Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ part 2 ppt

19


2.2.2.12. Triệu chứng, bệnh tích
Tôm bệnh có biểu hiện bỏ ăn, lờ đờ, kém hoạt động, thường có khuynh hướng
cặp mé bờ, sau đó chết và chìm xuống đáy (Takahashi và ctv, 1994; Wang và ctv,
1998). Bên trong vỏ giáp xuất hiện những đốm trắng đường kính từ 0,5 – 2 mm, xuất
hiện đầu tiên ở vỏ giáp và đốt bụng thứ V, VI. Những đốm này chính là sự tích tụ
calcite (Wang và ctv, 1996b), sự tạo thành chúng cần các tế bào biểu bì cutin bị nhiễm
virus nặng (Chang và ctv, 1998) và sự bao bọc các sợi trong tế bào chất và các kênh
trong biểu bì (Wang và ctv, 1999). Đốm trắng thường xuất hiện cùng với sự đổi màu
thành tái hay đỏ hồng (Nakano và ctv, 1994). Tuy nhiên, những biểu hiện như xuất
hiện đốm trắng và đổi màu cũng có thể xảy ra do điều kiện môi trường hay bệnh vi
khuẩn (Charatchakool và ctv, 1995). Gan tụy trương, có màu trắng hoặc hơi vàng.
Tôm bệnh có dấu hiệu trương nhân trong tế bào bị nhiễm do tích tụ hạt virus (Chou và
ctv, 1996; trích bởi Trần Thị Hoàng Dung).
Tỉ lệ tôm chết lên đến 80 – 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Nakano và ctv,
1994).

Hình 2.7. Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV. (Vlak., 2002)
(A) Tôm bị nhiễm WSSV.
(B) Tế bào bị nhiễm WSSV trong mang của tôm sông.
2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh :
Hiện nay chưa có biện pháp điều trị hữu hiệu bệnh đốm trắng trên tôm nên
phòng là chủ yếu. Biện pháp phòng trừ tổng hợp được dùng rộng rãi trên thế giới.
 Lựa chọn post-larvae khỏe mạnh không mang mầm bệnh (mô
học, PCR, sốc formalin).
20


 Chẩn đoán chính xác, kịp thời, lập chương trình kiểm soát dịch

bệnh đặc biệt là giai đoạn tôm mẫn cảm với WSSV.
 Quản lý tốt ao nuôi để phòng bệnh:
+ Sử dụng biện pháp thay nước có kiểm soát
+ Mỗi trại phải có hệ thống xử lý nước riêng, nước phải được khử
trùng trước khi vào ao nuôi.
+ Chất lượng nước được duy trì ở điều kiện ổn định.
+ Giảm các tác nhân gây stress trong ao nuôi: pH, DO, nhiệt độ,
độ mặn, amonia và sản phẩm thải, dư thừa trong ao.
+ Sử dụng một cách chọn lọc các chế phẩm vi sinh (probiotic) để
tăng cường sức đề kháng của tôm đối với WSSV.
+ Cung cấp đầy đủ chất dinh dưỡng, tăng sức đề kháng bằng
vitamin.
+ Phòng ngừa bệnh lây lan từ trại này sang trại khác.
+ Loại trừ tôm, cua, ruốc xâm nhập vào ao nuôi (lưới lọc, lưới
ngăn bờ ao).
+ Có ao trữ nước chiếm 20 - 30% ao nuôi, nước được trữ lắng 7
ngày trước khi dùng
+ Ngăn ngừa và kiểm soát sự lan truyền của bệnh trong cộng
đồng.
2.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác
Theo Hőstein (2000), mục tiêu chính trong việc phát hiện virus WSSV là nhằm
khẳng định có xảy ra bệnh hay không và kiểm tra xem tôm bố mẹ và con giống có
mang mầm bệnh hay không.
 Để chẩn đoán có hay không có bệnh trong ao phải tiến hành phân
tích mô học bằng cách nhuộm mô tôm bằng Hematoxylin và Eosin, sau
đó xem dưới kính hiển vi (Hőstein, 2000). Nếu tôm bệnh sẽ quan sát
được các thể vùi trong nhân bị trương to của các tế bào biểu mô cutin
và tế bào mô liên kết (Lightner, 1996).
21

 Để khẳng định chẩn đoán và xác định tình trạng nhiễm WSSV
của nguồn tôm bố mẹ và con giống nên dùng kĩ thuật PCR (Hőstein,
2000). Các kỹ thuật PCR đã được phát triển gồm 1-step, 2-step PCR
(Lo và ctv, 1996), one-tube nested PCR (Lo và ctv, 1998).
Ngoài ra cũng có thể chẩn đoán bằng:
 Transmission eletron microscopy (TEM). Mặc dù WSSV có thể
phát hiện được bằng phương pháp này nhưng kĩ thuật này chủ yếu dùng
trong chẩn đoán khẳng định (Lightner, 1996)
 In situ DNA hybridisation (cho phép xác định WSSV khi không
có những dấu hiệu mô bệnh học – Chang và ctv, 1996): Xử lý và cố
định mô theo phương pháp mô học truyền thống, lai và phát hiện virus
WSSV bằng probe có đánh dấu, quan sát dưới kính hiển vi.
 Western blot analysis (Nadala và ctv, 1997).
 Dot blot (Nadala and Loh, 2000).
Ngoài những phương pháp xác định WSSV dựa trên vật liệu di truyền, các xét
nghiệm dựa trên miễn dịch cũng được sử dụng, một trong số đó là phương pháp hóa
mô miễn dịch. Từ khi kháng thể đơn dòng nhận diện epitope trên vỏ virus hay trên
capsid được sản xuất thành công và xuất hiện test kit hóa mô miễn dịch thương phẩm
sử dụng kháng thể đơn dòng, kĩ thuật này càng phát huy được thế mạnh của nó về độ
chính xác, độ nhạy và hiệu quả trong chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm.
Trong khoá luận này, dựa vào những điều kiện sẵn có, chúng tôi tiến hành ứng dụng
hoá mô miễn dịch để chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú
2.4. Sơ lƣợc về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemmistry)
2.4.1. Lịch sử phát triển
Coons và cộng sự (1941) là những người đầu tiên đánh dấu kháng thể bằng chất
nhuộm huỳnh quang và dùng chúng để xác định vị trí kháng nguyên trên mặt cắt mô.
Kĩ thuật hoá mô miễn dịch ngày càng phát triển, một số enzyme đã được dùng để đánh
dấu kháng thể như peroxidase (Nakane và Pierce, 1966) và alkaline phosphatase
(Mason và Sammons, 1978). Keo vàng được phát hiện bởi Faulk và Taylor (1971) và

