Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH (IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ part 1 doc

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH
(IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH
ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon)






Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: TRẦN NGỌC ÁNH MAI

Thành phố Hồ Chí Minh
- 2005 -
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***










ỨNG DỤNG KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH
(IMMUNOHISTOCHEMISTRY) TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH
ĐỐM TRẮNG (White Spot Disease – WSD) TRÊN TÔM SÚ
(Penaeus monodon)





Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:
TS. NGUYỄN VĂN HẢO TRẦN NGỌC ÁNH MAI
ThS. NGÔ XUÂN TUYẾN

Thành phố Hồ Chí Minh
- 2005 -

iii

LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm TPHCM
và quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học đã tận tình truyền đạt kiến thức trong
những năm qua.
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự giúp đỡ rất nhiều từ
Viện Nghiên Cứu và Nuôi Trồng Thủy Sản II. Vì vậy xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến:
- TS. Nguyễn Văn Hảo.
- ThS. Ngô Xuân Tuyến.
- BSTY Lê Thị Bích Thủy.
- Các anh chị phòng Mô Học và phòng PCR thuộc Trung Tâm Quốc Gia
Quan Trắc Cảnh Báo Môi Trường và Phòng Ngừa Dịch Bệnh Thuỷ Sản Khu
Vực Nam Bộ - Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II.
- Các anh chị phòng Sinh Học Thực Nghiệm và toàn thể nhân viên Trại

Thực Nghiệm Nuôi Thuỷ Sản - Thủ Đức – TPHCM.
Những gì mà tôi học được trong thời gian thực hiện đề tài tại Viện Nghiên Cứu
Và Nuôi Trồng Thủy Sản II là những bài học thực tế mà tôi sẽ không thể nào quên.
Do hạn chế về thời gian cũng như kiến thức nên luận văn này không thể tránh
khỏi những thiếu sót nhất định, tôi rất mong nhận được sự góp ý chân thành của thầy
cô và các bạn.








iv

TÓM TẮT
Virus WSSV (White spot syndrome virus), thành viên của một họ virus mới tên
là Nimaviridae, là một loại virus nguy hiểm đối với tôm penaeids vì khả năng gây chết
cao và nhanh. Đề tài này được tiến hành nhằm phát triển một quy trình kiểm nghiệm
mới ổn định, chính xác và có độ nhạy cao để phát hiện mầm bệnh WSSV trên tôm sú
Penaeus monodon trong phòng thí nghiệm Việt Nam. Đó là quy trình hoá mô miễn
dịch (Immunohistochemistry - IHC) dựa trên kháng thể đơn dòng. Đại học Gent đã
phát triển quy trình chuẩn cho kiểm nghiệm IHC sử dụng kháng thể đơn dòng
(monoclonal antibody - mAb) 8B7 kháng lại protein VP28 của WSSV ứng dụng trên
mẫu cố định trong paraffin và mẫu cắt lạnh. Quy trình này được nghiên cứu để thay
đổi một vài chi tiết cho phù hợp hơn với điều kiện ở Việt Nam.
Bốn nồng độ khác nhau của kháng thể đơn dòng (nồng độ chuẩn - 1X, 0,5X,
1,5X và 2X) và ba nồng độ khác nhau của DAB (1X, 1,5X và 2X) được bố trí thử
nghiệm trên các mẫu cắt cố định trong paraffin thu từ mô của các cá thể nhiễm và

không nhiễm WSSV và nồng độ chuẩn (1X) của kháng thể đơn dòng vẫn chứng tỏ tính
hiệu quả ứng với nồng độ DAB là 1,5X.
Để so sánh phương pháp IHC với phương pháp PCR và mô học truyền thống về
tính chính xác, độ nhạy và hiệu quả kinh tế, 25 mẫu mô của tôm sú post-larvae và 30
mẫu mô của tôm sú thương phẩm đã được kiểm tra bằng cả 3 phương pháp. So với 2
phương pháp còn lại, trong một số trường hợp, IHC được xem là phương pháp đáng
tin cậy nhất nhờ tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng. Khác với mô học truyền thống,
IHC không quá phụ thuộc vào khả năng phát hiện tế bào nhiễm của người đọc mẫu bởi
vì tín hiệu màu (màu nâu) rất rõ và dễ nhận biết. Bên cạnh đó, nhờ thao tác đơn giản,
mAb có độ nhạy cao và mẫu kiểm tra không dễ bị ngoại nhiễm như PCR nên IHC
hiếm khi có hiện tượng dương tính giả và âm tính giả. Chính vì những ưu điểm nổi bật
đó của IHC chúng tôi khuyến khích sử dụng phương pháp này để chẩn đoán mầm bệnh
WSSV trên tôm sú trong những thí nghiệm phục vụ nghiên cứu vốn yêu cầu cao về độ
chính xác.






v

ABSTRACT
White spot syndrome virus (WSSV), member of a new virus family called
Nimaviridae, is an invertebrate virus causing

considerable mortality in penaeid shrimp.
This study was undertaken to develop a stable, accurate and sensitive monoclonal
antibody (mAb)-based immunohistochemistry (IHC) test process for detection of
WSSV in Penaeus monodon in Vietnam laboratories. The standard operating protocol

for IHC test using the WSSV VP28 mAb 8B7 on paraffin-embedded and frozen
section was developed by Gent University. To be more suitable in Vietnam condition,
this protocol was modified in some details.
Four different concentrations of mAb (standard - 1X, 0.5X, 1.5X and 2X) and
three different ones of 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) (1X, 1.5X and
2X) were tested on paraffin embedded sections from tissues of infected and uninfected
black tiger shrimp Penaeus monodon and the standard concentration of mAb still
proved to be efficient with the 1.5X concentration of DAB.
To compare IHC method with Polymerase Chain Reaction (PCR) and
traditional histology about accuracy, sensitivity and economic efficiency, 25 samples
of post-larvae tissues and 30 samples of adult tissues of Penaeus monodon were tested
with these three methods. Of the three, in some cases, IHC was considered to be the
most reliable technique because of the specificity of the WSSV VP28 mAb 8B7.
Unlike the traditional histology, IHC is not too dependent on the professionalism of
the technicians to recognize the infected cells as the color signal (brown) is very clear
and easily seen. Besides, IHC seldom gives false positive and negative signals because
the manipulation is simple, the samples are not easily contaminated by various factors
in process like PCR and the mAb is highly sensitive. For all of the advantages of IHC,
we suggest using this method for WSSV diagnostics on Penaeids in research
experiments in which accuracy is the prerequisite.






