Luận văn : PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ NẤM Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.) Wei GÂY BỆNH TRÊN CÂY CAO SU (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) TẠI LAI KHÊ (BẾN CÁT – BÌNH DƯƠNG) BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP – PCR part 2 pps

phân hủy một phần như máu khô hóa thạch, tóc, móng tay người chết… Tuy
nhiên, khi mẫu không sạch có lẫn protein sẽ làm cho hiệu quả phản ứng PCR
giảm theo (Khuất Hữu Thanh, 2003).
Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm từ 1 g xuống còn 100 ng, khi
giảm nồng độ DNA ban đầu sẽ hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo
những sản phẩm phụ không mong muốn (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Việc
sử dụng nồng độ DNA quá cao sẽ tạo ra những kết quả dương tính giả.
2.3.2.2. Primer và nhiệt độ lai
Primer là yếu tố quyết định đến hiệu quả khuếch đại của phản ứng PCR.
Một phản ứng PCR chuẩn gồm 2 loại primer: primer xuôi và primer ngược.
Trong đó, primer xuôi bắt cặp bổ sung trên sợi sen, còn primer ngược bắt cặp
trên sợi antisen của phân tử DNA mẫu. Việc thiết kế primer đòi hỏi phải đáp
ứng được những nhu cầu sau:
- Trình tự primer được chọn sao cho không có sự bắt cặp bổ sung giữa
primer xuôi và primer ngược, không có cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ
sung giữa các thành phần khác nhau của một primer (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
- Thành phần các nucleotide phải cân bằng. Nếu tỉ lệ G, C cao thì số lượng
nucleotide của mỗi primer sẽ giảm từ 15- 30 nu xuống còn 18 – 20 nu (Bùi Chí
Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Tỉ lệ các nu sẽ ảnh hưởng đến nhiệt độ bắt
cặp của primer, nhiệt độ này được tính theo công thức:
Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C).
Đồng thời nhiệt độ bắt cặp của hai primer không cách biệt quá xa.
- Trình tự được khuếch đại là trình tự DNA nằm giữa hai primer xuôi và
ngược, trình tự này không được quá lớn. Phải nhỏ hơn 1 Kb đối với phản ứng
PCR chuẩn (Khuất Hữu Thanh, 2003) (trích Vũ Thị Quỳnh Chi, 2005).
- Các primer phải đặc trưng cho trình tự được khuếch đại, không bắt cặp bổ
sung với nhiều trình tự trên hệ gene.
Trong phản ứng PCR thì nồng độ primer khoảng 1 – 25 pM cho phản ứng
25 – 50 l (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).

2.3.2.3. Enzyme
Enzyme được sử dụng lần đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I
(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998). Tuy nhiên, hiệu quả mang lại không cao do
enzyme này bị bất hoạt ở nhiệt độ cao. Việc phát minh và sử dụng enzyme Taq
DNA polymerase trong phản ứng PCR là một bước ngoặc cực kỳ quan trọng
trong các thí nghiệm về sinh học phân tử (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,
1999).
Enzyme Taq polymerase được chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus.
Đây là vi khuẩn sống ở suối nước nóng, vì vậy chịu được nhiệt độ cao. Enzyme
Taq polymerase thu được từ vi khuẩn này cũng chịu đựng được nhiệt độ cao,
đặc điểm này rất phù hợp với điều kiện của phản ứng PCR.
2.3.2.4. Mg
2+

Là thành phần trong dung dịch đệm, là chất xúc tác của enzyme DNA
polymerase. Do đó, Mg
2+
ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR. Nồng độ
cao hay thấp của Mg
2+
ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của enzyme Taq
polymerase, ảnh hưởng đến quá trình tách mạch đơn của phân tử DNA. Nếu
nồng độ enzyme thấp sẽ ức chế hoạt động của enzyme, còn nếu nồng độ cao tuy
giúp mạch kép của DNA ổn định hơn nhưng lại ức chế sự biến tính hoàn toàn
chuỗi DNA. Nồng độ Mg
2+
ở mức quá cao sẽ dẫn đến sự bắt cặp sai giữa
primer và khuôn. Nồng độ tối ưu của Mg

2+
cho từng phản ứng phải được xác
định qua nhiều phản ứng thử nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.3.2.5. dNTPs
Nồng độ và thành phần các nucleotide cũng ảnh hưởng đến kết quả PCR.
Nồng độ dNTPs thường sử dụng là 20 – 200 M. Nồng độ dNTPs cao sẽ dẫn
đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide
sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998).
2.3.2.6. Số lƣợng chu kỳ
Tuy về mặt lý thuyết thì số lượng chu kỳ là không giới hạn, nhưng trên thực
tế thì số lượng chu kỳ thường không vượt quá 40 chu kỳ. Khi số lượng chu kỳ
quá lớn thì hiệu quả của phản ứng PCR sẽ bị giảm theo số lượng chu kỳ.

