Luận văn : KHẢO SÁT HỆ VI KHUẨN Methylobacterium sp. TRÊN LÚA (Oryza sativa L.) Ở TÂY NINH part 2 doc

16
syringae là một ví dụ cụ thể cho trường hợp trên và chúng có thể gây bệnh cho nhiều
loài thực vật khác nhau [9], [38].
Ngoài ra, có nhiều vi sinh vật gây bệnh khác cũng đã được ghi nhận trên
nhiều loài thực vật khác nhau như: nấm Phytophthora, Xanthomonas,…[82]. Tuy
nhiên, bên cạnh các vi sinh vật có hại cũng tồn tại nhiều vi sinh vật có lợi cho thực vật.
Cơ chế tạo ra ảnh hưởng có lợi của vi sinh vật lên thực vật rất đa dạng. Trong trường
hợp của vi khuẩn sống ở rễ chúng có thể biến dưỡng nitrogen từ khí quyển thành
nitrate, ammonia, tạo các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cho thực vật, tổng
hợp các phytohormone, hay tổng hợp các chất trung gian để cô lập các chất khoáng
cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh, làm cho vi sinh vật gây bệnh không thể sử dụng
được các chất khoáng này hay tổng hợp các chất kháng vi sinh vật gây bệnh cho thực
vật như các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân vách tế bào, các hydrogen cyanide
để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh hay kích thích tạo tính kháng bệnh của
thực vật [19], [33], [50], [74]. Trong đó, nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều
thực vật, trên nhiều cơ quan khác nhau và chúng là nấm có lợi, không những chúng có
khả năng gia tăng tăng trưởng, gia tăng năng suất mà còn gia tăng khả năng kháng
bệnh của cây đối với các bệnh gây hại do Fusarium, Alternaria, Cochliobolus
heterostrophus, Rhizoctonia solani,… [17], [35], [44], [56]. Trong mối quan hệ đó, sự
cộng sinh giữa cây họ đậu và vi khuẩn đất được cho là nhân tố quan trọng cho môi
trường và trong nông nghiệp đã được nghiên cứu từ rất sớm. Vi khuẩn rễ có thể tìm
thấy trong hầu hết 18.000 loài của họ đậu Leguminosae (thực vật hai lá mầm), ở rễ cây
mía (thực vật một lá mầm) và nhiều loài thực vật khác [9], [70], [87], [97].
Cơ chế ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật bởi vi sinh vật trong điều kiện
in vitro cũng đã được nghiên cứu và chứng minh. Một số vi sinh vật có khả năng kích
thích sự phát triển hình thái và tăng trưởng của thực vật. Vi khuẩn Methanotrophic là
một ví dụ điển hình, có khả năng kích thích sự hình thành callus (mô sẹo) của hạt lúa
mì và gia tăng khả năng tạo rễ trong môi trường nuôi cấy, vì vậy làm cho tỷ lệ tái sinh
cây cũng đạt hiệu quả và rút ngắn được thời gian. Sự gia tăng khả năng tạo callus (mô

sẹo) và tạo rễ cũng được ghi nhận khi thí nghiệm đối với phôi hạt bắp [47], [48].
Từ những cơ sở trên, có thể khẳng định rằng, sự tương tác giữa vi sinh vật với
thực vật không những chỉ là mối quan hệ gây hại cho nhau mà đôi khi quan hệ này lại