vi

MỤC LỤC
ĐỀ MỤC TRANG

TRANG TỰA
LỜI CẢM TẠ iii
TÓM TẮT iv
ABSTRACT v
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT x
DANH SÁCH CÁC HÌNH x
DANH SÁCH CÁC BẢNG xi
1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Nội dung 2
1.3. Mục đích 2
1.4. Yêu cầu 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú 3
2.1.1. Phân loại 3
2.1.2. Phân bố 3
2.1.3. Vòng đời 3
2.1.4. Sinh trưởng 4
2.1.5. Dinh dưỡng 4
2.1.6. Môi trường sống 5
2.1.7. Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam 5
2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng 6
2.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam 6
2.2.2. Giới thiệu bệnh đốm trắng 9
2.2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng 9
2.2.2.2. Phân loại và tên gọi 10
2.2.2.3. Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố
lý hoá 11
2.2.2.4. Độc lực 12

2.2.2.5. Hình thái 12
2.2.2.6. Cấu trúc 12
2.2.2.7. Vật chất di truyền 13
2.2.2.8. Đa dạng di truyền 15
2.2.2.9. Vật chủ 16
2.2.2.10. Cơ chế xâm nhiễm 17
2.2.2.11. Cơ chế truyền lan 18
2.2.2.12. Triệu chứng, bệnh tích 19
2.2.2.13. Biện pháp phòng và trị bệnh 19
2.3. Các phương pháp chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên giáp xác 20
2.4. Sơ lược về hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry) 21
2.4.1. Lịch sử phát triển 21

vii

2.4.2. Nguyên lý 22
2.4.3. Kháng nguyên (antigen hay immunogen) 22
2.4.4. Kháng thể (antibody) 23
2.4.5. Các phương pháp nhuộm 25
2.4.6. Ứng dụng phương pháp trong chẩn đoán mầm bệnh trên động
vật nuôi thủy sản 28
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 30
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 30
3.2. Vật liệu 30
3.2.1. Mẫu xét nghiệm 30
3.2.2. Vật liệu nhuộm IHC 32
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ 32
3.2.4. Hoá chất 32
3.3. Phương pháp 33
3.3.1. Bố trí thí nghiệm 33

3.3.2. Quy trình thực hiện 36
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
4.1. Kết quả nội dung hoàn thiện quy trình nhuộm IHC 41
4.1.1. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác
nhau 41
4.1.2. Thử nghiệm quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAB khác
nhau 44
4.2. Kết quả nội dung so sánh phương pháp IHC với phương pháp Mô học
truyền thống và kỹ thuật PCR về độ chính xác, độ nhạy, tính ổn định và
tính hiệu quả 49
4.2.1. So sánh tính chính xác và độ nhạy của 3 phương pháp PCR,
Mô học và IHC 49
4.2.2. So sánh về tính ổn định và hiệu quả của 3 phương pháp PCR,
Mô học và IHC 57
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 59
5.1. Kết luận 59
5.2. Đề nghị 59
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 61
6.1. Tài liệu tiếng Việt 61
6.2. Tài liệu tiếng Anh 61
PHỤ LỤC 70
Phụ lục 1: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh chi tiết 4 quy trình nhuộm
IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm
Phụ lục 2: Bảng ANOVA của nội dung so sánh 4 quy trình nhuộm IHC với 4
nồng độ mAb
Phụ lục 3: Bảng số liệu mã hoá kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh
virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC trên
tôm sú post-larvae và tôm thương phẩm.
Phụ lục 4: Bảng ANOVA của nội dung so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh
virus đốm trắng của ba phương pháp PCR, Mô học và IHC.

viii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
TPHCM : Thành phố Hồ Chí Minh.
ĐBSCL : Đồng bằng sông Cửu Long.
DAB : 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride.
FAO : Food and Agriculture Organization.
IHC : Immunohistochemistry.
MBV : Monodon Baculovirus.
mAb : monoclonal Antibody.
PCR : Polymerase Chain Reaction.
ppt : parts per thousand
ppm : parts per million
WSSV : White Spot Syndrome Virus.
YHV : Yellow Head Virus.

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG NỘI DUNG TRANG
Bảng 2.1. Các bệnh thường gặp trên tôm penaeids 7
Bảng 2.2. Tên gọi của virus đốm trắng 11
Bảng 3.1. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 1 30
Bảng 3.2. Các mẫu thử nghiệm cho nội dung 2 31
Bảng 3.3. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 1 34
Bảng 3.4. Bố trí thí nghiệm cho nội dung 2 35
Bảng 3.5. Bảng mã hoá kết quả 40
Bảng 4.1. Kết quả thống kê chi tiết 3 quy trình nhuộm IHC với 3 nồng độ
DAB khác nhau trên 5 mẫu thử nghiệm 41
Bảng 4.2. Kết quả thống kê chi tiết 4 quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ
mAb khác nhau trên 10 mẫu thử nghiệm 44
Bảng 4.3. Kết quả thống kê so sánh quy trình nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb 45
Bảng 4.4. Kết quả so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh WSSV của 3 phương
pháp PCR, Mô học và IHC trên tôm sú post-larvae và tôm thương
phẩm 50
Bảng 4.5. Kết quả thống kê so sánh khả năng phát hiện mầm bệnh virus đốm
trắng của ba phương pháp PCR, Mô học truyền thống và IHC 51
Bảng 4.6. So sánh ưu khuyết điểm của 3 phương pháp PCR, Mô học truyền
thống và IHC 57