22


có thể sử dụng để phát hiện phản ứng hoá mô miễn dịch bằng cả kính hiển vi quang
học lẫn kính hiển vi điện tử. Những chất đánh dấu khác bao gồm những phân tử phóng
xạ và phản ứng miễn dịch được nhận biết bằng phóng xạ tự ghi (autoradiography).
Ngày nay hoá mô miễn dịch đã trở thành một kĩ thuật chủ yếu và được sử dụng
rộng rãi trong nhiều phòng thí nghiệm, đặc biệt là trong y học (chẩn đoán lâm sàng)
(IHC world, 2005).
2.4.2. Nguyên lý
Theo IHC world (2005) hoá mô miễn dịch là phương pháp định vị kháng
nguyên trên mặt cắt của mô bằng cách sử dụng kháng thể đã được đánh dấu như là
thuốc thử đặc hiệu. Phương pháp này dựa trên cơ sở tương tác đặc hiệu giữa kháng
nguyên – kháng thể có thể nhìn thấy qua các chất nhuộm hiện màu là enzyme khi
chúng tác dụng với cơ chất.
2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen)
Theo Stites và ctv (1987) kháng nguyên là những chất khi đưa vào cơ thể một
động vật có thể kích ứng một phản ứng miễn dịch mà ta có thể nhận biết được (miễn
dịch thể dịch, miễn dịch tế bào, hay thường là cả hai loại).
Bản chất hóa học của kháng nguyên thường là những đại phân tử protein.
Polysaccharide, các polypeptide tổng hợp và những polypeptide khác cũng là kháng
nguyên trong những điều kiện thích hợp (Stites và ctv, 1987).
Những phân tử lớn là những kháng nguyên mạnh nhưng chỉ có một số vùng
giới hạn trên những phân tử đó tham gia gắn kết thật sự với vị trí kết hợp trên kháng
thể. Những vùng này quyết định tính đặc hiệu của phản ứng kháng nguyên – kháng thể
và được gọi là vùng quyết định (antigen determinant) hay vùng phản ứng. Epitope là
dạng đơn giản nhất của vùng phản ứng trong phân tử kháng nguyên phức tạp. Lượng
vùng phản ứng trên kháng nguyên thay đổi tùy theo kích thước và tính phức tạp của
kháng nguyên (Stites và ctv, 1987).
23

2.4.4. Kháng thể (antibody)
Theo Boenisch và ctv (2002) kháng thể thuộc nhóm protein gọi là globulin
miễn dịch (immunoglobulin – Ig). Globulin miễn dịch gồm 5 nhóm chính, được xếp
theo thứ tự giảm dần trong huyết thanh: IgG, IgA, IgM, IgD và IgE. Trong đó, IgG và
IgM thường được dùng trong hóa mô miễn dịch.
Có hai loại kháng thể (Hình 2.8)

A B
Hình 2.8. Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng (Boenisch và ctv, 2002).
A: Kháng thể đa dòng gắn với các epitope khác nhau trên kháng nguyên
B: Kháng thể đơn dòng phản ứng với một epitope đặc hiệu trên kháng nguyên
 Kháng thể đa dòng (polyclonal antibodies): Được tạo ra bởi
những tế bào plasma khác nhau nên thường không đồng nhất về hóa
miễn dịch, chúng phản ứng với những epitopes khác nhau trên kháng
nguyên đã kích thích tạo ra chúng. Động vật đáp ứng miễn dịch và tạo
ra kháng huyết thanh bao gồm nhiều loại kháng thể đặc hiệu và không
đặc hiệu. Kháng thể đa dòng dễ sản xuất hơn kháng thể đơn dòng
nhưng có khuyết điểm là ngay cả sau khi tinh sạch, kháng thể đa dòng
vẫn có thể chứa những kháng thể phản ứng không đặc hiệu với kháng
nguyên
24


 Kháng thể đơn dòng (monoclonal antibody): Được tạo ra từ một
dòng tế bào plasma nên đồng nhất về hoá miễn dịch, chúng phản ứng
với một epitope nhất định trên kháng nguyên đã kích thích tạo ra
chúng. Ưu điểm của kháng thể đơn dòng là độ đồng nhất cao, rất tinh
khiết và đặc hiệu.

Nghiên cứu ứng dụng kháng thể đơn dòng để phát hiện virus WSSV trên tôm
đã được phát triển bởi Poulos và ctv (2001). Chaivisuchangkura và ctv (2004), phát
triển ứng dụng kháng thể đơn dòng kháng protein envelop VP28 để phát hiện virus
WSSV trên tôm nhiễm bệnh. Phương pháp tạo ra kháng thể này như sau:
 Một phần của gen VP28 (VP28F118) được clone vào vector
 Chuyển vector vào E. Coli, mục đích là tạo ra một protein
(rVP28F118) thiếu vùng liên màng tận cùng bằng đầu N.
 Protein VP28F118 được tinh sạch bằng SDS-FAGE và dùng để
gây miễn dịch trên chuột Swiss thu kháng huyết thanh.
 Chọn một dòng tế bào plasma từ kháng huyết thanh thu được cho
lai với tế bào u tuỷ bằng phương pháp cell fusion. Tế bào lai
(hybridoma) tạo thành được dòng hoá. Thu kháng thể đơn dòng kháng
protein VP28 từ dòng tế bào lai này.
Trong bài khóa luận chúng tôi dùng kháng thể đơn dòng kháng protein VP28
trong phương pháp hóa mô miễn dịch để phát hiện mầm bệnh virus WSSV trên tôm sú
Penaeus monodon.
Các yếu tố ảnh hưởng đến kháng thể
 Độ pha loãng kháng thể: tùy thuộc vào phương pháp, thời gian ủ
và nhiệt độ. Nếu không có những thông tin từ nhà cung cấp kháng thể
ta phải chuẩn độ để xác định nồng độ thích hợp nhất cho các chất tham
gia phản ứng hóa mô miễn dịch. Kháng thể được pha loãng ở nồng độ
thích hợp và không đổi sẽ nâng cao chất lượng nhuộm. Người ta thường
xác định nồng độ thích hợp bằng cách đầu tiên chọn một thời gian ủ cố
25