17
tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo cũng như
trong điều kiện in vitro.
2.3.2. Sự tƣơng tác giữa Methylobacterium với thực vật.
Vi khuẩn PPFM (pink-pigmented facultative methylotrophic) là nhóm vi
khuẩn đặc trưng thuộc chi Methylobacterium được phân lập ở hơn 100 loài thực vật từ
rêu, địa y, thực vật hạt trần và thực vật hạt kín. Methylobacterium sp. là loài tồn tại lâu
dài và chiếm tỷ lệ lớn nhất trên bề mặt lá được rửa sạch. Holland và ctv (1994), cho
rằng việc khử trùng thông thường trong việc chuẩn bị mẫu cho nuôi cấy mô không loại
được vi khuẩn Methylobacterium. Đây là nhóm vi khuẩn phong phú và phổ biến trên
thực vật, phân bố chủ yếu ở lá, đặt biệt ở lá non. Ngoài ra, Methylobacterium còn sống
ở rễ và hạt. Mật độ của PPFM trong khoảng 10
4
– 10
7
cfu (colony forming unit) trên
mỗi gram trong lượng tươi của mô thực vật và ở hạt đậu nành khô thì mật độ khoảng
10
5
cfu/gram [40], [59], [60].
Mặc dù vi khuẩn PPFM tăng trưởng rất chậm so với các chủng vi khuẩn khác
trên bề mặt lá, nhưng chúng vẫn có khả năng tồn tại với số lượng lớn và có khả năng
tạo khuẩn lạc là do chúng sử dụng nguồn dinh dưỡng khác thường – methanol (chỉ
thích hợp với một số vi khuẩn). Methanol thường được tạo ra trong quá trình phân hủy
pectin từ mô, đặc biệt là ở mô đang hoạt động sinh trưởng [55], [71], [72].

Mối quan hệ giữa vi khuẩn PPFM với thực vật không phải là mối quan hệ một
chiều, mà cùng với việc hấp thu các chất tiết ra thực vật thì vi khuẩn PPFM có thể tổng
hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của
thực vật. Chủng PPFM đầu tiên được phân lập bởi Basile và ctv (1969), có khả năng
kích thích sinh trưởng của cây địa tiền (liverwort, Scapania nemorosa) trong môi
trường nuôi cấy in vitro. Sau đó, Corpe và Basile (1982), chứng minh rằng PPFM gia
tăng khả năng tạo callus (mô sẹo), gia tăng khả năng tái sinh cây từ mô cây anh thảo
(cây báo xuân) Streptocarpus prolixus. Corpe và Basile (1982), cũng chứng minh được
rằng vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp vitamine B
12
(cyanocobalamine) và kích
thích sinh trưởng, phát triển của cây rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata
[39], [40], [51], [84].
Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được rằng, vi khuẩn PPFM
có khả năng tương tác với cây đậu nành trong việc chuyển hóa nicken, PPFM có khả
năng gia tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt, cũng như gia tăng năng suất cây đậu nành. Khả


18
năng kích thích tăng trưởng, gia tăng năng suất của thực vật khi xử lý PPFM trên lá
cũng được ghi nhận trên cây bông (Gossypium hirsutum L.) và cây mía (Saccharum
officinarum L.). Trong nghiên cứu của Maliti (2000), thì một số chủng PPFM có khả
năng gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) từ phôi hạt lúa, trong khi một số chủng
khác lại có khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển của các cơ quan như lá, rễ,
thân lúa. Nhưng một số chủng khác lại ức chế phát triển của rễ lúa. Trong nghiên cứu
của Madhaiyan và ctv (2005), đã chỉ ra rằng tất cả các chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. trong nghiên cứu có khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt
lúa, kích thích tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ tạo nhánh, gia tăng khả năng kháng bệnh và
giảm tỷ lệ cây bệnh với Rhizoctonia solani, cũng như góp phần làm gia tăng năng suất
lúa (hơn 55,44g/ lỗ) [40], [59], [60], [61].