Nguyên nhân của việc giảm hiệu quả phản ứng PCR là rất nhiều, ví dụ như việc
cạn kiệt các thành phần phản ứng, xuất hiện sản phẩm phụ… Do nhiều lý do
như vậy, nên việc xác định số lượng chu kỳ phụ thuộc rất nhiều vào số lượng
mẫu ban đầu.
2.3.2.7. Nhiệt độ và pH
Do liên kết hydro trong phân tử DNA rất nhạy cảm với nhiệt độ nên việc
xác định nhiệt độ cho phản ứng PCR là vô cùng quan trọng. Với mục đích biến
tính DNA thì thường sử dụng nhiệt độ từ 94 – 96
o
C. Còn trong giai đoạn bắt
cặp thì nhiệt độ thường được sử dụng là 50 – 56
o
C, tuy nhiên nhiệt độ này còn
tùy thuộc vào đặc tính của primer (tỉ lệ G, C). Nếu tỉ lệ G, C cao thì nhiệt độ bắt
cặp cũng sẽ cao theo. Ở nhiệt độ 72
o

C thì enzyme Taq polymerase hoạt động tốt
nhất và hiệu quả kéo dài cao nhất.
Trong phân tử DNA, pH ảnh hưởng đến liên kết phosphodiester. Khi môi
trường có pH = 8 thì DNA sẽ ổn định nhờ sự bền vững của liên kết này. Còn
nếu pH là acid thì liên kết này sẽ bị phá vỡ. Tuy nhiên, pH của phản ứng PCR
có thể thay đổi từ 6,8 – 7,8.
2.3.2.8. Thiết bị và dụng cụ phản ứng PCR
Yêu cầu đối với thiết bị phản ứng PCR là rất phức tạp. Các thiết bị phải chịu
được nhiệt độ, chịu được sự biến thiên liên tục của nhiệt độ và phải tránh được
tối đa sự thoát hơi nước của phản ứng PCR.
Mọi dụng cụ dùng trong phản ứng PCR phải hoàn toàn sạch để tránh tạp
nhiễm. Dụng cụ phải chịu được nhiệt độ, chịu được sự biến thiên nhiệt độ cũng
như phải truyền nhiệt tốt…
2.3.3. Các bƣớc thực hiện một phản ứng PCR
Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ đều
gồm 3 giai đoạn: biến tính, giai đoạn lai, giai đoạn kéo dài.
- Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denature).
Trong giai đoạn này thì phản ứng PCR sẽ được đưa lên nhiệt độ 94 – 96
o
C
trong thời gian 30 – 60 giây. Ở nhiệt độ này thì phân tử DNA sẽ tách thành hai
chuỗi đơn.
- Giai đoạn 2: Giai đoạn lai (annealing).

Nhiệt độ của phản ứng được hạ xuống trong khoảng 40 – 70
o
C, và nó tùy
thuộc vào Tm của primer. Ở nhiệt độ này, các primer sẽ bắt cặp với khuôn
DNA. Thời gian cho sự bắt cặp này từ 30 – 60 giây.
- Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (extension).

Thông thường nhiệt độ cho giai đoạn này là 72
o
C, đây là nhiệt độ hoạt động
tối ưu của enzyme Taq polymerase. Enzyme này sẽ giúp kéo dài mạch mới của
phân tử DNA từ primer. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào chiều dài
của phân tử DNA. Nhưng thường thì thay đổi từ 30 giây đến một vài phút.
Trong phản ứng PCR, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn, và các chu kỳ sẽ được
lặp đi lặp lại nhiều lần. Mỗi lần lặp lại như vậy thì lượng DNA sẽ tăng gấp đôi.
Như vậy lượng DNA sẽ được khuếch đại theo hàm số mũ:
M = m . 2
n

Trong đó: M: lượng DNA sau khi khuếch đại.
m: lượng DNA mẫu ban đầu.
n: số chu kỳ của phản ứng PCR.
2.3.4. Ƣu và nhƣợc điểm của phản ứng PCR
Ưu điểm của phản ứng PCR:
- Thời gian thực hiện nhanh, đơn giản, ít tốn kém.
- Không đòi hỏi mẫu phải tinh sạch cao.
Nhược điểm của phản ứng PCR:
- Đòi hỏi phải biết trình tự nucleotide của đoạn DNA cần khuếch đại, hay
chí ít cũng phải biết trình tự hai đầu của phân tử DNA.
- Chỉ khuếch đại những phân tử DNA có kích thước nhỏ hơn 3 Kb, tốt
nhất là 1 Kb.
- Rất dễ bị nhiễm, dẫn đến tạo sản phẩm phụ (dương tính giả).
2.3.5. Ứng dụng của kỹ thuật PCR
Do có khả năng khuếch đại một lượng DNA cực nhanh và chuyên biệt nên
kỹ thuật PCR được áp dụng rộng rãi trên rất nhiều lĩnh vực.
- Sản xuất các mẫu dò
Trước khi kỹ thuật PCR ra đời, việc sản xuất các mẫu dò đòi hỏi phải qua

nhiều giai đoạn phức tạp như: tạo dòng, nuôi cấy, sử dụng nick translation hay

random priming…. Khi kỹ thuật PCR ra đời việc tạo mẫu dò đơn giản hơn
nhiều, đồng thời có thể sản xuất một số lượng lớn mẫu dò.
- Ứng dụng trong khuếch đại DNA, RNA.
- Ứng dụng để phân tích đa dạng di truyền.
- Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh
Kỹ thuật PCR rất nhạy, do đó với một hay nhiều cặp primer ta có thể xác
định được sinh vật gây bệnh thông qua các đặc trưng về hệ gene của chúng
(Nguyễn Văn Uyển, 1995).
2.4. Giới thiệu về kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism Polymerase Chain Reaction)
2.4.1. Sơ lƣợc về enzyme cắt giới hạn
2.4.1.1. Giới thiệu chung
Enzyme cắt giới hạn là các endonuclease có khả năng thủy giải DNA sợi đôi
một cách đặc hiệu và lặp lại ở những trình tự xác định (Hồ Huỳnh Thùy Dương,
1998). Nó đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong phân tích hệ gene, và được xem
là một công cụ không thể thiếu để thực hiện kỹ thuật DNA tái tổ hợp.
Trong thế giới các loài vi khuẩn, khi vi khuẩn bị thực khuẩn thể xâm nhiễm
thì một số dòng vi khuẩn có khả năng tự bảo vệ mình bằng hệ thống R – M. Hệ
thống này có bản chất là enzyme cắt giới hạn. Nó sẽ cắt sợi DNA tại những vị
trí rất chuyên biệt trên phân tử DNA ngoại sinh nhưng nó không bao giờ cắt
trên bộ gene của nó. Do đó các enzyme có đặc tính này có tên là enzyme cắt
giới hạn (restriction endonuclease). Hệ thống R – M bảo vệ sợi DNA bằng cách
làm biến đổi (modification) trong thành phần hóa học của phân tử DNA. Phân
tử được gắn thêm nhóm methyl vào A hoặc C ở vị trí các enzyme cắt giới hạn.
Khi vị trí A hoặc C bị methyl hóa, các enzyme cắt giới hạn sẽ không còn nhận
biết được vị trí cắt này. Do vậy vi khuẩn sẽ tránh bị các enzyme RE cắt chính
hệ gene của chúng.
2.4.1.2. Tên gọi các enzyme cắt giới hạn