định, sau đó thử nghiệm với một lượng nhỏ kháng thể ứng với một
chuỗi các nồng độ pha loãng thử nghiệm. Kháng thể đơn dòng có
khoảng pI và cấu tạo phân tử giới hạn hơn kháng thể đa dòng nên
chúng nhạy cảm hơn với pH và ion trong dung dịch đệm. Vì vậy để ước

lượng kháng thể đơn dòng cần chuẩn độ ở pH 6,0 và 8,6 và không có
NaCl. Độ pha loãng cao nhất và pH duy trì phản ứng miễn dịch mạnh
nhất được gọi là độ pha loãng tối ưu (Boenisch và ctv, 2002).
 Thời gian ủ: thường trái ngược với độ chuẩn của kháng thể, độ
chuẩn càng cao thì thời gian ủ để có kết quả tối ưu càng ngắn. Tuy
nhiên trên thực tế thường thì người ta đưa ra một thời gian ủ thích hợp
trước khi xác định độ pha loãng tối ưu. Nồng độ kháng thể đặc hiệu
càng cao thì thời gian ủ càng ngắn (Boenisch và ctv, 2002).
 Nhiệt độ ủ: Trạng thái cân bằng trong phản ứng kháng nguyên –
kháng thể đạt được nhanh ở 37
0
C. Với nhiệt độ ủ khá cao ta có thể rút
ngắn thời gian ủ và tăng độ pha loãng kháng thể. Tuy nhiên không thể
biết được là nhiệt độ chỉ thúc đẩy phản ứng đặc hiệu kháng nguyên –
kháng thể hay kích ứng tất cả những phản ứng nền.
Để phát triển kĩ thuật hóa mô miễn dịch chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng
trên tôm sú trong điều kiện phòng thí nghiệm ở Việt Nam chúng tôi chọn thử nghiệm
một chỉ tiêu quan trọng quyết định kết quả nhuộm là độ pha loãng kháng thể và 1 yếu
tố phụ là nồng độ DAB.
2.4.5. Các phƣơng pháp nhuộm
Có nhiều phương pháp hoá mô miễn dịch có thể dùng để định vị kháng nguyên.
việc lựa chọn phương pháp thích hợp dựa trên các thông số như loại mẫu vật và độ
nhạy yêu cầu (IHC world, 2005).




26

Hình 2.9. Các phƣơng pháp nhuộm
A: Phương pháp trực tiếp (direct method).
B: Phương pháp gián tiếp hai bước (two-step indirect method).
C: Phương pháp gián tiếp ba bước (three-step indirect method).
D: Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan (APAAP)
E: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (ABC).
F: Kỹ thuật (strept)avidin-biotin (LAB hay LSAB).
A. Trực tiếp (direct method): Đây là kỹ thuật cổ điển nhất. Quá trình thực hiện
như sau: Một kháng thể sơ cấp được đánh dấu enzyme phản ứng với kháng nguyên
trên mô, sau đó sử dụng cơ chất tạo màu để phát hiện phản ứng. Vì phương pháp này
chỉ dùng một kháng thể nên tiết kiệm thời gian và rất ít phản ứng không đặc hiệu. Tuy
nhiên cũng vì phản ứng chỉ gồm một kháng thể đánh dấu nên tín hiệu thu được rất ít và
không đủ nhạy để đáp ứng nhu cầu ngày nay (Hình 2.8.A) ( Boenisch và ctv, 2002).
A
B
Enzyme
Khángnguyên

Kháng thể 1

Kháng thể 2


Kháng thể 3

Biotin
(Strept)avidin





Chú thích
C
D
E

F
27


B. Gián tiếp hai bước (two-step indirect method): Đầu tiên cho một kháng thể
sơ cấp kết hợp với kháng nguyên, sau đó bổ sung một kháng thể thứ cấp đánh dấu
enzyme kháng lại kháng thể sơ cấp (bây giờ là kháng nguyên), và cuối cùng bổ sung
cơ chất tạo màu. Phương pháp này linh hoạt hơn phương pháp trực tiếp vì nhiều loại
kháng thể sơ cấp khác nhau từ cùng một loài có thể được sử dụng với cùng kháng thể
thứ cấp cộng hợp. Quy trình này cũng nhạy hơn nhuộm trực tiếp vì nhiều kháng thể

thứ cấp sẽ phản ứng với nhiều epitope khác nhau trên kháng thể sơ cấp và khuyếch đại
tín hiệu lên nhiều lần vì nhiều enzyme được cố định trên mỗi vị trí đích (Hình 2.8.B)
(Boenisch và ctv, 2002).
Thông thường, kháng thể sơ cấp là kháng thể đơn dòng và kháng thể thứ cấp là
kháng thể đa dòng.
C. Gián tiếp ba bước (three-step indirect method): Trong phương pháp này
người ta bổ sung thêm 1 kháng thể đánh dấu enzyme nữa vào phương pháp B. Hai
kháng thể thứ cấp được bố trí theo thứ tự như hình 2.8.C. Ví dụ như nếu kháng thể thứ
cấp thứ 1 tạo ra từ dê, thì kháng thể thứ cấp thứ 2 phải đặc hiệu với globulin miễn dịch
của dê. Cả hai kháng thể thứ cấp này phải được đánh dấu với cùng enzyme. Việc bổ
sung thêm một lớp kháng thể thứ 3 là để khuyếch đại tín hiệu. Phương pháp này đặc
biệt hữu dụng khi nhuộm những kháng nguyên có ít epitope (Boenisch và ctv, 2002).
D. Kĩ thuật phức hợp miễn dịch enzyme tan: còn được gọi là phương pháp
không đánh dấu kháng nguyên. Quá trình nhuộm cần có kháng thể sơ cấp, phức hợp
miễn dịch hòa tan enzyme – kháng thể kháng enzyme và dung dịch cơ chất. Phức hợp
miễn dịch được tạo ra bằng cách cho enzyme phản ứng với kháng thể của nó, loại bỏ
kết tủa, thu dịch hòa tan. Kháng thể sơ cấp và kháng thể của enzyme phải tạo ra từ
cùng một loài. Kháng thể thứ cấp phải trực tiếp kháng lại globulin miễn dịch của loài
đó.
Trước tiên cho kháng thể sơ cấp và phức hợp enzyme – kháng thể kháng
enzyme phản ứng với kháng nguyên, sau đó bổ sung kháng thể thứ cấp. Kháng thể thứ
cấp phải được bổ sung với một lượng thừa để một vị trí Fab sẽ gắn với kháng thể sơ
cấp, vị trí còn lại gắn với kháng thể trong phức hợp miễn dịch của enzyme.
28