2.3.3. Sự tạo các hoạt chất thứ cấp bởi Methylobacterium có lợi cho thực vật
Mặc dù có nhiều nghiên cứu chứng minh khả năng kích thích sinh trưởng của
PPFM lên thực vật. Tuy nhiên, cơ chế của khả năng kích thích này chưa được hiểu rõ
và thống nhất vẫn còn có nhiều giả thuyết khác nhau đó là:
- Sự cô lập, chuyển hóa các khoáng dinh dưỡng (bao gồm khoáng vi hay đa
lượng) từ môi trường hoặc từ đất cho cây. Cơ chế cô lập các khoáng dinh dưỡng
liên quan đến sự tổng hợp các phân tử có lợi cho quá trình hấp thu những ion.
Cơ chế này đã được chỉ ra ở vi khuẩn rễ ở một số thực vật [46], [61], [93].
- Sự tổng hợp các phytohormone hay các hợp chất tương tự phyohormone được
phóng thích vào môi trường hay vào hệ thống mạch của thực vật. Cơ chế này
bao gồm sự tổng hợp cytokinin, auxin và hợp chất tương tự auxin bởi một vài
chủng PPFM [24], [39], [40], [55], [71], [72].
- Sự tổng hợp và giải phóng các enzyme tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình
sinh hóa hay sinh lý của mô thực vật. Sự tổng hợp enzyme urease bởi vi sinh
vật đã được chỉ ra ở nhiều chủng PPFM. Urease rất cần thiết trong quá trình
biến dưỡng nitrogen ở thực vật [40], [61].
- Cơ chế thứ tư góp phần gia tăng sự tăng trưởng của cây lúa nói riêng và các cây
trồng khác nói chung có thể là do sự tổng hợp và phóng thích vitamine B
12
hoặc
những hợp chất tương tự. Nghiên cứu của Basile và ctv (1985), đã chứng minh
rằng việc bổ sung vitamine B
12
nồng độ thấp có thể gia tăng sự tăng trưởng của
hai loài địa tiền - liverwort in vitro [61], [84].


19
Khả năng tổng hợp các phytohormone không chỉ hiện diện ở thực vật mà
còn diễn ra ở cả vi sinh vật. Khả năng tổng hợp các phytohormone đã được xác

định ở nhiều vi sinh vật. Những vi khuẩn sống trong đất và vi khuẩn quan hệ với
thực vật có khả năng tổng hợp phytohormone bao gồm vi khuẩn gram âm, gram
dương, vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn biến dưỡng
nitrogen. Nhiều loài vi khuẩn trong nhóm này có thể tổng hợp và tiết vào môi
trường nuôi cấy nhiều hơn một hormone. Chủng Rhizobium có thể tổng hợp
gibberellins (GA) và auxin, Azotobacter spp. có thể tổng hợp GA, auxin và
cytokinins, Acetobacter và Herbaspirillum có thể tổng hợp IAA và GA. Nên chúng
có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo
cũng như in vitro [24], [71].
Sự tổng hợp IAA của một số PPFM cũng đã được ghi nhân. Sự tạo indole
và dẫn xuất của chúng từ L- tryptophan là môt đặc trưng phân biệt của những vi
khuẩn gram âm hiếu khí. Trong nghiên cứu của Ivanova và ctv (2001), bằng cách sử
dụng những thuốc thử Salkowski và Van Urk đã chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria
là Methylobacterium mesophilicum, Aminobacter aminovorans, Methylovorus mays
và Paracoccus kondratievae có thể tạo IAA. Trong nghiên cứu của Omer và ctv
(2004), chứng minh rằng vi khuẩn hiếu khí Methylobacteria có thể tổng hợp auxin
(chủ yếu là IAA) từ L-tryptophan ngoại bào. PPFM cũng có thể tổng hợp lượng nhỏ
IAA trong môi trường với peptone là nguồn cacbon và nitrogen. Trong nghiên cứu
khác của Omer và ctv (2004), chỉ ra rằng ba trong số 16 chủng PPFM được kiểm tra
trong môi trường nuôi cấy lỏng có thể tổng hợp IAA. Ba chủng tạo IAA đã tích lũy
phytohormone với khối lượng biến thiên trong khoảng 6 – 13,3mg/l trong môi
trường bổ sung L-tryptophan và 1,1 – 2,4mg/l khi không bổ sung L-tryptophan vào
môi trường nuôi cấy, đến 12 ngày sau thì hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường có
bổ sung L-tryptophan cao gấp 6 lần so với nuôi cấy không có L-tryptophan [24],
[26], [71].
Cytokinins được tạo ra bởi vi khuẩn bằng ít nhất hai con đường. Con đường đầu
tiên là tổng hợp de novo, là dạng chuyển đổi trực tiếp đồng phân (isopentenylation)
của AMP (adenine monophosphate) bởi enzyme dimethylallyl transferase (DMAT),
được ghi nhận đầu tiên ở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Con đường thứ hai của
quá trình tạo cytokinins bởi vi khuẩn là quá trình chuyển đổi của tRNA tương tự như