Tên gọi thống nhất cho các enzyme cắt được quy định như sau:
- Chữ đầu viết hoa là chữ đầu tên giống vi khuẩn dùng để ly trích enzyme RE.
- Hai chữ kế không viết hoa tương ứng với loài của vi khuẩn nói trên.

- Tiếp theo là một chữ số la mã chỉ thứ tự RE được phát hiện (trong trường
hợp nhiều RE cùng được tìm thấy ở một loài vi khuẩn).
Đôi khi còn sử dụng một chữ viết hoa để chỉ chủng của vi khuẩn sử dụng
(Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
Ví dụ:
Escherichia coli Ry13 và được viết tắt là EcoR.
Giống Loài Chủng.
Bảng 2.1: Một vài RE và vị trí phân cắt của nó
Nguồn vi khuẩn
Ký hiệu enzyme
Trình tự
5’ – 3’
3’ – 5’
Haemophilus aegyptius

Staphylococcus aureus 3A

Bacillus amyloliquefaciens H

Escherichia coli RY13

Haemophilus influenzae Rd

Providencia stuartii

Seratia marcesens

Xanthomonas malvacearum
HaeIII

Sau3AI

BamHI

EcoRI

HindIII

PstI

SmaI

XmaI

GG/CC
CC/GG
GATC
CTAG
G/GATCC
CCTAG/G
G/AATTC
CTTAA/G
A/AGCTT
TTCGA/A
CTGCA/G
G/ACGTC

CCC/GGG
GGG/CCC
C/CCGGG
GGGCC/C


(Nguồn: Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.4.1.3. Các loại RE
Do đặc tính nhận biết và cắt DNA tại những vị trí khác nhau, người ta chia
các enzyme cắt giới hạn thành 3 loại:

- Loại 1: Khi enzyme nhận biết trình tự cắt, nó sẽ di chuyển trên phân tử
DNA đến cách đó khoảng 1.000 – 5.000 nu và giải phóng độ vài chục nu.
- Loại 2: Enzyme nhận biết trình tự và cắt luôn tại trình tự đó.
- Loại 3: Enzyme nhận biết một trình tự đặc trưng và cắt DNA ở vị trí cách
đó khoảng 20 nu.
Tuy có 3 loại enzyme cắt giới hạn nhưng chỉ có loại 2 là được sử dụng trong
nghiên cứu sinh học phân tử.
2.4.1.4. Ứng dụng của các enzyme RE
Ở sinh vật nhân thật, việc phân tích cả hệ gene là rất khó khăn. Do đó việc
sử dụng enzyme cắt giới hạn để cắt nhỏ bộ gene khổng lồ là cần thiết để dễ
dàng hơn trong nghiên cứu.
Các nhà khoa học còn sử dụng RE trong nghiên cứu tạo dòng vi khuẩn, lập
bản đồ giới hạn hay so sánh bộ gene ở các loài khác nhau bằng kỹ thuật RFLP.
2.4.2. Sơ lƣợc về phƣơng pháp RFLP (Restriction Fragment Length
Polymorphism)
2.4.2.1. Giới thiệu chung
RFLP là phương pháp sử dụng một enzyme cắt giới hạn (RE) để cắt một
mẫu DNA, sau đó sẽ so sánh số band DNA tạo thành thông qua kỹ thuật điện di
để xác định đột biến điểm hay sự khác nhau của các trình tự DNA.

Khi trình tự DNA của hai cá thể hoàn toàn khác nhau về kích thước và số
lượng thì khi thực hiện cắt bằng cùng một enzyme thì sẽ cho số vạch và kích
thước của các vạch khác nhau. Do đó, dựa vào kích thước và số lượng band
khác nhau, ta có thể xác định có sự khác nhau trong trình tự đoạn DNA nghiên
cứu.
2.4.2.2. Quy trình thực hiện một phản ứng RFLP
Một phản ứng RFLP chuẩn bao gồm các bước sau:
- Bước 1: Tách chiết DNA và tinh sạch DNA.
- Bước 2: Cắt mẫu DNA bằng cùng một enzyme cắt giới hạn RE.
- Bước 3: Điện di và thực hiện phản ứng lai Southern blot.
Tuy nhiên, khi thực hiện phản ứng RFLP cần phải thực hiện một phản ứng
trung gian là Southern blot (Hình 2.2). Do đó kỹ thuật này rất tốn kém và phức tạp.