x

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ VÀ HÌNH ẢNH
HÌNH NỘI DUNG TRANG
Hình 2.1. Sơ đồ vòng đời tôm sú 4
Hình 2.2. Sản lượng tôm ở Châu Á và những bệnh quan trọng 8
Hình 2.3. Sự phân tán và phân bố bệnh đốm trắng trên thế giới 9
Hình 2.4. Virus đốm trắng 12
Hình 2.5. Protein của WSSV 13
Hình 2.6. Sơ đồ genome của WSSV 14
Hình 2.7. Tôm nhiễm WSSV và tế bào nhiễm WSSV 19
Hình 2.8. Kháng thể đa dòng và kháng thể đơn dòng 23
Hình 2.9. Các phương pháp nhuộm 26
Hình 3.1. Sơ đồ tổng quát quy trình chẩn đoán bằng IHC 36
Hình 3.2. Sơ đồ xử lý mẫu 37
Hình 4.1. Kết quả nhuộm IHC với 3 nồng độ DAB khác nhau
trên mẫu 45D 43
Hình 4.2. Kết quả nhuộm IHC với 4 nồng độ mAb khác nhau và
đối chứng (không có mAb) trên mẫu 103 48
Hình 4.3. Tế bào nhiễm WSSV trên các cơ quan khác nhau của tôm
Sau khi nhuộm IHC 54

Hình 4.4. Tế bào nhiễm WSSV sau khi nhuộm bằng IHC và
Mô học truyền thống 55


1


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Những năm gần đây, nuôi tôm là một trong những ngành phát triển mạnh nhất
trong ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới. Kể từ khi xuất hiện, nghề nuôi tôm ngày
càng chứng tỏ khả năng đem lại lợi nhuận to lớn cho nền kinh tế quốc dân. Ở Việt
Nam, trong 10 năm trở lại đây, phong trào nuôi tôm phát triển rất nhanh, đặc biệt là
khu vực các tỉnh ven biển đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) như Cà Mau, Bạc
Liêu, Trà Vinh, Bến Tre …, và tôm sú (Penaeus monodon) là một đối tượng nuôi chủ
lực của ngành nuôi trồng thủy sản nước ta.
Tuy nhiên, việc phát triển ồ ạt không định hướng, kỹ thuật quản lý ao chưa tốt,
không quan tâm đúng mức đến vấn đề môi trường làm phát sinh nhiều yếu tố rủi ro,
trong đó chủ yếu là bệnh tật. Trong nhiều năm gần đây, nghề nuôi tôm sú ở Việt Nam
phải đối đầu với dịch bệnh đốm trắng (White Spot Syndrome Disease – WSD) do virus
đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) gây nên, một loại bệnh nguy hiểm
do tỉ lệ tôm chết có thể lên đến 80 – 100% trong vòng 7 – 10 ngày (Nakano và ctv,
1994), khả năng lây nhiễm rất cao, dễ thành dịch bệnh và cho đến hiện nay vẫn chưa
có biện pháp phòng và trị hiệu quả. Mức thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra đã lên đến
hàng trăm tỷ đồng. Vấn đề quan trọng là diễn biến bệnh xảy ra nhanh, khi người dân
nhận biết được những biểu hiện bên ngoài của bệnh trên tôm thì chỉ một thời gian ngắn
sau tôm sẽ chết hàng loạt mà không thể chữa được. Vì vậy, việc chẩn đoán nhanh và
chính xác mầm bệnh ở đầu vào của qui trình nuôi, cũng như xác định sự hiện diện
mầm bệnh WSSV trên tôm trong quá trình nuôi là hết sức cần thiết. Điều này sẽ giúp
người dân kiểm soát được mối nguy đầu vào và kịp thời triển khai những biện pháp

đối phó khi có mầm bệnh WSSV trên tôm đang nuôi.
Cho đến nay đã có nhiều phương pháp xác định WSSV trên tôm sú và giáp xác
đã được phát triển và ứng dụng như: Phương pháp mô học truyền thống, một số
phương pháp dựa trên cơ chế miễn dịch đặc hiệu (ELISA, Western blot), phương pháp
kính hiển vi điện tử, các kỹ thuật PCR (one-step, two-step nested, realtime-PCR), in
situ hybridization…Tuy nhiên việc tìm ra một phương pháp tối ưu vừa nhanh, vừa
chính xác, đồng thời có độ tin cậy cao hơn luôn là mối quan tâm lớn của các nhà
2


nghiên cứu bệnh thủy sản. Việc kết hợp kết quả xét nghiệm của hai phương pháp IHC
(Immunohistochemistry) và kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) trên cùng một
mẫu tôm sẽ đáp ứng được mục tiêu trên.
Trên cơ sở thiết thực này, được sự phân công của khoa Công Nghệ Sinh Học và
được sự chấp thuận của Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thủy Sản II, chúng tôi đã tiến
hành đề tài “Ứng dụng kỹ thuật hóa mô miễn dịch (Immunohistochemistry) trong
chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng (White Spot Syndrome Virus – WSSV) trên
tôm sú (Penaeus monodon)”
1.2. Nội dung
1.2.1. Phát triển kỹ thuật hóa mô miễn dịch để chẩn đoán mầm bệnh virus đốm
trắng trên tôm sú.
1.2.2. So sánh phương pháp IHC về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác và tính
hiệu quả với phương pháp mô học truyền thống và kỹ thuật PCR.
1.3 Mục đích
Phát triển kỹ thuật hóa mô miễn dịch để chẩn đoán mầm bệnh virus đốm trắng
trên tôm sú nhằm xây dựng quy trình chẩn đoán ổn định, có độ nhạy và độ chính xác
cao, thích hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Việt Nam.
So sánh phương pháp hóa mô miễn dịch về độ ổn định, độ nhạy, độ chính xác,
tính hiệu quả và hiệu quả kinh tế với các phương pháp khác.
1.4 Yêu cầu

Phương pháp phải đạt độ chính xác theo tiêu chuẩn ngành.
Phải được xây dựng trên một cơ sở khoa học xác định.