20
cơ chế hoạt động ở thực vật bậc cao. Sự tạo cytokinins bởi vi khuẩn PPFMs đã được
Koenig và ctv (2001), kiểm tra. Tất cả các chủng kiểm tra điều tạo được cytokinins ở
mức độ đủ đáp ứng và phát hiện được. Lượng cytokinins quan sát được là 15,2 và
19,6ng/mg. Bốn chủng Methylobacterium khác nhau hiện diện trên bề mặt lá và một
chủng của Methylobacterium extorquens đều có khả năng tạo cytokinin trans-zeatin
với mức độ thấp và tiết vào trong môi trường nuôi cấy [32], [33], [35], [39], [40], [57],
[58].
Trong những nghiên cứu về những hợp chất để tạo nên hương dâu tây (Fragaria
ananassa) cho thấy rằng vi khuẩn Methylobacterium cần thiết cho quá trình tổng hợp
tiền chất của 2,5-dimethyl-4-hydroxy-2Hfuran- 3-one (DMHF) và 2,5-dimethyl-4-
methoxy-2H-furan-3-one (mesifuran). Khi callus (mô sẹo) dâu tây đồng nuôi cấy với
vi khuẩn PPFM thì hàm lượng DMHF là 5g/860,5g mô tươi và 11g/357,97g ở
mesifuran, không gram ở mẫu đối chứng. Sự gia tăng hàm lượng của DMHF và
mesifuran là do vi khuẩn PPFM có khả năng oxy hóa 1,2-propanediol thành
lactaldehyde. Vì lactaldehyde được tạo ra từ vi khuẩn được sử dụng bởi những tế bào
dâu tây trong quá trình sinh tổng hợp hai furanones trên [100].
2.3.4. Các ứng dụng khác của vi khuẩn Methylobacterium
Ngoài khả năng tổng hợp các chất góp phần gia tăng khả năng tăng trưởng
của thực vật Methylobacterium sp. còn có khả năng tổng hợp nhựa sinh học PHB
(Poly- -Hydroxybutyrate). Khả năng này hiện diện ở nhiều vi sinh vật prokaryote
bao gồm cả vi khuẩn Methylotrophic có khả năng tích lũy PHB nội bào như một dạng
của nguồn cung cấp carbon và năng lượng. Hàm lượng PHB tạo ra phụ thuộc vào môi
trường nuôi cấy và con đường biến dưỡng của vi sinh vật. Vi khuẩn Methylotrophic
sử dụng chu trình serine để khử formaldehyde có thể tích lũy PHB khoảng 80% trọng
lượng khô. Trong khi đó, vi khuẩn Methylotrophic sử dụng chu trình Calvin-Benson-
Bassham để khử C1 có thể tích lũy PHB khoảng 20% trọng lượng khô. Và ở vi khuẩn
sử dụng methanol bắt buộc sử dụng chu trình ribulose monophosphate để khử hợp

chất C1 thì không có sự tích lũy PHB được phát hiện. Trong một nghiên cứu khác
của Ackermann và ctv (1994), lại cho thấy rằng, vi khuẩn Methylobacterium
rhodesianum có thể tổng hợp PHB trong điều kiện giới hạn dinh dưỡng. Trong
nghiên cứu này, ông chứng minh được rằng, khi vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện


21
giới hạn nitrogen thì có thể chúng tích lũy PHB lớn 2% trọng lượng thô của sinh khối
sau 20 giờ nuôi cấy, còn trong điều kiện bị giới hạn của phosphate thì sự tích lũy
PHB ít hơn và trong điều kiện giới hạn của nguồn cacbon thì PHB được tích lũy nhỏ
hơn 2% trọng lượng sinh khối khô của vi khuẩn sau 20 giờ nuôi cấy [10], [65].
Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các chất hữu cơ
khác nhau gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp các hợp chất có lợi cho
chính vi khuẩn cũng như có lợi cho đời sống của con người. Trong nghiên cứu của
Van Aken và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn PPFM cộng sinh được phân lập
từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34. Chủng vi
khuẩn thuần thuộc Methylobacterium sp. BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất
25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO
2
. Trong
khi đó, trong nghiên cứu của Fournier và ctv (2005), cho rằng chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. JS178 có khả năng phân hủy (sử dụng Nitramine 4-Nitro-2,4-
Diazabutanal – NDAB – là sản phẩm phân cắt của hợp chất RDX – hexahydro-1,3,5-
trinitro-1,3,5-triazine – là hợp chất độc giàu năng lượng) tạo ra khoáng nitramine
trong điều kiện hiếu khí. Methylotrophic đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái
do chúng có khả năng sử dụng methan-một loại khí gây hiệu ứng nhà kín. Ngoài ra,
vi khuẩn Methylobacterium cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô
nhiễm khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide,
dichloromethane, methyl tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa
ethylated sulfur, và cyanate và thiocyanate [28], [36], [88], [89].

Hình 2.4: Sự nhiễm của vi khuẩn Methylobacterium sp. trên cây dương Poplar
(P. deltoides _ nigra DN34) trong nuôi cấy mô [88].
Trong lĩnh vực thực phẩm vi khuẩn Methylobacterium cũng có thể góp phần
quan trọng và đầy tiềm năng bởi vì chúng vừa có khả năng sử dụng các nguồn


22
nguyên liệu rẻ tiền vừa có thể tạo ra các sản phẩm có gia trị như protein đơn bào, -
carotene, vitamine B
12
và nhiều sản phẩm có giá trị khác [27], [90]. Từ những cơ sở
này có thể kết luận rằng vi khuẩn PPFM có nhiều tiềm năng ứng dụng không chỉ
trong nông nghiệp mà còn trong lĩnh vực môi trường, thực phẩm,
Tuy nhiên, không phải tất cả các loài Methylobacterium đều có lợi mà một loài
Methylobacterium sp. mới phát hiện có khả năng gây bệnh cho con người như
Methylobacterium mesophilicum sống ở thực vật có khả năng gây dị ứng, sốt.
Methylobacterium podarium tồn tại trong miệng có thể gây bệnh hôi miệng và cũng
có thể gây bệnh hoa chân (foot flora) [11], [12], [83], [101].
2.4. Phƣơng pháp định danh vi sinh vật
2.4.1. Định danh vi sinh vật bằng phƣơng pháp truyền thống.
Là phương pháp phân loại dựa vào đặc điểm về hình thái, đặc diểm sinh lý,
đặc điểm biến dưỡng, và đặc điểm sinh thái. Phương pháp này được Ferdinad Cohn
thực hiện lần đầu tiên năm 1987. Mặc dù đây là phương pháp không chính xác nhưng
phương pháp này có vai trò quan trọng trong bước đầu nghiên cứu định danh vi sinh
vật.
- Đặc điểm hình thái bao gồm: hình dạng, kích thước tế bào, hình dạng màu sắc
khuẩn lạc, khả năng di động, …
- Đặc điểm sinh lý và biến dưỡng: là khả năng sử dụng các nguồn cacbon,
nitrogen, cách thức biến dưỡng năng lượng, mối quan hệ với oxy, pH, nhiệt độ
thích hợp,…

Để định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống thường phải dựa vào các
khóa phân loại (bảng sinh hoá). Khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, phổ biến
nhất, được sử dụng là khóa phân loại Bergey`s [4], [41], [77], [97].