Hình 2.2: Mô tả phản ứng RFLP
(Nguồn: )
2.4.3. Sơ lƣợc về kỹ thuật RFLP – PCR
Do sự phức tạp, tốn kém và khó khăn khi phải thực hiện Southern blot nên
khi nghiên cứu bộ gene người ta thường thực hiện phản ứng RFLP dựa trên
PCR. Phương pháp này được thực hiện trên cơ sở khuếch đại có chọn lọc một
đoạn DNA bằng PCR. Sau đó tiến hành phân cắt sản phẩm PCR bằng enzyme
thích hợp. Dựa vào kết quả cắt sản phẩm PCR bằng enzyme cắt để đánh giá sự
đa hình của DNA. Ưu điểm lớn nhất của phương pháp này không phải thiết kế
probe. Đồng thời phương pháp này tạo ra ít band hơn phương pháp RFLP
nguyên thủy, tạo điều kiện dễ dàng hơn trong phân tích kết quả.
Quy trình thực hiện:
- Tách chiết DNA.
- Thực hiện PCR khuếch đại trình tự đích bằng một cặp primer thích hợp.
- Xử lý sản phẩm PCR bằng enzyme cắt giới hạn.

- Điện di và nhuộm ethidium bromide để kiểm tra kết quả.
Ngoài các ưu điểm trên, so với phương pháp RFLP thông thường thì phương
pháp RFLP – PCR còn có nhiều ưu điểm như: cần lượng DNA mẫu ít, đọc kết
quả điện di trực tiếp bằng mắt không dùng đồng vị phóng xạ mà chỉ sử dụng
ánh sáng huỳnh quang để đọc kết quả.

2.5. Giới thiệu về vùng ITS
Vùng ITS là vùng nằm xen kẽ với các trình tự rDNA (Hình 2.3). Các trình
tự rDNA mã hóa cho các rRNA, các rRNA sẽ kết hợp với protein để tạo ra
ribosome có chức năng tổng hợp protein. Trong các vùng này thì vùng rDNA là
vùng bảo tồn nhất, kế đến là vùng ITS còn vùng biến động nhất là vùng IGS.

Hình 2.3: Sơ đồ vùng ITS của nấm
(Nguồn:
Đặc điểm của vùng ITS (Bridge và cộng sự, 2000):
- Đây là vùng có kích thước ngắn (khoảng 500 – 800 bp), dễ dàng khuếch
đại bằng phản ứng PCR.
- Vùng ITS có tính bất ổn hơn vùng gene mã hóa rDNA.
- PCR có thể khuếch đại vùng này bằng các primer đặc trưng. Các nhà
nghiên cứu đã lựa chọn vùng ITS để tìm những vùng gene đặc trưng cho loài,
từ đó giúp xác định loài nhanh chóng.
Do tính chất như vậy mà vùng ITS đã được sử dụng nghiên cứu với mục
đích là tìm ra và xác định sự đa dạng di truyền của nhiều loài nấm (Carbone và
Kohn, 1993; Hallenberg và cộng sự, 1996; Hirata và Takamatsu, 1996). Năm

1996, Edel và cộng sự tiến hành phân tích RFLP trên vùng ITS và đã tìm ra một
vài sự khác biệt trên nấm Fusarium oxysporum.
Hiện nay, các nhà khoa học đã sử dụng nhiều kỹ thuật như PCR, RFLP,
DNA sequencing để nghiên cứu vùng ITS (Kuninaga và cộng sự, 1997). Đối
với các loài nấm, vùng ITS có tính bảo tồn khá cao đối với các dòng nấm có

quan hệ di truyền gần gũi nhau. Ngoài việc sử dụng vùng ITS để phân tích cây
phát sinh loài, nó còn được sử dụng với mục đích phát hiện và định danh vi sinh
vật (Vandepeer và cộng sự, 1996). Tuy nhiên, thông thường người ta sử dụng
vùng ITS để xác định sự biệt hóa trong cùng loài (Guarro, 1999). Nazar và cộng
sự (1991) đã sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS để phát hiện và định danh nấm
Verticillium albo-atrum và V. dabliae. Trong một nghiên cứu tương tự trên
dòng Verticillium tricorpus, Moukhamedov và cộng sự (1993) đã định danh
được chúng thuộc loài Verticillium. Trước đây, người ta phân loại chủ yếu dựa
trên những đặc điểm về hình thái, cơ chế trao đổi chất, cấu trúc vách tế bào và
thành phần protein nên kết quả thường có độ tin cậy không cao. Với việc phát
triển các kỹ thuật nghiên cứu sinh học phân tử trên vùng ITS, người ta có thể
phân loại các dòng nấm một cách rất chính xác. Năm 1996, Boysen và cộng sự
đã sử dụng PCR trên vùng ITS1, ITS2 của nấm Rhizoctonia solani để phân tích
đặc tính bệnh và xác định được 3 nhóm phụ.
Với các ưu điểm như vậy, vùng ITS càng ngày càng được nghiên cứu rộng
rãi và phổ biến hơn. Nó là vùng đạt được kết quả nhiều nhất trong nghiên cứu
sinh học phân tử của nấm.