3


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đặc điểm sinh học của tôm sú
2.1.1. Phân loại
Theo hệ thống phân loại của Hothuis (1980) và Barnes (1987) tôm sú thuộc
Ngành: Arthopoda (Chân khớp)
Lớp: Crustacea (Giáp xác)
Lớp phụ: Malacostraca
Bộ: Decapoda (Mười chân)
Bộ phụ: Macrura natantia (Bơi lội)
Họ: Penaeidae (Tôm he)
Giống: Penaeus
Loài: Penaeus monodon
Tên tiếng Anh: Black Tiger Shrimp
2.1.2. Phân bố
Theo chiều ngang: Phân bố rộng rãi trên thế giới, ở vùng Ấn Độ Dương, Tây
Thái Bình Dương, từ Pakistan tới Nhật, từ quần đảo Malaysia đến Úc, đặc biệt phân bố
tập trung ở vùng Đông Nam Á như Việt Nam, Philipines, Indonesia và Malaysia (Trần
Minh Anh, 1989).
Theo chiều dọc: Ở giai đoạn ấu trùng và ấu niên Penaeus monodon sống nổi,
dần thích nghi sống đáy. Ở vùng cửa sông, ấu niên và thiếu niên tôm sống ở tầng mặt
trong khi phần lớn tôm trưởng thành sống ở mực nước sâu khoảng 70 m (ngoài khơi
Philippines), hay 30 – 39 m (vịnh Thái Lan) , ở nhiệt độ là 34

0
C và độ mặn là 35 ppt.
2.1.3. Vòng đời: Theo Vũ Thế Trụ (1995)
Tôm mẹ họ Penaeidae đẻ trứng ngoài biển sâu. Trứng nở thành ấu trùng, trôi
nổi theo dòng nước và được sóng biển đưa vào gần bờ, nơi có nước sông ngòi đổ ra
tạo thành môi trường nước lợ với độ mặn 15 – 25 ppt. Ấu trùng trải qua nhiều giai
4


đoạn biến thái để thành post-larvae (Hình 2.1). Tổng thời gian từ khi nở đến post-
larvae 1 (PL1) kéo dài khoảng 10 – 12 ngày.
Tại môi trường nước lợ post-larvae sống khoảng vài tuần rồi bơi ngược ra biển,
tiếp tục tăng trưởng và sinh đẻ, hoàn tất chu trình tăng trưởng của loài tôm.








Hình 2.1: Sơ đồ vòng đời tôm sú Penaeus monodon
2.1.4. Sinh trƣởng
Tôm gia tăng kích thước bằng cách lột bỏ lớp vỏ cũ của cơ thể. Solid (1988)
cho biết tôm sú thường lột xác vào ban đêm. Thời gian để vỏ mới của tôm con cứng lại
cần một vài giờ, ở tôm trưởng thành phải cần 1 đến 2 ngày (Viladolid và ctv, 1981).
2.1.5. Dinh dƣỡng
Tôm sú ăn tạp (Hall, 1962). Giai đoạn ấu trùng tôm bắt mồi thụ động bằng các
phụ bộ với các loại thức ăn phù hợp với cỡ miệng. Apud (1984) nhận định tôm sú ở
giai đoạn ấu trùng Zoea ăn thực vật phù du với 2 giống tảo Silic thích hợp là

Chaetoceros và Skeletonema. Ở giai đoạn Mysis tôm chuyển sang ăn một số loài động
vật phù du, luân trùng và ấu trùng Nauplius của Artermia. Giai đoạn post-larvae tôm
ăn giun nhiều tơ, ấu trùng tôm, cua, nhuyễn thể, mùn bã hữu cơ. Hall (1962) cho biết
tôm trưởng thành thích ăn giáp xác, sản phẩm thực vật, giun nhiều tơ, nhuyễn thể, cá,
Biển
Cửa sông

Cửa sông
Bờ biển
Biển

5


côn trùng. Như vậy tập tính ăn và loại thức ăn của tôm sú khác nhau theo giai đoạn
sinh trưởng.
2.1.6. Môi trƣờng sống
 Nhiệt độ: Theo Vũ Thế Trụ (1995), nhiệt độ tối ưu cho tôm Penaeus
spp. tại các ao hồ vùng nhiệt đới khoảng 28 – 30
0
C. Trên 30
0
C, tôm lớn nhanh
nhưng dễ nhiễm bệnh, nhất là bệnh MBV (Monodon Baculovirus). Dưới 28
0
C,
tôm chậm lớn.
 Độ mặn: Theo Valencia (1977) nhiệt độ và độ mặn tạo nên ảnh hưởng
kết hợp. Các loài tôm có tỷ lệ sống cao ở nhiệt độ trung bình thấp và độ mặn
trung bình cao nhưng sinh trưởng nhanh hơn ở điều kiện ngược lại.

 Hàm lượng oxy hoà tan trong nước: Theo Chiu (1992) tôm sú chết khi
hàm lượng oxy hoà tan nhỏ hơn 3,5 mg/l. Theo Chanratchakool và ctv (1995)
thì khi hàm lượng oxy nhỏ hơn 4 mg/l tôm sử dụng thức ăn kém và dễ nhiễm
bệnh.
 Độ pH: Độ pH có ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến tôm nuôi, pH
thấp có thể làm tổn thương các phần phụ, mang, quá trình lột xác và cứng vỏ
của tôm (Bauman và Jamandro, 1990).
 H
2
S và NH
3
-N: Theo Lê Xân (1996), H
2
S dạng tự do hình thành do sự
phân huỷ của các vi khuẩn dị dưỡng trong điều kiện yếm khí. Kungvankji và
Chua (1986) khẳng định H
2
S rất độc hại đối với các sinh vật sống đáy và các
loài tôm có đặc tính vùi mình như tôm sú.
 Độ kiềm: Độ kiềm tổng cộng trong nước liên quan đến những chất baz
(chủ yếu là bicarbonate và carbonate), được tính bằng mg calcium carbonate
tương đương trong 1 lit. Mặt nước có lượng kiềm tổng cộng 20 – 150 mg/l thì
thích hợp cho sự phát triển của phiêu sinh và loài thủy sản trong đó (Vũ Thế
Trụ, 1995).
2.1.7. Hiện trạng nuôi tôm sú trên thế giới và tại Việt Nam
Những năm gần đây, nuôi tôm là một trong những ngành phát triển mạnh nhất
trong ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới. Theo FAO (1995), sản lượng tôm khai
6