Kĩ thuật này được đặt tên theo phức hợp miễn dịch enzyme sử dụng.Ví dụ:
Phương pháp PAP (peroxidase anti peroxidase) sử dụng phức hợp peroxidase – kháng
peroxidase, APAAP (alkaline phosphatase anti alkaline phosphatase) sử dụng phức
hợp alkaline phosphatase – kháng alkaline phosphatase. Phức hợp PAP gồm 3 phân tử

peroxidase và 2 kháng thể, phức hợp APAAP gồm 2 phân tử alkaline phosphatase và 1
kháng thể (Hình 2.8.D) (Boenisch và ctv, 2002).
E. Kỹ thuật (strept)avidin-biotin: Hầu hết những phương pháp nhuộm ngày nay
đều dựa trên ái lực lớn giữa (strept)avidin (Streptomyces avidinii ) và avidin (trứng gà)
với biotin. Kỹ thuật này có độ nhạy và khả năng khuyếch đại rất cao. Thành phần cơ
bản gồm kháng thể sơ cấp kháng kháng nguyên, kháng thể thứ cấp có gắn biotin kháng
kháng thể sơ cấp, phức hợp enzyme-(strept)avidin-biotin (kỹ thuật avidin-biotin
complex – ABC) hay streptavidin có đánh dấu enzyme (kỹ thuật labelled streptavidin-
biotin – LSAB), và cuối cùng là dung dịch cơ chất. Enzyme đánh dấu thường được sử
dụng nhất là horseradish peroxidase và alkaline phosphatase. Phương pháp LSAB
nhạy hơn phương pháp ABC (Hình 2.8.E, F) (Boenisch và ctv, 2002).
Để đáp ứng mục tiêu là chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng trên tôm sú, trong
điều kiện của phòng thí nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp ABC với kháng thể
thứ cấp gắn biotin, phức hợp streptavidin-biotinylated horseradish peroxidase và cơ
chất là 3,3-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB).
2.4.6. Ứng dụng phƣơng pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật nuôi
thủy sản
Kể từ khi ra đời phương pháp IHC đã chứng tỏ tính ưu việt trong chẩn đoán
bệnh, các thí nghiệm khẳng định trong nhân y (chẩn đoán bệnh ung thư vú, ung thư
phổi) (Hayat, 2004), thú y và trong thủy sản hay ứng dụng trên lĩnh vực nghiên cứu cơ
bản về hệ miễn dịch (dùng IHC để phát hiện kháng thể kháng Enteromyxum
scophthalmi (Myxozoa) trong cá bơn Scophthalmus maximus L. (Sitja-Bobadilla và
ctv, 2005)
Đối với thủy sản, xác định nhanh mầm bệnh quyết định tính hiệu quả trong
kiểm soát bệnh. Phát hiện mầm bệnh không những quan trọng với cá nhiễm bệnh mà
còn với môi trường (giữa thời kì thu hoạch và tái xuống giống) và như là một hệ thống
29


cảnh báo sớm. Ứng dụng probe kháng thể và probe/primer DNA đã có những ảnh

hưởng quan trọng trong phát triển những phương pháp chẩn đoán nhanh mới (Hiney
và Smith, 1998).
Phương pháp IHC và một số phương pháp dựa trên kháng thể khác như miễn
dịch huỳnh quang trực tiếp (flourescence antibody tests – FAT), gián tiếp (indirect
flourescence antibody tests – IFAT), ELISA (enzyme link immunosorbent assays)
được ứng dụng trên nhiều dạng mầm bệnh khác nhau gồm vi khuẩn (Aeromonas
salmonicida, Aeromonas hydrophila, Photobacterium damsela subspecies piscicida,
Renibacterium salmoninarum, Mycobacterium spp., Vibrio anguillarum và
Flavobacterium psychrophilum; (Adams và Thompson, 1990; Adams, 1995;
Bakopoulos và ctv., 1997; Adams và ctv., 1996), kí sinh trùng (Morris và ctv., 1997),
virus (infectious salmon anaemia virus), và rickettsia trên cá Piscirickettsia salmonis
(Alday-sanz và ctv., 1994). Trong một số trường hợp các phương pháp dựa trên kháng
thể rất hiệu quả và đạt được độ nhạy, độ đặc hiệu cần thiết. Tuy nhiên trong những
trường hợp khác, như với mẫu nước và bệnh sau lâm sàng, cần có những phương pháp
dựa trên DNA (PCR, in situ hybridisation) với độ nhạy cao hơn.
Đối với tôm (tôm nước mặn và tôm nước ngọt), phương pháp IHC cũng chứng
tỏ tính hiệu quả khi được ứng dụng trong chẩn đoán các loại mầm bệnh, đặc biệt là khi
sử dụng kháng thể đơn dòng (monoclonal antibodies – mAbs).
 Với mầm bệnh virus, IHC dùng trong chẩn đoán mầm bệnh virus
đốm trắng WSSV với kháng thể đơn dòng và kháng thể đa dòng kháng
protein VP28 (Liu và ctv, 2002; Poulos và ctv, 2001; Yoganandhan và
ctv, 2004), phát hiện và phân biệt các dạng khác nhau của phức hợp
virus đầu vàng (Yellow head complex virus – YHV) bằng kháng thể
đơn dòng V – 3 – 2B, Y – 18, Y – 19 (Soowannayan và ctv, 2003),
virus hội chứng Taura (Taura syndrome virus – TSV) với kháng thể
đơn dòng TSV – 1A1 (Anil và ctv, 2002; OIE, 2003).
 Với mầm bệnh vi khuẩn nhiều kháng thể đơn dòng kháng các loại
vi khuẩn (15 kháng thể đơn dòng kháng một dòng vi khuẩn nguy hiểm
là Vibrio harveyi 639 – Phianphak và ctv, 2005) đã được xác định nhằm
phát triển kĩ thuật chẩn đoán dựa trên miễn dịch như IHC.