2.6. Một số nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.)
Wei trong nƣớc và ngoài nƣớc
Đã có rất nhiều những nghiên cứu về nấm Corynespora cassiicola. Tuy
nhiên, do là loại nấm mới bùng phát nên đa số các nghiên cứu đều là nghiên
cứu về hình thái, khả năng gây bệnh, khả năng sinh độc tố cassiicoline và sự
phân bố của chúng trên nhiều lãnh thổ khác nhau. Những nghiên cứu này đã
làm thay đổi cách đánh giá về khả năng gây bệnh của loài nấm này. Kết quả của
những nghiên cứu cho thấy nấm Corynespora cassiicola có phổ ký chủ rất

rộng, đồng thời khả năng sinh độc tố cũng thay đổi rất lớn tùy thuộc vào các
dòng vô tính cao su được ghi nhận (Jayashinge và cộng sự, 1998).
Hiện nay, ở Việt Nam những nghiên cứu về nấm C. cassiicola là chưa

nhiều. Ngoài những nghiên cứu về hình thái, khả năng gây bệnh còn có các
nghiên cứu về khả năng kháng bệnh này của một số dòng vô tính cao su. Vũ
Thị Quỳnh Chi (2005) đã sử dụng các enzyme EcoR I, Msp I, Cfo I, Hae III,
Sau 3A, Rsa I để phân tích đa dạng di truyền trên 7 dòng nấm C. cassiicola
(RRIV 2, RRIV4, AC 88, RO/CM/10, MT/C/5, LH 82/008, LH 83/152), kết
quả không tìm thấy sự đa hình nào khi cắt bằng các enzyme giới hạn trên.
Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về loại nấm này. Đa số các nghiên
cứu đều tập trung vào đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa, khả năng gây
bệnh… của chúng. Kết quả các nghiên cứu này đã chứng minh đây là một loài
nấm nguy hiểm, có khả năng bùng phát trên diện rộng. Ngoài khả năng sinh độc
tố, nấm này còn có khả năng tổng hợp enzyme phân hủy peptin và cellulose
(C.K. Jayashinge, 2000).
Năm 1995, Silva và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật RAPD – PCR để phân tích
sự khác biệt về mặt di truyền của 42 dòng nấm C. cassiicola khác nhau và đã
phân thành 5 chủng nấm khác nhau và đã xếp chúng vào 3 nhóm di truyền.
Ngoài kỹ thuật RAPD, kỹ thuật RFLP – PCR cũng đã được sử dụng để
nghiên cứu sự đa hình của các dòng nấm. Năm 2003, Safiah Atan và Noor
Hisham Hamid đã sử dụng kỹ thuật RAPD và RFLP – PCR để phân tích sự
khác biệt về mặt di truyền của 9 dòng nấm. Kết quả là đã xếp chúng vào 2
chủng khi nghiên cứu bằng RAPD. Kết quả phân tích với kỹ thuật RFLP – PCR
cho thấy không có sự sai khác đáng kể nào trong 9 dòng nấm được nghiên cứu.
Năm 1998, Silva và cộng sự đã dùng kỹ thuật RAPD và phân tích RFLP
trên vùng ITS của 32 dòng nấm. Ông không tìm thấy sự đa hình nào khi nghiên
cứu bằng kỹ thuật RFLP –PCR, còn với kỹ thuật RAPD đã phân 32 dòng nấm
này thành 7 nhóm di truyền.



PHẦN 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

3.1. Thời gian, địa điểm và đối tƣợng nghiên cứu
3.1.1. Thời gian nghiên cứu
Tiến hành từ tháng 02/2006 đến tháng 08/2006.
3.1.2. Địa điểm nghiên cứu
- Phân lập và tách đơn bào tử tại phòng thí nghiệm Bộ Môn Bảo Vệ Thực
Vật, Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam – Lai Khê, Bến Cát, Bình Dương.
- Nhân sinh khối nấm C. cassiicola tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh
Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích và Thí Nghiệm Hóa
Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM.
- Tiến hành ly trích DNA, chạy PCR, RFLP tại Phòng Thí Nghiệm Công
Nghệ Sinh Học Bảo Vệ Thực Vật và Vi Sinh – Trung Tâm Phân Tích và Thí
Nghiệm Hóa Sinh, Trường Đại Học Nông Lâm Tp. HCM.
3.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu
Các mẫu lá của các dòng vô tính cao su có triệu chứng bệnh rụng lá
Corynespora.

3.2. Nội dung nghiên cứu
1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola.
2. Sử dụng PCR khuếch đại vùng ITS.
3. Phân tích đa dạng di truyền của nấm C. cassiicola bằng kỹ thuật
RFLP – PCR

3.3. Vật liệu và phƣơng pháp
3.3.1. Phân lập, tách đơn bào tử và thu sinh khối nấm
3.3.1.1. Dụng cụ, hóa chất thí nghiệm
Bình tam giác, đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, đèn cồn, kẹp, lame, lamelle,
kính hiển vi quang học, giấy thấm, bông gòn, giá để ống nghiệm, nồi hấp, tủ ủ,
tủ sấy, máy lắc, bút lông…

Môi trường PGA, PSA: Đường glucose hay sucrose, khoai tây, agar.
Thuốc nhuộm Methylene Blue.
Nước cất.
Cách pha môi trƣờng PGA:
Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân đủ 200g, thái nhỏ, thêm 500 ml nước cất 2
lần đun sôi trong 30 phút.
Lọc lấy nước trong.
Thêm 15g agar và 500 ml nước cất vào dung dịch đã lọc.
Bổ sung thêm nước cất cho đủ 1000 ml và thêm 20g đường glucose.
Đun sôi trong 30 phút, khuấy đều trong lúc nấu.
Phân vào các đĩa petri và các ống nghiệm (10 ml/ ống) và đem hấp khử
trùng ở 121 C/ 15 phút.
3.3.1.2. Phƣơng pháp lấy mẫu
Lấy nguyên cả mẫu lá có triệu chứng bệnh, đặt trong hộp đựng mẫu có giấy
thấm nước để giữ ẩm. Mẫu được ghi đầy đủ dữ liệu như: nơi lấy mẫu, dòng vô
tính cao su lấy mẫu (tình trạng mẫu, lá non, lá già, triệu chứng đặc trưng (hình
xương cá) hay không đặc trưng (vết tròn)…)
3.3.1.3. Phƣơng pháp phân lập nấm
Mẫu nấm được phân lập từ các vết bệnh đặc trưng hoặc không đặc trưng của
bệnh rụng lá Corynespora theo các bước sau:
- Mẫu đưa về phòng thí nghiệm được rửa bằng nước cất vô trùng 3 lần.
- Dùng que cấy lấy trực tiếp bào tử và cấy vào môi trường PGA. Hoặc cắt
mẫu thành những miếng nhỏ, rửa sạch bằng nước cất vô trùng, cồn 70
o
rồi cấy
vào môi đĩa môi trường PGA.
- Ủ hai ngày. Cấy khuẩn lạc nghi ngờ sang môi trường mới.
- Tiếp tục cấy truyền đến khi thu được giống nấm thuần chủng.
Tiến hành quan trắc bào tử nấm C. cassiicola.
Tiến hành nuôi cấy tách đơn bào tử.