thác hằng năm trên thế giới là 2 triệu tấn, trong đó có 30% là tôm nuôi. 50% sản lượng
tôm sú được cung cấp từ Châu Á (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1998).
Bờ biển Việt Nam trải dài 3.260 km từ Quảng Ninh đến Kiên Giang là tiềm
năng to lớn cho nuôi trồng thuỷ sản nước mặn và nước lợ. Ông Nguyễn Việt Thắng,
Thứ trưởng Bộ Thuỷ Sản cho biết nuôi trồng thuỷ sản đang có bước phát triển nhanh,
đóng góp quan trọng cho sự tăng trưởng kinh tế chung của ngành thuỷ sản. Diện tích
nuôi trồng thuỷ sản liên tục tăng: Từ 887.500 ha năm 2001 lên khoảng 995.400 ha năm
2004. Theo đó, sản lượng nuôi trồng thuỷ sản tăng từ 879.000 tấn năm 2001 lên
1.420.000 tấn năm 2004, đạt mức tăng bình quân trên 20%/năm. Tỷ lệ giá trị xuất khẩu
so với tổng giá trị xuất khẩu thuỷ sản không ngừng tăng, đến nay đạt khoảng 50%. Tỷ
lệ sản lượng nuôi trồng trong tổng sản lượng thuỷ sản chiếm 39% năm 2001 đã tăng
lên 48% năm 2004 (Kim Oanh, 2005).
Nghề nuôi tôm ở Việt Nam, đặc biệt là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long
(ĐBSCL), tuy đã xuất hiện từ lâu nhưng chỉ mới thực sự phát triển từ những năm cuối
thập niên 80. Hằng năm, ĐBSCL đóng góp trên 80% sản lượng thủy sản chung của
toàn ngành. Tại đây, diện tích nuôi quảng canh chiếm 88%, nuôi bán thâm canh và
thâm canh không đáng kể (Nguyễn Văn Hảo và ctv, 1998).
Theo Nguyễn Thanh Phương (2002), hiện nay ở ĐBSCL đã phát triển và ứng
dụng các mô hình nuôi tôm chủ yếu sau: Quảng canh (Extensive culture), quảng canh
cải tiến (Improved extensive culture), bán thâm canh (Semi-intensive culture), thâm
canh (Intensive culture) và nuôi sinh thái.
2.2. Bệnh đốm trắng và virus gây bệnh đốm trắng
2.2.1. Tình hình dịch bệnh trên thế giới và tại Việt Nam
A. Trên thế giới
Việc phát triển ồ ạt của nghề nuôi tôm sú trên thế giới là nguyên nhân dẫn đến
sự suy thoái môi trường và dịch bệnh xảy ra khắp nơi (từ Đông Bán Cầu sang Tây Bán
Cầu) gây nhiều thiệt hại nghiêm trọng. Trong đó các bệnh do virus gây ra đang là một
thách thức lớn cho sự phát triển nghề nuôi tôm toàn cầu. Các bệnh truyền nhiễm do
nhóm virus WSSV (White Spot Syndrome Virus), YHV (Yellow Head Virus) và
7

MBV là những bệnh điển hình về mức độ gây thiệt hại nghiêm trọng nhưng cho đến
nay vẫn chưa có một loại thuốc hay vaccin nào điều trị hiệu quả.
Bảng 2.1. Các bệnh thƣờng gặp trên tôm penaeids (Lightner và Redman, 1998).
Mầm
bệnh virus
Vi khuẩn
Nấm
Kí sinh trùng
Loại khác
WSSV
YHV
BMN
MBV
IHHNV
HPV
REO
TSV
Vibriosis:
-Septic HP necrosis
-Hatchery vibriosis
-Luminescent
vibrio
-‘Syndrome
Gaviota’
-Shell disease NHP
bacterium
Rickettsia
Larval mycosis

Fusariosis
Epicommensals:
-Leucothrix
mucor
-Peritrich
protozoans
Gregarines
Microsporidian
Mất cân bằng
dinh dưỡng.
Bệnh do độc tố
Bệnh do môi
trường
One month
death syndrome
Zoea II
syndrome

Do ảnh hưởng của dịch bệnh năng suất tôm toàn cầu trong năm 1993 chỉ đạt
639.000 tấn, giảm 12% so với năng suất của năm 1992 (Lavilla – Pitogo,1996).
Trong năm 1994, tổng thiệt hại gây ra do WSD (White Spot Disease) và YHD
(Yellow Head Disease) khoảng 1 tỷ USD đối với các nước có nghề nuôi tôm đang phát
triển như Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Indonesia, Bangladesh, Malaysia, Đài Loan,
Việt Nam và Nhật (World Shrimp Farming, 1998).
Dịch bệnh do WSSV gây ra thiệt hại nghiêm trọng ở nhiều quốc gia như: Ấn
Độ (1994 – 1995) làm cho nhiều trang trại nuôi lớn phải đóng cửa (Murthy , 1997),
Thái Lan (1996 – 1997) với thiệt hại ước tính lên đến 1 tỷ USD, Trung Quốc (1993)
làm sản lượng xuất khẩu tôm từ 115.000 tấn năm 1992 giảm xuống còn 50.000 tấn
năm 1993 (Flegel, 2000).
Trong 10 năm trở lại đây, WSSV đã khiến ngành công nghiệp nuôi tôm tiêu tốn

