mỗi phản ứng PCR thì vừa tiết kiệm primer lại vừa giảm được
sản phẩm tạp.
Hình 4.9: Sản phẩm PCR theo qui trình mới
Ghi chú: Điện di ở hiệu điện thế 50 V, nồng độ agarose 1,5%, thời gian 90 phút.
L1: 3 (LH9/0023) L6: 14 (LH99/0131) L11: 52 (LH99/0050)
L2: 7A (LH99/0081) L7: 23 (LH99/0374) L12: 53 (LH99/0053)
L3: 7B (LH99/0081) L8: 28 (LH99/0412) L13: 54 (LH99/0112)
L4: 11 (LH99/0093) L9: 35 (LH99/0617) L14: 55 (LH99/0216)
L5: 12 (LH99/0098) L10: 42 (LH99/0679) L15: 59 (LH99/0636)
L16: 60 (LH99/0675) L18: 63 (LH99/0778) L19: 64 (LH99/0672)
L17: 62 (LH99/0757) L20: 65 (RRIV4) L21: Đối chứng âm
Sau nhiều lần thay đổi, chúng tôi đã đưa ra một quy trình PCR tương đối ổn
định cho việc khuếch đại vùng ITS của nấm C. cassiicola bằng cặp primer ITS A và
ITS B. Thành phần phản ứng PCR sau khi thay đổi được mô tả trong Bảng 4.3.
Bảng 4.3: Thành phần phản ứng PCR đã có thay đổi
Thành phần Liều lƣợng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối
dNTP 0,25 10 mM 0,1 mM
10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X
MgCl
2
1 25 mM 1 mM
ITS A 0,4 25 pM/ l 10 pM
ITS B 0,4 25 pM/ l 10 pM
Taq polymerase 0,1 5U 0,5U
Khuôn mẫu 1
Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l
540bp

Chu trình nhiệt có sự thay đổi, gồm 40 chu kỳ:
- Chu kỳ 1:
Biến tính: 94
o
C 3 phút.
Biến tính: 94 C 2 phút.
Bắt cặp: 57 C 1 phút.
Kéo dài: 72 C 1 phút.
- 38 chu kỳ tiếp theo:
Biến tính: 94 C 1 phút.
Bắt cặp: 57 C 1 phút.
Kéo dài: 72 C 1 phút.
- 1 chu kỳ cuối:
Kéo dài: 72 C 9 phút.
Giữ ở 4
o
C: 10 phút.

4.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola
Để phân tích sự khác nhau về mặt di truyền có rất nhiều phương pháp như
RAPD, RFLP, AFLP…. Trong đó, để nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các
dòng nấm gây bệnh trên thực vật, người ta thường sử dụng phương pháp RFLP để
phân tích. Đối với phương pháp RFLP thông thường phải trải qua một bước quan
trọng là Southern blot, vì nguyên tắc của phương pháp này là sử dụng các enzyme
cắt giới hạn để phân cắt bộ gene của từng cá thể. Tuy nhiên, nếu sử dụng phương
pháp RFLP nguyên bản phải trải qua bước Southern blot rất phứt tạp, do đó để
nghiên cứu tính đa dạng di truyền thường sử dụng phương pháp RFLP – PCR. Về
cơ bản phương pháp RFLP – PCR không khác nhiều so với phương pháp RFLP

thông thường. Nhưng thay vì phải trải qua bước Southern blot thì người ta tiến
hành khuếch đại một đoạn DNA trong bộ gene của sinh vật với một cặp primer đặc
hiệu bằng kỹ thuật PCR. Sau đó tiến hành phân cắt sản phẩm PCR thu được bằng
các enzyme cắt giới hạn và so sánh giữa các cá thể thông qua số lượng các đoạn


DNA xuất hiện trên bản gel điện di. Và khi đó, nếu hai cá thể giống nhau về mặt di
truyền thì sau khi cắt sẽ cho ra các đoạn DNA có kích thước giống nhau.
Sau khi tiến hành PCR, chúng tôi đã thu được sản phẩm PCR tương đối đặc
hiệu và tiến hành phân cắt bằng các enzyme cắt giới hạn. Trong điều kiện cho
phép chúng tôi đã sử dụng 7 loại enzyme để phân cắt sản phẩm PCR đó là Hae
III, EcoR I, Sau3A I, Alu I, Cfo I, Nde II, Rsa I. Sau khi tiến hành cắt bằng các
enzyme cắt giới hạn, chúng tôi tiến hành điện di trên gel 1,5% để kiểm tra kết
quả.
Đối với enzyme Hae III, sản phẩm PCR của tất cả các dòng được cắt ra làm 2
band với kích thước 2 band là 390bp và 150bp, đồng thời không cho ra band đa
hình (Hình 4.10).