3.3.1.4. Phƣơng pháp tách đơn bào tử
Sau khi phân lập được dòng nấm C. cassiicola thuần chủng, ta tiến hành
tách đơn bào tử. Quy trình tách đơn bào tử được thực hiện như sau:

- Dùng kim mũi mác cạo nhẹ trên bề mặt khuẩn lạc của nấm.
- Cho bào tử từ kim mũi mác vào cốc chứa nước cất khử trùng.
- Hút 0,5 ml dung dịch bào tử nhỏ lên lame có trải một lớp mỏng agar.
- Ủ ở nhiệt độ phòng 12 giờ.
- Tiến hành quan sát trên kính hiển vi, tìm những bào tử nào nảy mầm riêng
rẽ và mọc tách riêng rẽ. Đánh dấu, sau đó tiến hành cắt vùng đánh dấu, cấy vào
đĩa petri chứa môi trường PSA.
- Đem ủ ở nhiệt độ phòng 2 – 3 ngày, để bào tử mọc thành khuẩn lạc.
3.3.1.5. Phƣơng pháp nhân sinh khối
- Chuẩn bị môi trường PGA lỏng, cách pha giống với môi trường PGA
(Mục 3.3.1.1) nhưng không bỏ agar.
- Sau khi thu được khuẩn lạc tiến hành nhân sinh khối trong môi trường
PGA lỏng. Nhân sinh khối nấm bằng cách lắc trên máy lắc (160 vòng/phút, ở
26 – 30
o
C).
- Sa
u 4 ngày, tiến hành thu sinh khối sợi nấm bằng cách lọc trên giấy lọc tiệt trùng.
Sau đó làm khô sinh khối, giữ ở -20
o
C.
3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA của nấm
3.3.2.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
- Nitơ lỏng.
- Phenol.
- Chloroform.

- Isoamyl alcohol.
- Isopropanol.
- Ethanol 100%, 70%
- TE 1X: 10 mM Tris HCl + 1 mM EDTA, pH = 8,0.
- Lysis buffer: 50 mM Tris HCl + 50 mM EDTA + 3% SDS + 1% -
mecaptoethanol.
- Dụng cụ thí nghiệm gồm: Cối và chày để nghiền mẫu, eppendorf,
micropipette và các loại đầu tip, bồn ủ nhiệt Memmert, máy vortex…
3.3.2.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA
DNA nấm được tách chiết theo phương pháp của Lee & Taylor (1990).
Quy trình cụ thể
- Lấy 1g sợi nấm khô kiệt nghiền trong dung dịch nitơ lỏng.
- Chuyển bột nghiền vào eppendorf.
- Thêm 300 l lysis buffer, trộn đều. Nếu hỗn hợp quá đặc thì cho thêm lysis
buffer.
- Ủ ở 65
o
C trong 1giờ.
- Di chuyển ống nghiệm ra khỏi bồn ổn nhiệt.
- Thêm 300 l phenol: chlorophorm: isoamyl alcohol (tỉ lệ 25:24:1) lắc nhẹ.
- Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ 28
o
C.
- Chuyển dịch nổi (khoảng 300 l) vào eppendorf mới.
- Kết tủa DNA bằng cách thêm vào ½ thể tích isopropanol, trộn nhẹ.
- Ly tâm 14.000 vòng trong 1 phút ở 28
o
C.
- Loại bỏ dịch lỏng. Dùng ethanol 70
o

rửa sạch nhiều lần.
- Làm khô DNA, hòa tan trong dung dịch TE 1X và tồn trữ ở 4
o
C hay -20
o
C.
3.3.2.3. Định tính DNA bằng kỹ thuật điện di
Sau khi thu DNA của sợi nấm, tiến hành chạy điện di kiểm tra DNA tổng số với
mục đích định tính DNA nấm. Chạy kiểm tra DNA tổng số trên gel agarose 0,8%.
3.3.2.4. Tinh sạch sản phẩm ly trích
Sản phẩm DNA tổng số được ly trích có nhiều tạp do nhiều nguyên nhân như
protein khử không hết, RNA tạp nhiễm, DNA bị gẫy… sẽ được tinh sạch trước khi
đem chạy PCR. Quy trình tinh sạch sản phẩm DNA tổng số được thực hiện theo
quy trình sau:
- Bước 1: Pha loãng mẫu ly trích với nước cất vô trùng theo tỷ lệ 3 mẫu : 1 nước.


- Bước 2: Cho vào eppendorf chứa mẫu 2 l enzyme RNase. Đem ủ ở 37
o
C
trong 30 phút.
- Bước 3: Sau khi ủ, hút 2 l hỗn hợp phenol : chloroform : isoamyl alcohol
(25:24:1) vào eppendorf mẫu, lắc nhẹ.
- Bước 4: Đem ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vòng, trong thời gian 5 phút. Tiến
hành hút dịch nổi cho vào eppendorf khác.
- Bước 5: Cho vào eppendorf chứa dịch nổi 400 l ethanol 100% và ủ ở -70
o
C,
trong 20 phút.
- Bước 6: Ly tâm hỗn hợp ở 13.500 vòng, trong thời gian 1 phút.