20 – 30 tỉ USD (Caleb, 2004).
8


Hình 2.2. Sản lƣợng tôm ở Châu Á và những bệnh quan trọng (Caleb, 2004).
B. Việt Nam: Ở Việt Nam, tình hình cũng diễn ra tương tự.
Cuối năm 1993, tôm nuôi đã chết hàng loạt ở các tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu, Tiền
Giang, Bến Tre, Trà Vinh, Cà Mau và Bạc Liêu. Hiện tượng này tiếp tục xuất hiện
trong hai năm 1994 – 1995 và lan rộng trên hầu hết các tỉnh ven biển phía Nam đã gây
thiệt hại trên dưới 250 tỉ đồng (Phan Lương Tâm, 1994).
Gần đây, bệnh đốm trắng đã khiến cho nhiều gia đình nuôi tôm mất trắng, gây
thiệt hại hàng trăm tỉ đồng. Dịch bệnh nổ ra ở các tỉnh trên khắp đất nước nhất là tại
các tỉnh nuôi tôm trọng điểm như Cà Mau, Bạc Liêu, Bến Tre, Tiền Giang … Tại
ĐBSCL năm 1999 diện tích là 173.510 ha và sản lượng nuôi là 49.624 tấn, đến năm
2001 diện tích tăng lên thành 404.911 ha và sản lượng đạt 143.822 tấn. Tuy nhiên, đến
vụ một năm 2002 mức lây nhiễm bệnh là 30 - 60% trên tổng diện tích thả nuôi, mà
bệnh đốm trắng do virus đốm trắng là một trong những bệnh nguy hiểm và gây tổn
thất lớn.
Trong 1 – 2 năm trở lại đây nghề nuôi tôm đã phát triển tới miền Bắc và trên
những vùng nuôi tôm mới này bệnh đốm trắng vẫn xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm
trọng.

Năm
Sản
lượng
(tấn)


9

2.2.2. Giới thiệu bệnh đốm trắng
2.2.2.1. Lịch sử và phân bố bệnh đốm trắng

Hình 2.3: Sự phân tán và phân bố bệnh đốm trắng trên thế giới (CSIRO, 2002).
Kể từ khi xuất hiện đầu tiên vào năm 1992-1993 tại Đông Bắc Châu Á, bệnh
đốm trắng đã lan nhanh, rộng khắp khu vực Châu Á và khu vực Châu Á-Thái Bình
Dương, nhất là các nước có nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Dịch bệnh được phát
hiện trước tiên tại Đài Loan năm 1992, Trung Quốc (1993), sau đó là Nhật Bản (1993),
Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ, Bangladesh, Texas (Hoa Kỳ, 1995) kèm theo
sự sa sút nghiêm trọng sản lượng tôm ở các quốc gia trên (Wang và ctv, 1998).
Bệnh xuất hiện bất thường và được xem như là một hiện tượng của năm 1991
và đầu năm 1992 tại một điểm riêng lẻ ở đông bắc Đài Loan. Bệnh được phát hiện đầu
tiên trên Marsupenaeus japonicus nhưng sau đó lan rộng đến Penaeus monodon và
Fenneropenaeus penicillatus (Walker, 2000).
Chưa phát hiện

Đã phát hiện

Chưa có số liệu

10


Tháng 3/1992, WSSV lần đầu tiên được phát hiện tại Trung Quốc. Có giả
thuyết rằng virus được du nhập vào Trung Quốc từ Đài Loan thông qua nhập khẩu
nauplius và post-larvae. Trong 5 tháng sau đó bệnh nhanh chóng lan rộng ở nhiều tỉnh
dọc theo bờ biển Trung Quốc (Walker, 2000).
Tháng 3 năm 1993, WSSV xuất hiện trên tôm nuôi P. japonicus ở Nhật. Ngay
đầu tiên, bệnh gây ảnh hưởng nghiêm trọng đối với tất cả các trang trại ở Hiroshima,

Yamagushi, Ohita, Kumamoto, Kagoshima và Okinawa (Walker, 2000).
Năm 1993, WSSV cũng được phát hiện trên loài P. orientalis ở vùng biển phía
Nam và Tây Triều Tiên (Walker, 2000).
Vùng Tây bán cầu: Năm 1995, báo cáo đầu tiên về WSSV xảy ra trên ao nuôi
tôm Litopenaeus setiferus ở Texas, Hoa Kỳ. Các quốc gia sau đó phát hiện đốm trắng
lần lượt là Guatamela, Elsalvador, Panama, Ecuador và Columbia năm 1999,
Nicaragua và Mexico năm 2000 (Walker , 2000).
2.2.2.2. Phân loại và tên gọi
A. Phân loại
WSSV đầu tiên được phân loại thuộc họ Baculoviridae (Francki và ctv, 1991).
Tuy nhiên những phân tích trình tự gần đây của hệ gen WSSV cho thấy chúng mã hóa
một số loại protein không giống protein của Baculovirus như protein ribonucleotide
reductase (RR1 và RR2) (van Hulten và ctv, 2000b), protein VP26, VP28 (van Hulten
và ctv, 2000c) của WSSV không giống bất kì một protein đã biết nào trong database.
Ngoài ra, trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen WSSV cho thấy nhiều gen không giống
gen của virus nào khác (van Hulten và ctv, 2001; Yang và ctv, 2001). Sự khác biệt về
genome và phổ kí chủ rộng của WSSV (Flegel, 1997) chứng tỏ WSSV là đại diện cho
một họ virus mới (van Hulten và ctv, 2000a).
Gần đây nhất, M.A.Mayo (2002) công bố phân loại mới nhất được thẩm định
trong Hội nghị Quốc tế về phân loại virus (International Committee on Taxonomy of
Virus - ICTV), trong đó xếp WSSV là bộ phận của chi Whispovirus trong họ virus mới
gọi là Nimaviridae.