Hình 4.10: Sản phẩm PCR cắt bằng Hae III
Hình 4.11: Sản phẩm PCR cắt bằng EcoR I
300bp
100bp
540bp
540bp
400bp
100bp


Theo Hình 4.11. khi cắt sản phẩm PCR bằng enzyme EcoR I sẽ cho ra hai band
có kích thước lần lượt là 240 bp và 300 bp.

Hình 4.12: Sản phẩm PCR cắt bằng Sau3A I
Tương tự với hai enzyme Hae III và EcoR I, enzyme Sau3A I cũng phân cắt sản
phẩm PCR thu được thành hai đoạn có kích thước khoảng 340 bp và 200 bp (Hình
4.12).
Hình 4.13: Sản phẩm PCR cắt bằng Alu I



540bp
400bp
400bp
100bp
540bp
100bp


400bp
100bp
540bp
Hình 4.14: Sản phẩm PCR cắt bằng Cfo I

Hình 4.15: Sản phẩm PCR cắt bằng Rsa I
Hình 4.16: Sản phẩm PCR cắt bằng Nde II
Ghi chú:
1: 3 (LH9/0023) 6: 14 (LH99/0131) 11: 52 (LH99/0050)
2: 7A (LH99/0081) 7: 23 (LH99/0374) 12: 53 (LH99/0053)
3: 7B (LH99/0081) 8: 28 (LH99/0412) 13: 54 (LH99/0112)
4: 11 (LH99/0093) 9: 35 (LH99/0617) 14: 55 (LH99/0216)
5: 12 (LH99/0098) 10: 42 (LH99/0679) 15: 59 (LH99/0636)

16: 60 (LH99/0675) 19: 64 (LH99/0672)
400bp
100bp
540bp
400bp
400bp


17: 62 (LH99/0757) 20: 65 (RRIV4)
18: 63 (LH99/0778) DC: Đối chứng âm (sản phẩm PCR chưa cắt)

Có kết quả phân cắt tương tự khi tiến hành cắt bằng Alu I, Cfo I, Nde II và Rsa
I. Các enzyme này đều cắt sản phẩm PCR thành hai đoạn có kích thước được mô tả
trong Bảng 4.4.
Sản phẩm bị mờ do nhiều nguyên nhân như kích thước band quá nhỏ (nhỏ hơn
200 bp), do điện di trên bồn lớn đòi hỏi gel phải dày nên nhuộm ethidium bromide
chưa đủ thời gian.

Bảng 4.4: Kích thƣớc các đoạn DNA sau khi phân cắt bằng các enzyme RE

Tên RE
Kích thƣơc tƣơng
đối đoạn DNA thứ
nhất
Kích thƣớc tƣơng
đối đoạn DNA thứ
hai

Ghi chú
Hae III

140
400
Đơn hình
EcoR I
240
300
Đơn hình
Sau3A I
340
200
Đơn hình
Alu I
380
160
Đơn hình
Cfo I
250
290
Đơn hình
Nde II
200
340
Đơn hình
Rsa I
200
340
Đơn hình

Như vậy, tất cả các enzyme sử dụng đều có vị trí cắt trên sản phẩm PCR thu
được. Tuy đã phân tích trên một số lượng mẫu tương đối lớn (20 mẫu) và sử dụng