- Bước 7: Loại bỏ dịch nổi. Tiến hành làm khô mẫu và cho TE 1X vào.
3.3.3. Khuếch đại vùng ITS của nấm Corynespora cassiicola (Berk. & Curt.)
Wei bằng kỹ thuật PCR
3.3.3.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
2 primer: ITS A GGGAATTCTCCGTAGGTGAACCTGCGG
ITS B GCAAGCTTTCCTCCGCTTATTGATATGC
Dụng cụ thí nghiệm:
Eppendorf các loại.
Micropippette và đầu típ các loại.
Lò vi sóng.
Cân kỹ thuật 4 số.
Máy luân nhiệt (thực hiện phản ứng PCR).
3.3.3.2. Thực hiện phản ứng PCR
Bảng 3.1: Thành phần một phản ứng PCR
Thành phần Liều lượng phản ứng ( l) Nồng độ đầu Nồng độ cuối
dNTP 0,5 10 mM 0,2 mM
10X PCR buffer 2,5 10 X 1 X
MgCl
2
1 25 mM 1 mM
ITS A 1 25 pM/ l 25pM
ITS B 1 25 pM/ l 25pM
Taq polymerase 0,1 5U 0,5U


Khuôn mẫu 1
Nước cất vừa đủ phản ứng 25 l

Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR: thực hiện trong 41 chu kỳ.
- Chu kỳ 1:

Biến tính: 94 C 3phút.
Bắt cặp: 51 C 1 phút.
Kéo dài: 72 C 1 phút.
- 39 chu kỳ tiếp theo:
Biến tính: 94 C 1 phút.
Bắt cặp: 51 C 1 phút.
Kéo dài: 72 C 1 phút.
- 1 chu kỳ cuối:
Biến tính: 94 C 1phút.
Bắt cặp: 51 C 1 phút.
Kéo dài: 72 C 9 phút.
3.3.3.3. Điện di sản phẩm PCR và đánh giá kết quả điện di
Sản phẩm PCR sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1%.
Hóa chất cho kỹ thuật điện di
DNA ladder loại 1000bp (Biorad).
Ethidium bromide 1%.
Dịch đệm TAE 0,5X (20 mM Tris HCl, 10 mM glacial acetate, EDTE 1 mM).
- Loading buffer 6X, gel agarose.
Dụng cụ và thiết bị điện di
Micropippette và các đầu típ.
Máy điện di (electrophoresis) (Mini-Subgel, Biorad).
UV transilluminator (Biorad).
Máy chụp ảnh (DNA photography equipment) (Biorad).


Cách thực hiện đổ gel và chạy điện di.
- Cho 0,15g agarose vào 15 ml dung dịch TAE 0,5X.
- Đun sôi khoảng 1 – 2 phút.
- Để nguội đến 40 – 50
o

C.
- Đổ gel vào bể điện di và đặt lược tạo giếng diện di.
- Chờ gel đông lại. Cho vào bể điện di và đổ dung dịch TAE vào.
- Lấy 4 l sản phẩm PCR trộn với 2 l loading dye cho vào
giếng và tiến hành chạy điện di.
- Phân tích sản phẩm PCR bằng máy chụp gel.
3.3.4. Phân tích RFLP vùng ITS của các dòng nấm Corynespora cassiicola
(Berk. & Curt.) Wei
3.3.4.1. Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
Các enzyme cắt giới hạn Hae III, Alu I, Nde II, Sau 3A I, EcoR I, Cfo I, Rsa I.
- Sản phẩm PCR vùng ITS của nấm C. cassiicola.
- Bồn ủ nhiệt, gel agarose, máy điện di (Biorad), máy chụp gel (Biorad).
- Đầu tip 10 l, 100 l, eppendorf 0,2 ml.
3.3.4.2. Thực hiện phân tích RFLP
Bảng 3.2: Thành phần một phản ứng enzyme cắt
Thành phần
Liều lượng phản ứng ( l)
Nồng độ đầu
Nồng độ cuối
Enzyme
Buffer enzyme
Sản phẩm PCR
Nước
0,1
2,5
3
vừa đủ phản ứng 25 l
10 U/ l
10 X
1U

1X
Các bước để thực hiện một phản ứng enzyme cắt:
- Hút 3 l dung dịch sản phẩm PCR cho vào một eppendorf.
- Sau đó cho 0,1 l dung dịch enzyme cắt vào.
- Ủ ở 37
o
C trong thời gian khoảng 3 – 14 giờ tùy thuộc vào yêu cầu của từng loại enzyme.


- Làm bất hoạt enzyme ở nhiệt độ 65
o
C trong thời gian 15 phút.
Sau đó, sản phẩm cắt sẽ được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose 1% -
1,5%, phân tích sự đa dạng di truyền giữa các dòng nấm.
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập và tách đơn bào tử nấm Corynespora cassiicola trên một số
dòng vô tính cao su
4.1.1. Diễn biến và mức độ gây hại của tác nhân gây bệnh rụng lá
Corynespora
Tác nhân gây bệnh rụng lá Corynespora là nấm Corynespora cassiicola. Đây là
loại nấm có phổ ký chủ rộng, có khả năng thích nghi rất lớn với mọi thời tiết. Do
vậy, bệnh này xuất hiện quanh năm trong mọi thời tiết và ở mọi khí hậu từ cận xích
đạo, xích đạo và cả ôn đới. Đặc biệt trong mùa mưa, nước mưa sẽ làm bào tử của
chúng phát tán ra môi trường. Do có khả năng thích nghi như vậy, nấm
Corynespora cassiicola có khả năng biến đổi sinh hóa rất lớn. Chúng gây bệnh trên
rất nhiều dòng vô tính cây cao su. Nấm này gây hại trên cây cao su ở tất cả các giai
đoạn từ cây trong vườn ươm, vườn kiến thiết hay vườn cây khai thác.
Ở Việt Nam, bệnh này mới được phát hiện trên cây cao su vào năm 1999. Và