23
Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn carbon của các loài thuộc chi
Methylobacterium [41]
Chất
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

14
15
16
17
18
19
20
21
Methylamine
+
+
+
+
+
+
+
–
–
+
–
+
+
+






-

Trimethylanine
–
–
–
+
–
–
–
–
–
+
–
–
–
–






+
Acetate
+
+
+
+
+
+
+

+
–
+
+
+
+
+






+
Citrate
–
–
–
–
–
–
+
+
+
–
+
+
+
+
+

+
+
+
–
+
+
Glutamate
–
–
+
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
+
+
Glucose
+

–
–
–
–
–
+
+
+
–
+
+
–
–
–
+
+
–
–
–
+
Arabinose
–
–
–
–
–
–
+
+
+

–
+
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
Fructose
+
+
–
+
+
+
+
–
–
+
–
+
–
+
+
+
+

–
+
–
+
Betaine
+
–
+
–
+
–
+
+
–
+
–
nd
+
+






+
Tartrate


v

–
–
V
–
–
–

v










Serbacate


–
–
–
–
–
+
v

+

+
Ethanol


+
+
+
+
+
V
+

v

+
nutrient agar


v
+
+
+
+
+
–

+









+
Methane


–
v
–

–
–
–
–

–










chú thích:
1: M.suomiense; 2: M. lusitanum; 3: M. extorquens; 4: M. organophilum; 5: M.
rhodesianum; 6: M. zatmanii; 7: M. rhodinum; 8: M. radiotolerans; 9: M.
mesophilicum; 10: M. aminovorans; 11: M. fujisawaense; 12:M. thiosyanatum; 13: M.
chloromethanicum; 14: M. dichloromethanicum;15: M. hispanium; 16: M. aquaticum;
17: M. variable; 18: M. isbiliense; 19: M. populi;20: M. nodulans. 21 :1019.
+:có sử dụng; -: không sử dụng; ND: không xác định ; v: biến đổi.
2.4.2. Định danh vi sinh vật bằng kỹ thuật sinh học phân tử (dựa vào vật liệu di
truyền)
2.4.2.1. Sơ lƣợc về kỹ thuật sinh học phân tử.
Kỹ thuật sinh học phân tử là thuật ngữ dùng để chỉ một nhóm gồm nhiều kỹ
thuật mà có chung đặc điểm là sử dụng các vật liệu nghiên cứu có tính chất phân tử
(vật liệu di truyền như: DNA, RNA, protein,
Là phương pháp hiện đại, đạt kết quả nhanh chóng, và hiệu quả cao. Tuy

nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị hiện đại.
+ Sử dụng mẫu dò (probes)
Mẫu dò là một trình tự acid nucleic được sử dụng để xác định sự hiện diện của
một trình tự nucleotid đặc trưng của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Mẫu dò là


24
một đoạn mạch đơn của acid nucleic thường là DNA được gắn với một nhân tố nhận
biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang.
+ Khuếch đại trình tự đặc trưng bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
[4], [67], [95].
Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các
đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K. Mullis đưa ra
năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Đây là phương pháp được thực hiện hoàn
toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA.
Nguyên tắc của phương pháp PCR
Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm với sự hiện diện của
enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA. Sự
khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng xảy ra nhờ
enzyme DNA-polymerase. DNA sẽ tách thành hai mạch và từ 2 mạch DNA thành 4
mạch DNA, 4 mạch DNA thành 8 mạch DNA và cứ như thế nhân lên đến vô cùng.
+ Giải trình tự (sequencing) [5].
Là kỹ thuật xác định tất cả các thành phần nucleotide tạo nên phân tử acid
nucleic chuyên biệt nào đó. Phương pháp giải trình tự đầu tiên do Maxam và Gilbert
(1977), Sanger và ctv (1977), công bố.
Một số phương pháp giải trình tự đang được sử dụng:
- Phương pháp Maxam và Gilbert
Phương pháp này dựa trên sự phân cắt hóa học tại vi trí đặc biệt của base tạo ra
một phân tử DNA có đầu được đánh dấu và hình thành nên một loạt các đoạn DNA có
đầu được đánh dấu bằng các loại base khác nhau.