7 loại enzyme để phân cắt nhưng chúng tôi vẫn không tìm thấy bất cứ sự sai khác
nào về mặt di truyền của các dòng nấm đã phân tích. Các dòng nấm này tuy được
phân lập trên nhiều dòng vô tính cây cao su khác nhau nhưng tất cả các dòng vô
tính này đều thuộc quần thể Vườn tuyển non của Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su
Việt Nam (Lai Khê, Bình Dương). Rất có thể có dòng nấm được phân lập đều
540bp


thuộc cùng một chủng. Tuy nhiên vùng ITS của nấm là vùng khá bảo tồn, do đó rất
khó để khẳng định chính xác các dòng nấm này đều thuộc cùng một chủng. Kết
quả nghiên cứu còn đưa đến kết luận về sự biến thiên khuẩn lạc trong quá trình
tách đơn bào tử. Hai dòng 7A và 7B là hai dòng được tách từ 2 đơn bào tử khác
nhau của cùng một dòng nấm ban đầu, khi phân cắt bằng các enzyme cắt không
tìm thấy sự khác niệt nào. Điều đó càng khẳng định nấm C. cassiicola là loài nấm
có mức độ biến đổi sinh hóa cao. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp
với các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước trước đây. Mặt khác rất có thể có
sự khác biệt trong trình tự các nucleotide nhưng không ở vị trí cắt của các enzyme
đã sử dụng, do đó sử dụng các enzyme cắt không tìm thấy bất cứ sự đa hình nào.
Vì vậy, cần phải có những nghiên cứu sâu hơn như giải trình tự vùng ITS thì mới
có thể kết luận chính xác có sự khác biệt về mặt di truyền giữa các dòng hay không
.

PHẦN 5
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận
Nấm C. cassiicola là một loài nấm mới, mức độ gây hại rất cao và có yếu tố
phát sinh bệnh phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố cả môi trường, ký chủ cũng như
vùng địa lý. Triệu chứng bệnh biến thiên rất lớn, do đó việc quản lý và kiểm soát
bệnh do nấm này gây ra gặp rất nhiều khó khăn. Để việc kiểm soát được dễ dàng
hơn chúng tôi đã nghiên cứu tính đa dạng di truyền của chúng và đã đi đến một số
kết luận sau:
- Nấm C. cassiicola là loài nấm có khả năng biến đổi sinh hóa cao. Màu sắc
khuẩn lạc, sinh khối thay đổi tùy theo điều kiện ngoại cảnh.
- Có thể áp dụng các quy trình ly trích DNA tổng số nấm đang phổ biến trên
thế giới để tiến hành ly trích DNA tổng số của nấm C. cassiicola.
- Tuy có sự khác biệt về màu sắc và hình dạng khuẩn lạc nhưng chúng tôi
không tìm thấy sự khác biệt về mặt di truyền khi phân tích bằng kỹ thuật RFLP
– PCR.
- Qua nghiên cứu chúng tôi đã xây dựng được quy trình PCR tương đối chính
xác có thể áp dụng để phân tích PCR trên vùng ITS của nấm này.
- Dựa vào sự khác nhau về ký chủ của nấm này chúng tôi đã tiến hành phân
tích đa dạng di truyền của nấm bằng kỹ thuật RFLP – PCR và không tìm thấy sự
khác biệt nào về mặt di truyền. Có thể kết luận tạm thời là các dòng nấm được

phân tích đều thuộc một chủng duy nhất.

5.2. Đề nghị
Nấm C. cassiicola là một loài nấm có phổ ký chủ rộng, triệu chứng bệnh biến
thiên phứt tạp. Sau khi thu được một số kết quả nghiên cứu chúng tôi đưa ra một số
đề nghị sau:


- Cần có những nghiên cứu rộng hơn về hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa
để có thể đánh giá chính xác hơn về tình trạng nhiễm bệnh của cây cao su tại Việt
Nam.
- Nghiên cứu sâu hơn bằng các sử dụng các phương pháp khác như RAPD,
AFLP… để đánh giá chính xác mức độ khác biệt di truyền của các dòng nấm C.
cassiicoal tại Việt Nam.
- Tiếp tục nghiên cứu trên vùng ITS với các primer khác để có thể chẩn đoán
nhanh bệnh do nấm này gây ra bằng kỹ thuật PCR.
- Xây dựng quy trình và tiến hành giải trình tự vùng ITS để đánh giá chính
xác sự khác biệt trong bộ gene của nấm.
- Tiến hành nghiên cứu thêm về độ tố của nấm để có thể đề ra các biện pháp
ngăn ngừa và điều trị bệnh rụng lá Corynespora.
- Tiến hành nghiên cứu bệnh trên các ký chủ khác trong vườn cao su để từ đó
đánh giá được chính xác khả năng truyền bệnh qua các ký chủ trung gian.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng việt
1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử. Nhà xuất bản nông
nghiệp.
2. Bùi Trang Việt, 2002. Sinh học phân tử. Giáo trình học tập, trường Đại học Nông
Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
3. Đặng Văn Vinh. 2000. Một trăm năm cao su ở Việt Nam. Nhà xuất bản Nông
Nghiệp TP. HCM. 11-38.
4. Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục.
5. Huỳnh Ngọc Phương, 2005. “Xác định gene gây độc và tính đa dạng di truyền của
nấm Metarhizium anisopliae ký sinh trên côn trùng”. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư
Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
6. Nguyễn Thị Huệ, 1997. Cây cao su kiến thức tổng quát và kỹ thuật nông nghiệp.
Nhà xuất bản trẻ.
7. Nguyễn Thị Lang, 2002. Phương pháp nghiên cứu cơ bản trong công nghệ sinh
học. Nhà xuất bản nông nghiệp.
8. Phan Thành Dũng, 2004. Kỹ thuật bảo vệ thực vật cây cao su. Nhà xuất bản Nông
Nghiệp.124 trang.
9. Phan Thành Dũng, 2006. Báo cáo công tác bảo vệ thực vật ngành cao su Việt
Nam, thực trạng và thách thức mới. Báo cáo tại hội thảo “Bảo vệ thực vật cây cao
su Việt Nam - hợp tác nghiên cứu và đào tạo giữa Đại học Nông Lâm và Ngành
cao su Việt Nam”.

10. Tổng công ty cao su, 2004. Quy trình kỹ thuật cây cao su. Nhà xuất bản nông
nghiệp.
11. Trần Thị Thủy Tiên, 2005. “Xác định trình tự vùng ITS - rDNA của nấm Beauveria
bassiana Vuille. ký sinh trên côn trùng gây hại”. Khóa luận tốt nghiệp Kỹ sư Công
nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
12. Trần Văn Lợt. Giáo trình cây công nghiệp. Học phần Cây Cao Su. Tài liệu học tập,
Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh 2005. 70 trang.


13. Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005. “Phân tích đa dạng di truyền một số mẫu nấm
Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei gây bệnh trên cây cao su (Hevea
brasiliensis Muell. Arg.) bằng phương pháp RFLP – PCR”. Khóa luận tốt nghiệp
Kỹ sư Công nghệ sinh học, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Việt Nam.

Tài liệu tiếng nƣớc ngoài
14. A. Safiah and A.H. Noor Hisham. Preliminary results: differentiating races of
Corynespora cassiicola using molecular marker techniques.
15. Edel,V., Steinberg,C., Goutheron, N. and Alabouvette, C. (1996). Differentiation of
Fusarium species by restriction fragment length polymorphism analysis of PCR
amplified rinosomal DNA. Frist International Fusarium Biocontrol Workshop.
Beltsville Agricultural Research center, USA, p.21.
16. Jayashinge, C.K. and W.P.K., Silva, 1996. Current status of Corynespora leaf fall
in Sri Lanka. Presented at workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea
brassiliensis, indonesia 16-17, dec, 1996.
17. Liyanage, A. de., Jayashinge, C. cassiicolak and Liyanage, N.I.S (1988). Biology,
epidemiology and pathogenicity of corynespora leaf fall disease workshop held at
Bogor Research Instute, Indonesia 12
th
to 13
th

February, 1988.
18. Moukhamedov, R., Hu, X., Nazar, R.N. and Robb, J. (1993). Use of polymerase
chain reaction amplified ribosomal intergenic sequences for the diagnosis of
Vertiocillium tricorpus. Phytopathology 84, 256-259.
19. Nazar, R.N., Hu, X, Schmidt. J., Culham, D. and Robb, J. (1991). Potential use of
PCR amplified ribosomal intergenic sequences in the detection and differentiation
of Verticillium wilt pathogen. Physiological and Molecular Plant Pathology 39, 1-
11.
20. P.D. Bridge, D.K. Arora, C.A. Reddy and R.P. Elander, 2000. Application of PCR
in mycology. University Press, Cambbridge.
21. P.Romruensukharom, S. Tragoonrung, A. Vanavichit and T. Toojinda. Genetic
variability of Corynespora cassiicola population in ThaiLand.