bước đầu đã được ngăn chặn bằng cách chặt bỏ các dòng vô tính bị nhiễm. Đồng
thời khuyến cáo không trồng các dòng vô tính cao su có tính mẫn cảm cao. Theo
đánh giá của các nhà nghiên cứu thì ở Việt Nam bệnh này đang trong giai đoạn ủ
bệnh và tích lũy bệnh, do đó trong tương lai có thể bùng phát thành dịch bệnh nếu
không có những biện pháp quản lý và kiểm soát bệnh (Phan Thành Dũng – Báo
cáo công tác bảo vệ thực vật ngành cao su Việt Nam, hiện trạng và thách thức mới,
2006).
Bệnh rụng lá Corynespora là một bệnh mới xuất hiện, quy mô gây hại tiềm ẩn
rất lớn. Chúng ta phải thường xuyên kiểm tra ở tất cả các vườn cao su từ vườn ươm


đến vườn cây khai thác. Hiện nay, theo số liệu thống kê do Bộ môn Bảo Vệ Thực
Vật – Viện Nghiên Cứu Cây Cao Su Việt Nam thì hầu hết các vườn tuyển non và
vườn sơ tuyển tại Lai Khê đều bị nấm này tấn công trên quy mô lớn (Bảng 4.1).

Bảng 4.1: Tình hình nhiễm bệnh tại một số vƣờn trên địa bàn Lai Khê – BD


Tên vƣờn

Ngày
quan trắc
Số dòng
vô tính
quan trắc
Số dòng
có triệu
trứng
bệnh
Phần trăm

dòng vô
tính bị
bệnh (%)
Vƣờn tuyển non năm 2001

Vƣờn tuyển non năm 2002

Vƣờn sơ tuyển năm 2003

Vƣờn sơ tuyển năm 2004
29/05/2006

29/05/2006

17/04/2006

18/04/2006
1131

1808

72

74
1005

1720

44

47
88,9

95,1

61,1

63,5
Theo Bảng 4.1, tỷ lệ dòng vô tính cao su bị nhiễm bệnh là rất lớn. Tại các vườn
tuyển non, tỷ lệ nhiễm bệnh cao có thể lý giải là do số lượng dòng vô tính rất lớn
và khỏang cách giữa các cây là rất gần nhau. Do đó bệnh dễ dàng lây lan giữa các
dòng với nhau. Còn các vườn sơ tuyển, đây là vườn lưu trữ các giống có tiềm năng
đã qua chọn lọc nên tỷ lệ nhiễm bệnh có thấp hơn vườn tuyển non. Tuy nhiên, tỷ lệ
nhiễm bệnh này là rất cao, cần có các biện pháp hợp lý để hạn chế sự phát triển của
bệnh này.
Theo thống kê chưa đầy đủ, tại các công ty cao su trực thuộc Tổng công ty cao
su Việt Nam bệnh rụng lá Corynespora cũng đã xuất hiện và gây thiệt hại lớn trên
cây cao su con.
Trong quá trình tiến hành làm thí nghiệm, tôi đã tiến hành thu thập mẫu nấm từ
các mẫu lá có triệu chứng bệnh của nhiều dòng vô tính cao su khác nhau tại Vườn
tuyển non Lai Khê - Viện nghiên cứu cây cao su Việt Nam (Hình 4.1). Để đơn giản


và thuận tiện cho công việc tôi đã tiến hành mã hóa tên các dòng nấm thu được từ
các dòng vô tính khác nhau thành các số thứ tự (xem Phụ lục 1.).



Hình 4.1. Triệu trứng bệnh rụng lá Corynespora
A: Lá mới bị bệnh C: Triệu trứng trên thân cây non

B: Lá bị bệnh nặng D: Tán cây bị bệnh rụng lá Corynespora
A
B
C
D
(Nguồn: Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, VNCCSVN)


4.1.2. Kết quả phân lập
Sau khi thu được các mẫu bệnh từ các dòng vô tính khác nhau, tôi đã tiến hành
phân lập nấm trên môi trường PGA.






Hình 4.2: Khuẩn lạc nấm C. cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo (3
ngày sau khi cấy)
Triệu chứng nấm này gây ra trên cao su biến thiên rất lớn. Từ dạng hình xương
cá ở gân lá (triệu chứng đặc trưng), đến hình tròn ở trên phiến lá (triệu chứng
không đặc trưng). Từ các mẫu lá có triệu chứng bệnh chúng tôi đã tiến hành phân
lập bằng phương pháp cấy chuyền nhiều lần. Sau đó chọn những khuẩn lạc đặc
trưng như màu xám nâu, hình dạng khuẩn lạc là tập hợp của nhiều vòng tròn đồng
tâm… Sau khi tiến hành phân lập chúng tôi đã thu được tổng cộng 65 dòng nấm
trên 65 dòng vô tính cao su khác nhau.
Hình 4.3: Bào tử nấm C. cassiicola
A: Bào tử nấm C.cassiicola trên môi trƣờng tự nhiên.
B: Bào tử nấm C.cassiicola trên môi trƣờng nhân tạo.
(Nguồn: Phan Thành Dũng, Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, VNCCSVN)

A
B