11


B. Tên gọi:
Bảng 2.2. Tên gọi của virus đốm trắng
Tên
Vị trí

Tài liệu tham khảo
Penaeid Hemacytic Rod Shaped Virus
(PHRV)

Owens và ctv, 1993

China Baculovirus (CBV)
Trung Quốc

Chamberlain, 1994

Hypodermal and hematopoietic necrosis
baculovirus (HHNBV)

Trung Quốc

Huang và ctv, 1994

Rod-shaped Virus of Penaeus japonicus (RV-
PJ)
Nhật
Inouye và ctv, 1994
Penaeus chinesis Baculovirus (PCBV)
Trung Quốc

Zhan và ctv, 1995

Penaeus monodon non-occluded Baculovirus
II (PmNOII)
Thái Lan

Woongteerasupaya và ctv,
1995

Penaeus monodon non-occluded Baculovirus
III (PmNOIII)

Đài Loan

Wang, 1995

Systemic ectodermal and mesodermal
baculovirus (SEMBV)

Thái Lan

Woongteerasupaya và ctv,
1995

China Baculo-like virus (CBV)

Trung Quốc

Tapay và ctv, 1996

Penaeid Rod-shaped DNA virus (PRDV)

Nhật

Inouye và ctv, 1996

White Spot Baculovirus (WSBV)

Đài Loan

Chang và ctv, 1996

Yellow head disease-like virus
Đài Loan
Wang và ctv, 1996a
Prawn White Spot Baculovirus (PWSBV)

Trung Quốc

Yang và ctv, 1997

White Spot Syndrome Baculovirus (WSSB)
Thái Lan
Durand và ctv, 1997
White Spot Syndrome Virus (WSSV)



Đài Loan

Lo và Kou, 1998

2.2.2.3. Một số đặc tính của virus đốm trắng với các yếu tố lý hóa
Cũng như đa số các virus, virus gây bệnh đốm trắng WSSV có sức chịu đựng
yếu với các yếu tố môi trường. Theo Chang và ctv (1998):

 Sau 48 –72 giờ sau khi tiếp xúc môi trường nước mà không tìm
được vật chủ thì WSSV sẽ bị phân hủy.
 Virus mất khả năng gây nhiễm sau 60 phút dưới tia UV
(Ultraviolet) 9 x 105 µWs/cm
2
.
 Trong khoảng nhiệt độ 55 – 75
0
C trong 5 – 90 phút, virus mất khả
năng gây nhiễm.
 Ozone ở nồng độ 0,5 µg/ml sẽ làm bất hoạt WSSV ở 25
0
C.
12


2.2.2.4. Độc lực
Thí nghiệm gây nhiễm mầm bệnh đốm trắng trên giáp xác gồm: 5 loài tôm biển
(trong đó có tôm sú), 2 loài tôm nước ngọt (có tôm càng xanh), 4 loài cua và 3 loài
tôm hùm, bằng cách cho tiêm hoặc cho ăn WSSV được tách chiết từ tôm sú
(P.monodon) nhiễm bệnh cho thấy tất cả các loài đều bị nhiễm đốm trắng với nhiều
mức độ gây chết khác nhau. Tôm càng xanh sau khi tiêm 20 ngày tỷ lệ chết 20%, nếu
cho ăn tỷ lệ này là 10%. Không có dấu hiệu lâm sàng hoặc chỉ nhìn thấy những chấm
nhỏ dưới kính hiển vi. Tôm sú bị nhiễm trong thí nghiệm có cùng triệu chứng lâm sàng
như tôm tự nhiên bị nhiễm (Rajendran và ctv, 1999).
Tôm bị nhiễm bệnh đốm trắng thường chết hàng loạt, bệnh này có khả năng gây
thành dịch trong vòng 2-7 ngày với tỷ lệ chết từ 20-70%. Nếu thu hoạch chậm tỷ lệ
chết sẽ lên đến 70 -100% trong vòng 3-7 ngày kể từ khi có dấu hiệu phát bệnh mạnh
(Wang và ctv, 1998). Bệnh này có tốc độ lây lan rất nhanh và nhiễm trên mọi giai đoạn
trong vòng đời của tôm sú đặc biệt nhạy cảm từ sau 1-2 tháng nuôi (Lightner, 1996)

2.2.2.5. Hình thái
Virion có dạng hình que đến elip hay hình trứng, một đầu bẹt (Vlak và ctv,
2002). Virion có kích thước lớn (80-120 x 250 – 380nm). Virion tinh sạch từ tôm sau
khi nhuộm cho thấy có một phần phụ giống như đuôi. (Woongteerasupaya và ctv,
1995; Wang, 1995).

Hình 2.4. Virus đốm trắng (Vlak và ctv, 2002)
(A) Ảnh hiển vi điện tử của hạt virus WSSV.
(B) Ảnh hiển vi điện tử của nucleocapsid.
2.2.2.6. Cấu trúc
Hạt virus cấu trúc bao gồm 3 phần: Bao màng (envelope), nucleocapsid và vật
chất di truyền.
13


Virion chứa 5 protein chính: VP28, VP26, VP24, VP19, VP15 (trọng lượng
phân tử là 28, 26, 24, 19 và 15 kDa). VP28 và VP19 kết hợp với phần envelope, còn
VP26, VP24, VP15 gắn với nucleocapsid của virion (van Hulten, 2002). VP24 – có 41
aminoacid tận cùng bằng đầu N – đã được phân tích sinh hóa và xác định gen mã hóa
(vp24) trên genome. Phân tích cho thấy VP24, VP26, VP28 rất giống nhau ở mức
aminoacid và nucleotide (van Hulten, 2000a).
Trong một phát hiện mới nhất, các nhà khoa học đã công bố một protein cấu
trúc khổng lồ của WSSV, protein VP664, có chức năng chưa rõ, có thể là tham gia vào
quá trình lắp ráp virion. Nhiều kháng huyết thanh đa dòng kháng protein này được tạo
ra và một trong số đó đã được ứng dụng thành công trong phân tích immunoelectron
microscopy để định vị protein này trên virion (Leu và ctv, 2005).