22. R.T.V. Fox. Principles of diagnostic techniques in plant pathology. International
Mycological Institute (an Institute of CAB International).
23. Sabu, P.I., 2000. Current status of Corynespora leaf fall in India. Presented at
workshop on Corynespora leaf fall disease of Hevea brassiliensis, Kuala Lumpur,
Malaysia and Medan, Indonesia, 6 – 15, June, 2000.
24. Saflah Atan and Noor Hisham Hamid. Dfferentiating Races of Corynespora
cassiicola using RAPD and internal transcribed spacer markers.
25. Sambrook and Russell, 2001. Molecular cloning. A laboratory manual.
26. Silva, Deverall and Lyon. Molecular physiological and pathological characterization of
Corynespora leaf spot fungi from rubber plantations in Sri Lanka.
27. Silva, W.P.K, Deverall, B.J và Lyon, B.R., 1995. RFLP and RAPD analyses in the
identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus C.
cassiicola. Aust. J. Bot., 43, 609 – 618.
28. Silva, W.P.K, Eric H. Karunanayake, Ravi L.C. Wijesundera and Uhanowita M.S.
Priyanka., 2003. Genetic variation in Corynespora cassiicola: a possible relation
between host and virulence. Mycol Res. 2003 May;107(Pt 5):567-71

29. W.P.K. Silva, D.S. Multani, B. J. Deverall and B.R. Lyon. RFLP and RAPD
analyses in the identification and differentiation of isolates of the leaf spot fungus
Corynespora cassiicola.

Tài liệu internet
30. />art=0&sa=N
31. />10%20PCR%20Steps%20Overall.GIF
32. />bnid=BKvmI1A3S8P6fM:&tbnh=107&tbnw=74&hl=vi&start=5&prev=/images%
3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2522origin%2522%26svnum%3D10%26h
l%3Dvi%26lr%3D .


33.
34.
35.
36.
37. />tbnid=U9tYIYl2DUuMxM:&tbnh=88&tbnw=104&hl=vi&start=1&prev=/images
%3Fq%3D%2B%2522ITS%2522%252B%2522fungi%2522%26imgc%3Dmono%
26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D
38. />y/rubbgeo.htm&h=473&w=643&sz=35&tbnid=aCjY42ze2DcHIM:&tbnh=99&tbn
w=135&hl=vi&start=33&prev=/images%3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2
522origin%2522%26start%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D%26s
a%3DN
39. />y/rubbgeo.htm&h=473&w=643&sz=35&tbnid=aCjY42ze2DcHIM:&tbnh=99&tbn
w=135&hl=vi&start=33&prev=/images%3Fq%3D%2522Rubber%2522%252B%2
522origin%2522%26start%3D20%26svnum%3D10%26hl%3Dvi%26lr%3D%26s
a%3DN
40.
41.
42.

43. />e0006.htm
44. />=corynespora+cassiicola
45.
46.
47.
48.


PHỤ LỤC

Phụ lục 1: Các dòng nấm Corynespora cassiicola phân lập từ các mẫu bệnh tại
Vƣờn tuyển non Lai Khê - Bến Cát, Bình Dƣơng.
STT
đƣợc mã hóa
Kí Hiệu
DVT
1
RRIV2
LH82/122
2
7/24
LH99/0019
3
26/20
LH9/0023
4
39/19
LH99/0028
5
19/86

LH9/0042
6
29/93
LH99/0053
7
4/48
LH99/0081
8
11/85
LH99/0083
9
20/85
LH9/0084
10
11/89
LH99/0090
11
28/37
LH99/0093
12
19/38
LH99/0098
13
4/19
LH99/0122
14
4/84
LH99/0131
15
29/10