30


PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
A. Thời gian thực hiện đề tài: 3/2005 – 8/2005.
B. Địa điểm thực hiện:
Phòng Mô Học - Trung Tâm Quốc Gia Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và
Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng
Thuỷ Sản II (116 Nguyễn Đình Chiểu – Q.1 – Thành phố Hồ Chí Minh).
3.2. Vật liệu
3.2.1. Mẫu xét nghiệm:
- 10 mẫu tôm sú thương phẩm thu từ các ao nuôi tại tỉnh Cà Mau và tỉnh
Sóc Trăng (nội dung 1).
Bảng 3.1. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 1
Kí hiệu
Nơi thu
Loại mẫu
Ngày thu
45D
45P
101
53
103
97
50
98
453
99
Sóc Trăng

Sóc Trăng
Cà Mau
Sóc Trăng
Cà Mau
Cà Mau
Sóc Trăng
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
30 ngày tuổi
30 ngày tuổi
3 tháng tuổi
45 ngày tuổi
3 tháng tuổi
2 tháng tuổi
28 ngày tuổi
2 tháng tuổi
50 ngày tuổi
2 tháng tuổi
10/4/2005
10/4/2005
21/1/2005
10/4/2005
21/1/2005
21/1/2005
10/4/2005
21/1/2005
17/3/2004
21/1/2005

- 25 mẫu tôm sú post-larvae chọn ngẫu nhiên từ 200 mẫu thu từ các trại
giống ở khu vực miền Trung (Đà Nẳng, Phan Rang, Bình Định), miền Nam
(Vũng Tàu, Cà Mau). 30 mẫu tôm sú thương phẩm chọn ngẫu nhiên từ 200 mẫu
31


thu ở các ao nuôi tại Cà Mau, Sóc Trăng, Kiên Giang, Vũng Tàu, Trà Vinh
trong đó thử nghiệm PCR trên 20 mẫu, thử nghiệm IHC và Mô học trên cả 30
mẫu (nội dung 2).
Bảng 3.2. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 2
Tôm post-larvae
Tôm thương phẩm
Kí hiệu
Nơi thu
Ngày thu
Kí hiệu
Nơi thu
Ngày thu
7683
7787
7661
7781
7536
7786
7718
7769
7768
7764
7684
7691

7650
7722
7725
2682
2741
2708
3122
2752
2745
12964
2794
2746
7755
Phan Rang
Cà Ná
Bình Định
Đà Nẵng
Cà Mau
Cà Ná
Phan Rang
Phan Rang
Phan Rang
Phan Rang
Phan Rang
Phan Rang
Vũng Tàu
Phan Rang
Phan Rang
Phan Rang
Phan Rang

Phan Rang
Phan Rang
Phan Rang
Phan Rang
Cà Ná
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau

2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
2/7/2005
14/2/2005
15/2/2005
15/2/2005
25/2/2005
18/2/2005
18/2/2005

9/12/2004
19/2/2005
18/2/2005
3/7/2005
101
97
98
99
336
341
342
340
339
338
103
44
55
57
49
94
136
134
137
135
159
161
152
153
156
178

179
181
182
185
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Kiên Giang
Sóc Trăng
Sóc Trăng
Sóc Trăng
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Cà Mau
Trà Vinh
Trà Vinh
Kiên Giang
Kiên Giang
Kiên Giang
Vũng Tàu

Vũng Tàu
Vũng Tàu
Vũng Tàu
Vũng Tàu
21/1/2005
21/1/2005
21/1/2005
21/1/2005
15/4/2005
15/4/2005
15/4/2005
15/4/2005
15/4/2005
15/4/2005
21/1/2005
11/4/2005
10/4/2005
10/4/2005
10/4/2005
21/1/2005
17/2/2005
17/2/2005
17/2/2005
17/2/2005
18/2/2005
18/2/2005
18/2/2005
18/2/2005
18/2/2005
18/2/2005

18/2/2005
1/3/2005
1/3/2005
1/3/2005



32


3.2.2. Vật liệu nhuộm IHC:
- Kháng thể sơ cấp: Kháng thể đơn dòng 8B7 của chuột kháng protein
WSSV VP28 (WSSV - 8B7 mAb) (4 C) - công ty Diagxotics
- Kháng thể thứ cấp: Kháng thể của cừu có gắn biotin kháng kháng thể
chuột (kháng thể sơ cấp) (Anti-mouse Ig biotinylated species-specific whole
antibody) (4 C) - công ty Amersham Biosciences UK.
- Huyết thanh cừu (Normal sheep serum) (4 C) - Công ty CalBioChem.
- Streptavidine-biotinylated horseradish peroxidase complex (HRP) (4 C)
- Công ty Amersham Biosciences UK.
- 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (-20 C ).
- Sodium azide, H
2
O
2
30% (4 C).
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ
- Máy xử lý mẫu tự động
- Máy cắt microtome
- Bàn ấm cố định mẫu trên lam kính
- Bộ phận làm lạnh mẫu

- Nồi nước có điều chỉnh nhiệt độ
- Bình rót paraffin Electrothermal
- Kính hiển vi quang học
- Găng tay y tế, lam, lamel, cassette và nắp, đèn cồn, kéo, panh, khuôn
inox, micropipette, eppendoff, becher, ống đong, bình tam giác.
3.2.4. Hóa chất
- Cồn 50%; 70%; 95%; 99,6%.
- Chloroform, Paraffin, nước cất 2 lần, nước cất khử ion, xylene, NaCl.
- Thuốc nhuộm Hematoxylin, keo dán Baume Canada.
33