- Phương pháp Sanger
Là phương pháp dùng một DNA polymerase để tổng hợp một bản sao có tính
chất bổ sung từ một dây nền của DNA
- Phương pháp giải mã bằng hệ thống tự động (phương pháp PCR trực tiếp)
Nguyên tắc dựa vào việc phát hiện tính hiệu huỳnh quang từ những dNTP
được đánh dấu.
2.4.2.2. Ứng dụng PCR và giải trình tự để định danh vi sinh vật.
Ribosome 70S của prokaryote đóng vai trò chính trong tổng hợp protein, được
cấu tạo từ protein và 3 loại phân tử rRNA (5S, 16S, 23S). Chúng đảm nhận chức năng


25
duy nhất ở tất cả các sinh vật, có nhiều bản sao trong tế bào, có tính bảo tồn cao nhưng
vẫn có những vùng trình tự ribonucleotide khác biệt giữa các loài và trình tự đặc trưng
cho từng nhóm sinh vật. Do vậy, rRNA được xem là thước đo tiến hóa ở sinh vật và
cũng là công cụ hữu ích cho phân loại và định danh vi sinh vật. Kỹ thuật này không
chỉ dựa vào rRNA mà còn dựa vào rDNA (trình tự mã hóa cho rRNA), vì DNA là vật
liệu di truyền dễ thu nhận và có tính bền cao hơn RNA. Trong các loại rRNA thì rRNA
16S thích hợp nhất cho mục tiêu phân loại vì kích thước nó vừa phải (khoảng 1500
ribonucleotide), một vài vùng trong rRNA 16S của tất cả các prokaryote có tính bảo
tồn cao, trong khi đó một số vùng khác lại có một số khác biệt.
Sau khi giải mã thì trình tự của đoạn rRNA đã biết được so sánh với các trình
tự rRNA của tất cả các sinh vật trên ngân hàng gen nhờ phần mềm BLAST, hay sử
dụng kết hợp các phần mềm để so sánh mức độ tương đồng của các trình tự. Từ những
cơ sở dữ liệu này, ta có thể vẽ được cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ tiến hóa
của các loài và vi trí của loài vi sinh vật cần định danh. Tuy nhiên, khi sử dụng trình tự
rDNA 16S để định danh cần chú ý:
- Kích thước rDNA phải đủ lớn (> 1300nu)
- Sự khác biệt giữa hai trình tự rDNA 16S của hai chủng vi sinh vật nhỏ hơn
0,5%.

Sau khi sử dụng các kiểm tra sinh lý, sinh hóa để định danh các loài thuộc chi
Methylobacterium thì việc sử dụng trình tự 16S rRNA để dịnh danh vi khuẩn
Methylobacterium là rất cần thiết vì các kiểm tra sinh lý, sinh hóa không thể đem lại
kết quả chính xác. Phương pháp PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA để phát hiện các
loài Methylobacterium đã được sử dụng rộng rãi bởi tính chính xác của nó. Ngoài ra,
trên ngân hàng gen của NCBI đã lưu trữ tất cả các trình tự gần như nguyên vẹn rDNA
16S (mã hóa cho 16S rRNA). Cho nên chỉ cần so sánh trình tự của chủng vi khuẩn cần
định danh với các trình tự có sẵn trên ngân hàng thì có thể định danh được loài vi sinh
vật mục tiêu [29], [30], [31], [68].







26
Phần III: Vật liệu và phƣơng pháp
3.1. Vật liệu
3.1.1. Mẫu thí nghiệm
 Mẫu lá, đất, nước được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở Tây Ninh
 Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 06/ 02/ 2006 đến ngày 18/ 06/ 2006.
 Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng
Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh.
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ
 Máy hấp vô trùng autolave
 Máy lắc tròn 100 vòng/phút
 Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zentrifugen)
 Máy điều nhiệt theo chu kỳ Techine