LH99/0217
16
28/80
LH99/0266
17
25/75
LH99/0296
18
28/77
LH99/0309
19
32/86
LH99/0337
20
26/7
LH99/0347
21
26/11
LH99/0360
22
4/24
LH99/0365


23
1/24
LH99/0374
24
6/92
LH99/0383

25
41/69
LH99/0396
26
15/51
LH99/0396
27
22/84
LH99/0411
28
2/55
LH99/0412
29
2/41
LH99/0431
30
30/88
LH99/0431
31
29/79
LH99/0460
32
7/2
LH99/0489
33
14/1
LH99/0513
34
19/8
LH99/0581

35
21/55
LH99/0617
36
19/5
LH99/0622
37
15/61
LH99/0627
38
24/72
LH99/0638
39
15/13
LH99/0648
40
27/62
LH99/0670
41
5/8
LH99/0670
42
7/70
LH99/0679
43
17/8
LH99/0696
44
4/9
LH99/0698

45
20/6
LH99/0699
46
10/3
LH99/0775
47
15/32
LH99/0780
48
15/36
LH99/0818
49
16/29
LH99/0863


50
16/29
LH99/0863
51
35/17
TD95/5
52
19/82S
LH99/0050
53
29/93S
LH99/0053
54

28/81S
LH99/0112
55
22/25S
LH99/0216
56
29/22S
LH99/0219
57
26/88S
LH99/0347
58
20/70S
LH99/0599
59
7/8S
LH99/0636
60
22/70S
LH99/0675
61
7/69S
LH99/0679
62
10/11S
LH99/0757
63
10/34S
LH99/0778
64

16/28S
LH99/0672
65
RRIV4
LH99/0657

Phụ lục 2: Cách pha một số hóa chất
A. Pha lysis buffer
Lysis buffer có các thành phần cụ thể như sau: Tris HCl 50 mM, EDTA 50 mM, SDS
3%, - mercaptoethanol 1%.
- Cho vào becher một thể tích nước siêu sạch gần bằng với thể tích dung dich
buffer mong muốn.
- Lần lượt cho các thành phần khác: Tris HCl, EDTA và SDS vào dung dịch
với một lượng sao cho đảm bảo nồng độ cuối cùng như mong muốn.
- Khuấ
y đều cho hỗn hợp hòa tan, sau đó cho - mercaptoethanol vào.


- Khuấ
y đều và chuẩn độ cho dung dịch lysis buffer đạt pH = 8. Nếu sau
khi chuẩn độ thể tích cuối cùng chưa đạt như mong muốn cần thêm
nước siêu sạch vào cho đạt thể tích mong muốn.

B. Pha Phenol
- Hòa tan 100g phenol (tinh thể) đặt trong bồn ủ nhiệt ở 65
0
C (phải bịt kín dụng
cụ đựng phenol khi hòa tan).
- Sau khi phenol đã tan hoàn toàn, thêm vào 100 ml dung dịch Tris bazơ 0,5 M,
pH = 8.

- Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi hỗn hợp tách thành
hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên một cách cẩn thận. Lưu ý các thao tác này
nên thực hiện ở trong tủ hood và phải luôn giữ phenol trong tối để tránh oxy hóa và
nguy hiểm đến sức khỏe.
- Tiếp tục cho vào 100ml dung dịch Tris HCl 0.5 M, pH 8.
- Khuấy từ 10 phút, để yên ở nhiệt độ phòng cho đến khi dung dịch tách làm
hai pha, hút bỏ phần dung dịch bên trên.
- Lập lại chu kỳ này một lần nữa. Sau đó phủ lên trên dung dịch phenol thu
được một lớp TE 1X (50ml).
- Lưu ý là phải bảo quản dung dịch phenol trong tối (dùng bình đựng có màu
tối hoặc bịt kín bình bằng giấy bạc).

C. Pha dung dịch TE 1X
Thành phần gồm: 10mM Tris HCl, 1mM EDTA, pH8
Trước hết pha dung dịch Tris HCl stock, pH8.
Cho dung dịch Tris HCl và EDTA vào nước tinh sạch.
Khuấy đều và chuẩn độ pH đến 8.