- Dung dịch Davidson với thành phần như sau:
Cồn 95% : 330 ml
Formalin : 220 ml
Acid acetic glacial : 115 ml
Nước cất : 335 ml
- Hoá chất làm lam dương:
Aceton : 250 ml
(3-aminopropyl) triethoxysaline : 5 ml
3.3. Phƣơng pháp
3.3.1. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu tạo khối đầy đủ ngẫu nhiên
(Randomized complete block design - RCBD). Số liệu được xử lý bằng phần mềm
Statgraphics 7.0. Dùng trắc nghiệm LSD (Least significant different) 95% để so sánh
các nghiệm thức.
A. Với nội dung 1: Phát triển phương pháp IHC phù hợp với điều kiện tại Việt Nam
dựa trên qui trình đề nghị của Nauwynck và cộng sự (Đại Học Gent - Bỉ) thông qua bố
trí thử nghiệm:
 Khả năng nhuộm màu của các nồng độ DAB khác nhau (1X; 1,5X
và 2X). Thí nghiệm trên 5 mẫu, mỗi mẫu sau khi cố định trong paraffin

được bố trí trên 3 lam, mỗi lam thử nghiệm với 1 nồng độ.
 Độ nhạy và tính đặc hiệu của mAb ở các nồng độ pha loãng khác
nhau (0,5X; 1X; 1,5X và 2X). Thí nghiệm trên 10 mẫu, mỗi mẫu sau khi
cố định trong paraffin được bố trí trên 4 lam, mỗi lam thử nghiệm với 1
nồng độ.
Kết quả được ghi nhận trên 3 đặc tính của mẫu sau khi nhuộm: Cường độ cảm
nhiễm, cường độ bắt màu và độ sắc nét.
Ghi chú: 1X: Nồng độ đề nghị của Đại học Gent.
34


Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 1
Yếu tố thử
nghiệm
Nồng độ DAB
Nồng độ mAb
1X
1,5X
2X
0,5X
1X
1,5X
2X
Kí hiệu mẫu
45D
45D
45D
45D
45D
45D

45D
45P
45P
45P
45P
45P
45P
45P
101
101
101
101
101
101
101
53
53
53
53
53
53
53
103
103
103
103
103
103
103

97
97
97
97
50
50
50
50
98
98
98
98
453
453
453
453
99
99
99
99

B. Với nội dung 2: So sánh phương pháp IHC về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác và
hiệu quả với phương pháp mô học truyền thống và PCR qua bố trí thử nghiệm khả
năng phát hiện mầm bệnh WSSV trên 25 mẫu tôm post-larvae và 30 mẫu tôm thương
phẩm. Mỗi mẫu được chia thành 2 phần, một phần cố định trong cồn dùng cho PCR,
phần còn lại cố định trong dung dịch Davidson cho Mô học và IHC (sau khi cố định
trong paraffin, mỗi mẫu được cắt và bố trí trên 2 lam, một cho IHC và 1 cho Mô học).
Kết quả được ghi nhận dựa trên tỉ lệ cảm nhiễm và cường độ cảm nhiễm của
mẫu sau khi xét nghiệm.

35


Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 2
Đối
tƣợng
Tôm post-larvae
Tôm thƣơng phẩm
Loại xét
nghiệm
PCR
Mô học
IHC
PCR
Mô học
IHC
Kí hiệu mẫu
7638
7638
7638

101
101
7787
7787
7787

97
97
7661
7661
7661
98
98
7781
7781
7781
99
99
7536
7536
7536
336
336
7786
7786
7786
341
341
7718
7718
7718
342
342
7769
7769
7769

340
340
7768
7768
7768
339
339
7764
7764
7764
338
338
7684
7684
7684
103
103
103
7691
7691
7691
44
44
44
7650
7650
7650
55
55
55

7722
7722
7722
57
57
57
7725
7725
7725
49
49
49
2682
2682
2682
94
94
94
2741
2741
2741
136
136
136
2708
2708
2708
134
134
134

3122
3122
3122
137
137
137
2752
2752
2752
135
135
135
2745
2745
2745
159
159
159
12964
12964
12964
161
161
161
2794
2794
2794
152
152
152

2746
2746
2746
153
153
153
7755
7755
7755
156
156
156

178
178
178
179
179
179
181
181
181
182
182
182
185
185
185
36

3.3.2. Quy trình thực hiện: Quy trình thực hiện gồm 3 giai đoạn chính

Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chẩn đoán bằng IHC
Giai đoạn 1: Xử lý mẫu (tương tự như phương pháp mô học truyền thống)
Bước 1: Cố định mẫu trong dung dịch Davidson
Với tôm post-larvae: Vớt tôm mẫu (còn sống) để vào mảnh vải mùng
nhỏ, bỏ vào cassette và đóng nắp lại, cho trực tiếp vào dung dịch Davidson.
Ngâm mẫu 24 giờ.
Với tôm thương phẩm: Lấy tôm sống, cắt giữa phần đầu ngực và bụng,
giữ phần đầu ngực lại (chứa mang và gan tụy), tiêm dung dịch Davidson vào
Nhận mẫu
Cố định mẫu
Đúc mẫu
Cắt mẫu
Làm lạnh
Ủ mẫu trong
24 – 72 giờ
Chuyển mẫu lên
lam
Nhuộm và quan sát
dưới kính hiển vi
Ủ mẫu ở 40
0
C đến
khi mẫu dính chặt
vào lam
Xử lý mẫu
12,5 giờ
37

gan tụy và vùng xung quanh gan tụy, lượng thuốc dùng từ 0,1 – 10 ml (thay đổi
tùy kích thước tôm), sau đó cho vào lọ chứa dung dịch Davidson. Ngâm mẫu từ
24 – 72 giờ. Hoặc có thể cắt đầu tôm, tách vỏ, lấy phần mang và gan tụy, để
vào mảnh vải mùng nhỏ, cho vào cassette, đóng nắp và bỏ vào dung dịch
Davidson, ngâm như với tôm post-larvae.
Tỷ lệ chất cố định: mẫu =10:1
Bước 2: Xử lý mẫu.
Rửa nước 1 – 2 giờ dưới vòi nước chảy. Sau đó xử lý theo quy trình như
hình 3.2. Quy trình này được thực hiện bằng máy.
Tổng thời gian xử lý mẫu là 12,5 giờ.

Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu
Bước 3: Đúc mẫu
Đặt mẫu nằm sát đáy khuôn chứa nến có tỉ lệ parafin: sáp ong = 1:5, đậy
cassette lên khuôn để khi nến đông lại và dính vào cassette. Quá trình này cần
có bàn nóng và bình rót nến.
Đặt khuôn lên bề mặt bộ phận làm lạnh, đợi đến khi khuôn mẫu lạnh,
tách khối paraffin ra khỏi khuôn và đặt lên bề mặt làm lạnh sao cho mặt cắt
lạnh cứng lại.
Bước 4: Cắt mẫu: Cắt khối paraffin chứa mẫu bằng máy cắt microtome, kích
thước mỗi lát cắt là 5 μl.
Bước 5: Chuyển lát cắt vào nồi nước ấm 40
0
C, dùng lam dương vớt lát cắt.
Cồn 70%
30 phút
Cồn 95% (1)
30 phút

Cồn tuyệt đối (3)
30 phút
Cồn 95% (2)
30 phút
Cồn 95% (3)
30 phút
Cồn tuyệt đối (1)
30 phút
Cồn tuyệt đối (2)
30 phút
Chloroform (1)
1,5 giờ
Chloroform (2)
1,5 giờ
Paraffin (1)
3 giờ
Paraffin (2)
3 giờ
38


Giai đoạn 2: Nhuộm lát cắt theo phương pháp IHC
Bước 1: Làm mẫu dính chặt vào lam: Đặt lam chứa mẫu vào bàn ấm ở nhiệt độ
45
0
C đến khi khô hết nước và mẫu không di chuyển được.
Bước 2: Khử paraffin cho mô
Xylene 1 – 2 lần 5 phút/lần
Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần
Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần

Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần
Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần
Nhúng trong Tris buffer pH 7,6 + NaCl 1 lần trong 5 phút.
Bước3: Ngăn hoạt động của enzyme peroxidase nội bào: Pha dung dịch gồm
sodium azide (10%), Tris - NaCl, H
2
O
2
theo tỉ lệ 25 : 221 : 4. Lượng dung dịch
cần pha phụ thuộc vào lượng lam muốn nhuộm (80μl hỗn hợp/lam). Dùng
micropipette hút dung dịch và trải đều lên trên mặt mẫu.
Ủ mẫu 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 4: Ủ với kháng thể thứ nhất: Pha kháng thể 8B7 mAb (kháng WSSV
VP28) với huyết thanh cừu 10%(100 μl huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH
7,6) theo tỉ lệ 1:30. Lượng dung dịch cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3.
Ủ mẫu 1 giờ ở 37
0
C .
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/ lần).
Bước 5: Ủ với kháng thể thứ hai: Pha kháng thể thứ hai (kháng thể của cừu có
gắn biotin kháng lại kháng thể 1 từ chuột) với huyết thanh cừu 10% (100 μl
huyết thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lượng dung dịch
cần pha và cách sử dụng tương tự bước 3.
Ủ mẫu trong 1 giờ ở 37
0
C.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (3 phút/lần)
39

Bước 6: Ủ với treptavidine-biotin HRP: Pha phức hợp streptavidine-
biotinylated horseradise peroxidase với huyết thanh cừu 10% (100 μl huyết
thanh cừu + 900 μl tris buffer pH 7,6) theo tỉ lệ 1:200. Lượng dung dịch cần
pha và cách sử dụng tương tự bước 3.
Ủ mẫu trong 30 phút tại nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần với Tris buffer pH 7,6 + NaCl (5 phút/lần).
Bước 7: Làm hiển thị màu bằng DAB: Pha DAB trong Tris buffer pH 7,6 không
có NaCl (0,5mg DAB/ml Tris buffer). Bổ sung ngay trước khi dùng H
2
O
2

(30%) với tỉ lệ 3H
2
O
2
: 5Tris buffer.
Nhúng lam mẫu vào dung dịch và ủ vài phút tại nhiệt độ phòng.
Kiểm tra sự hiện màu (màu nâu tích tụ trong tế bào nhiễm virus) trong
phút đầu tiên sau khi nhúng lam vào dung dịch DAB. Dừng phản ứng bằng
cách nhúng lam trong tris buffer pH 7,6 + NaCl.
Bước 8: Nhuộm tạo nền tương phản bằng cách nhúng lam vài lần vào dung dịch
hematoxylin pha loãng.
Rửa cẩn thận với nước máy trong 1 phút.
Bước 9: Khử nước
Ethanol 50% 1 lần 5 phút/lần.
Ethanol 70% 1 lần 5 phút/lần.
Ethanol 95% 1 lần 5 phút/lần.
Ethanol 100% 1 lần 5 phút/lần.

Xylene 1 – 2 lần 5 phút/lần.
Bước 10: Dán lamel với Baume Canada.
Lam sau khi lấy ra khỏi xylene để khô trong vài phút, nhỏ một giọt keo
Baume Canada ngay trên tiêu bản mẫu, đặt lamel lên lam kính, tránh hiện tượng
có bọt khí bên trong.
40


Giai đoạn 3: Đọc kết quả. Cách đọc tiêu bản xác định thể ẩn và ghi nhận kết quả như
sau:
 Xem kết quả bằng kính hiển vi quang học ở vật kính 10x, 40x,
100x. Tế bào nhiễm WSSV có thể vùi dạng Crowdry A đặc trưng với
nhân trương to, sau đó hạch nhân trương to hơn, chiếm hết nhân, bắt
màu nâu.
 Các kết quả được khảo sát dựa trên:
+ Tỷ lệ cảm nhiễm là số tôm bệnh trên tổng số tôm kiểm tra.
+ Cường độ cảm nhiễm là % tế bào nhiễm virus.
+ Cường độ bắt màu là % tế bào nhiễm bắt màu nâu (vì ngoài
màu nâu, tế bào nhiễm còn có thể bắt màu nâu nhạt hay vàng).
+ Độ sắc nét là % tế bào nhiễm bắt màu sắc nét.
 Kết quả xét nghiệm được mã hoá thành kí hiệu và giá trị có ý
nghĩa về mặt toán học (Bảng 3.1).
Bảng 3.5. Bảng mã hoá kết quả