Hình 2.5. Protein của WSSV (Vlak và ctv, 2002).
(A) Điện di protein của WSSV đã được tinh sạch
1: Marker; 2: protein tinh sạch từ tôm sông (P. clarkii) không nhiễm WSSV; 3: WSSV

đã tinh sạch; 4: Nucleocapsid của WSSV
(B) Mô hình cấu trúc đơn giản của virion WSSV
2.2.2.7. Vật chất di truyền
WSSV là virus trên động vật không xương sống biển đầu tiên được giải mã
trình tự hoàn chỉnh (Yang và ctv, 2001). Genome của WSSV là DNA vòng kép lớn,
kích thước thay đổi tùy theo các mẫu phân lập khác nhau: 305107 bp (GenBank
Accession No. AF332093), 292967 bp (GenBank Accession No. AF369029) và
307287 bp (GenBank Accession No. AF440570) tuần tự ứng với virus phân lập từ
Trung Quốc, Thái Lan và Taipei China.
14



Hình 2.6. Sơ đồ genome của WSSV.(Yang và ctv, 2001)
Hình mũi tên (vòng ngoài): Vị trí của 181 ORFs (màu đỏ và màu xanh chỉ
hướng dịch mã khác nhau). Hình chữ nhật màu xanh lá chỉ 9 hrs. B: Vị trí cắt giới hạn
của enzyme BamHI (vòng trong, số trong ngoặc đơn chỉ vị trí)
Genome virus chứa 184 khung đọc mở (open reading frame – ORFs) (van
Hulten và ctv, 2001). Theo Yang và ctv (2001), genome WSSV có 9 vùng đồng dạng
chứa 47 tiểu phần lặp lại, gồm lặp trực tiếp (direct repeat), lặp đảo ngược không điển
hình (atypical inverted repeat), và những trình tự thuận nghịch không hoàn chỉnh. Tuy
WSSV tương tự như Baculovirus về hình thái nhưng hai loại virus này lại không liên
hệ đáng kể ở mức amino acid. Vài gen của WSSV lại giống với gen của eukaryote hơn
là với gen virus. Phân tích trình tự cho thấy WSSV khác với tất cả những virus đã biết
trước đây dù có một số gen tương đồng yếu với gen herpesvirus. Hầu hết các ORFs mã
hoá protein không tương đồng với bất cứ protein đã biết nào, cho thấy WSSV đại diện
cho một lớp virus mới hay một khoảng tiến hoá quan trọng giữa virus biển và virus
mặt đất. Điểm đặc biệt nhất của WSSV là sự hiện diện của một gen mã hoá colagen

15

nguyên vẹn, vốn là gen mã hoá một protein matrix ngoại bào của tế bào động vật chưa
bao giờ thấy trong bất cứ virus nào.
Gần đây, các nhà khoa học đã phát hiện genome của WSSV có một ORF khổng
lồ chứa 18.234 nucleotide mã hóa một polypeptide gồm 6.077 aminoacid với chức
năng chưa biết. Polypeptide này được gọi là protein VP664 và thuộc nhóm protein cấu
trúc của virus (Leu và ctv, 2005).
2.2.2.8. Đa dạng di truyền
Theo Marks và ctv (2003) cho đến nay virus WSSV phân lập từ tôm penaeids ở
các vùng địa lý khác nhau thì rất giống nhau về hình thái và proteome, chỉ khác nhau
một chút trong sự đa hình về độ dài đoạn giới hạn (restriction fragment length
polymorphism - RFLP) chủ yếu do có nhiều đoạn chèn nhỏ (insertions) và một đoạn
loại bỏ (deletion) lớn (khoảng 12 kbp) (Chen và ctv, 2002). Mark và ctv (2003) đã xác
định được trên bản đồ di truyền những khác biệt giữa ba dòng WSSV: Dòng Thái Lan
(WSSV – TH), dòng Trung Quốc (WSSV – CN) và dòng Đài Loan (WSSV – TW).
Các dòng virus này có nucleotide tổng số giống nhau đến 99,32%. Sự khác biệt chủ
yếu là trên cùng một vùng gen tương ứng của 3 dòng có sự loại bỏ khoảng 13 kb ở
dòng WSSV – TH, 1 kb ở dòng WSSV – CN và không có gì thay đổi ở dòng WSSV –
TW. Sự khác biệt thứ hai liên quan đến một vùng biến đổi di truyền khoảng 750 bp.
Tất cả những sai biệt khác > 2 bp giữa 3 dòng đều nằm ở những vùng lặp lại dọc theo
genome, chủ yếu ở những ORFs (trừ vùng đồng dạng hr1, hr3, hr8 và hr9).
Theo Dieu và ctv (2004), sự khác biệt nói trên đã đưa đến một giả thuyết là đã
có một sự phân nhánh virus từ một dòng tổ tiên bắt nguồn từ eo biển Đài Loan đến
Thái Lan nhưng cần tiến hành thêm nhiều phân tích khác biệt giữa nhiều dòng ở các
vùng địa lý khác nữa mới khẳng định được giả thuyết. Các nhà khoa học này đã phân
tích RFLP tám dòng WSSV Việt Nam (VN), trong đó có 6 dòng thu từ bờ biển miền
Trung và 2 dòng từ bờ biển miền Nam và cho thấy sự khác biệt trình tự ở các vị trí
biến đổi đã được đề cập. Những vị trí này được phân tích chi tiết bằng PCR, tạo dòng
và đọc trình tự. Tương ứng với dòng WSSV-TW, tất cả những dòng từ miền Trung

đều mất 85 kb ở vùng biến đổi chính ORF23/24, trong khi đó những dòng từ miền
Nam thì lại mất 115 hay 122 kb tương tự như sự loại bỏ 12 hay 132 kb ở WSSV-CN