Nội dung
Số liệu Cường độ
Kí hiệu
mã hoá cảm nhiễm
- 0
0% 0% 0%

+/- 1
0 - 25% 0 - 25% 0 - 25%
+ 2
25 - 50% 25 - 50% 25 - 50%
++ 3
50 - 75% 50 - 75% 50 - 75%
+++ 4
75 - 100% 75 - 100% 75 - 100%
Cường độ bắt màu
Độ sắc nét

 Sau khi đọc kết quả, các lam chứa mẫu và các thông số đều được
lưu lại. Trong suốt quá trình thực hiện cần đánh dấu mẫu cẩn thận để
tránh nhầm lẫn


41


PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC
Tất cả các thí nghiệm so sánh trên cùng một mẫu được ghi nhận kết quả trên
các lát cắt liên tiếp nhau.
4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau
Bảng 4.1. Kết quả so sánh chi tiết 3 quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB
khác nhau trên 5 mẫu thử nghiệm
Kí hiệu
Cường độ cảm nhiễm
Cường độ bắt màu
Độ sắc nét

1X
1,5X
2X
1X
1,5X
2X
1X
1,5X
2X
45P
+
+
+
-
-
+/-
-
-
+/-
45D
+/-
+
+
-
+
++
-
+/-
+/-
101

+/-
+
+
-
+
+
-
+
+
53
+/-
+
+
-
+
++
-
+
++
103
+/-
+
+
-
+
+
-
+
+

- Nồng độ 1X: Tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu vàng nhạt hay nâu rất
nhạt, một số tế bào bắt màu DAB rất mờ không thể xác định rõ có phải là tế bào nhiễm
virus hay không, vì vậy mà cường độ cảm nhiễm của 4/5 mẫu thấp hơn 2 nồng độ còn
lại. Nhân tế bào bắt màu DAB không có hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm virus.
 Ở vật kính 10x: Phải quan sát rất kĩ mới nhận ra màu nhuộm.
 Ở vật kính 40x: Có thể nhận thấy màu vàng nhạt ở một số tế bào
nhưng tất cả các tế bào bắt màu đều không có hình dạng đặc trưng của
tế bào nhiễm virus (nhân không tròn và trương to), không sắc nét.
 Ở vật kính 100x: Một số tế bào có nhân trương to và khá tròn
nhưng không sắc nét. Hình dạng nhân tạo thành bởi những chấm màu
vàng hay nâu nhạt khá rời rạc.
42


- Nồng độ 1,5X: Lượng tế bào bắt màu DAB có màu nâu tăng lên đáng kể so với
nồng độ 1X, một số tế bào còn có màu nâu đậm. Hình dạng đặc trưng của nhân tế bào
nhiễm virus thể hiện rõ ở nhiều tế bào. Vì vậy có thể xác định thêm một số tế bào
nhiễm.
 Ở vật kính 10x: Có thể nhận thấy rõ màu nhuộm khác biệt so với
màu nền.
 Ở vật kính 40x: Phần lớn tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu
hay nâu nhạt. Hình dạng nhân khá rõ ràng và sắc nét.
 Ở vật kính 100x: Nhân tế bào trương to, tròn, rõ nét.
- Nồng độ 2X: Gần như tất cả các tế bào bắt màu DAB đều có màu nâu hay nâu
đậm, một số tế bào có màu nâu rất đậm, gần như đen, phần lớn tế bào có nhân rất đặc
trưng của tế bào nhiễm WSSV, trương to và tròn.
 Ở vật kính 10x: Màu nhuộm thể hiện rất rõ, có thể xác định ngay
tế bào nhiễm.
 Ở vật kính 40x: Nhân tế bào bắt màu nâu rõ nét. Nhiều tế bào có
hình dạng đặc trưng của tế bào nhiễm WSSV

 Ở vật kính 100: Màu nâu thể hiện rất đậm ở một số mẫu, ngay cả
ở những tế bào không có hình dạng đặc trưng vẫn rất sắc nét.
Nhìn chung, kết quả quan sát dưới kính hiển vi cho thấy có sự khác biệt đáng kể
về cường độ cảm nhiễm của mẫu, cường độ bắt màu, và độ sắc nét của tế bào nhiễm
khi nhuộm với DAB 1X so với nồng độ 1,5X và 2X. Nồng độ 1X có khả năng nhuộm
rất kém, không thể nhận biết rõ tế bào nhiễm WSSV với nồng độ này. Nồng độ 1,5X
và 2X thể hiện kết quả nhuộm tốt, nồng độ 2X có ưu thế hơn về cường độ bắt màu và
độ sắc nét nhưng nhiều tế bào lại bắt màu quá đậm, không cần thiết. Ở nồng độ 1,5X
chỉ có mẫu 45P bắt màu kém và không sắc nét. Điều này có thể do nhiều nguyên nhân
như không đủ lượng DAB, lượng virus nhiễm ít, mẫu nhuộm không tốt làm trôi màu,
không đủ lượng kháng thể Nhưng khi so sánh kết quả nhuộm với DAB 2X, cường
độ cảm nhiễm và độ sắc nét được cải thiện không đáng kể. Do đó mẫu 45P bắt màu
không tốt chắc chắn không phải vì nồng độ DAB không đủ để cho phản ứng.
43


Như vậy, nồng độ 1,5X biểu hiện tốt nhất với quy trình nhuộm này vì không
mất nhiều DAB một cách không cần thiết như nồng độ 2X nhưng vẫn cho kết quả
nhuộm tốt.
Hình 4.1. Kết quả nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau trên mẫu 45D
(tất cả hình ảnh được chụp trên cùng một vị trí mang).
A1, A2, A3: Mẫu mô sau khi nhuộm IHC với DAB 1X (100x), (400x), (1000x).
- Hình A1: Tế bào nhiễm bắt màu nâu nhạt, lẫn với màu nền, rất khó nhận ra.
- Hình A2: Có thể nhận thấy sự khác biệt giữa màu DAB và màu nền nhưng không
rõ, hình dạng tế bào nhiễm không sắc nét. Một số tế bào (mũi tên) không thể xác định
được có nhiễm virus hay không.
- Hình A3: Màu DAB nhạt, không rõ nhân tế bào nhiễm

A1 A2 A3

B1 B2 B3



C1 C2 C3