 Bộ điện di ngang Mupid-EX (Advance)
 Máy đo quang phổ RNA/DNA Gene Quantpro
 Kính hiển vi (Olympus)
 Eppendorf, Pippette,…
Và một số dụng cụ cơ bản của phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử, Vi Sinh.
3.1.3. Hóa chất
3.1.3.1. Môi trƣờng phân lập và làm thuần vi khuẩn Methylobacterium sp.[34].
Thành phần môi trường Methanol Mineral Salts (MMS):
- K
2
HPO
4
1,2g
- KH
2
PO
4
0,62g
- CaCl
2
.6H
2
O 0,05g
- MgSO
4
.7H
2
O 0,2g
- NaCl 0,1g
- FeCl

3
.6H
2
O 1mg
- (NH
4
)
2
SO
4
0,5 g
- CuSO
4
.5H
2
O 5 g
- MnSO
4
.5H
2
O 10 g
- Na
2
MoO
4
.2H
2
O 10 g

27
- H
3
BO
3
10 g
- ZnSO
4
.7H
2
O 70 g
- CoCl
2
.6H
2
O 5 g
- Nước cất vừa đủ 1000ml
- pH 7
Môi trường MMS được thanh trùng bằng cách hấp ở nhiệt độ 121
0
C trong 20 phút.
Sau đó, để nguội và bổ sung methanol vào với nồng độ 0,1 – 0,2%. Đối với môi
trường rắn thì bổ sung agar 20g/l trước khi hấp vô trùng. Không cần bổ sung vitamine
hay các nhân tố tăng trưởng bởi vì các chủng PPFM hầu như không cần thiết trong quá
trình tăng sinh. 3.1.3.2. Môi trƣờng giữ giống vi khuẩn Methylobacterium sp.
Thành phần môi trường Glycerol-Peptone Agar:[34].
- Agar 15g
- Glycerol 10g
- Peptone 10g
- Nước vất vừa đủ 1000ml

3.1.3.3. Môi trƣờng khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon
của vi khuẩn Methylobacterium sp. [4], [6], [34]
Môi trường khảo sát là môi trường MMS. Trong đó, methanol được thay thế
bằng 1% các chất cung cấp cung cấp nguồn cacbon.
3.1.3.4. Môi trƣờng nhân sinh khối vi khuẩn [4], [6].
Môi trường khoáng MS bổ sung 30g/l sucrose, 1mg/l glycine, 1mg/l B1,
100mg/l meso inositol, 2g/l cao thịt, 2g/l casein hydrolyase ký hiệu: CMS.
Môi trường cao thịt – peptone (CP) gồm 0,3% cao thịt, 1% peptone, 0,5%
NaCl, pH = 6,5.
3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS14GR.








28
3.2. Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm

Lấy mẫu

Tăng sinh vi khuẩn

Phân lập

Làm thuần

Xác định hình thái

Kiểm tra sinh lý, sinh hóa

Chiết tách DNA

Thực hiện PCR

Giải trình tự

Xử lý kết quả

Kết luận
3.2.1. Lấy mẫu
Mẫu được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở ba xã khác nhau:xã Truông Mít
(huyện Dương Minh Châu), xã Gia Lộc (huyện Trảng Bàng), xã Bàu Đồn (huyện Gò
Dầu) tỉnh Tây Ninh bao gồm các mẫu lá, nước, đất.
Giờ lấy mẫu : sáng từ 7 – 9 giờ.

3.2.2. Tăng sinh vi khuẩn
Đối với mẫu lá, dùng hai phương pháp là: Leaf print trực tiếp trên đĩa môi
trường, hoặc qua quá trình tăng sinh trên môi trường chọn lọc.


29
Sau khoảng 2 – 3 ngày lấy mẫu dùng pippet hút 100 l môi trường tăng sinh cho vào
môi trường rắn để tiến hành phân lập vi khuẩn
3.2.3. Phân lập vi khuẩn
- Đối với mẫu đất chúng tôi tiến hành pha loãng ở các nồng độ khác nhau từ 10
–1
,

10
–2
,… 10
– 6
. Sau đó từ mỗi nồng độ hút 100 l cho vào môi trường rắn.
- Đối với mẫu nước chúng tôi tiến hành phân lập trực tiếp không qua quá trình
tăng sinh, hút cho vào môi trường rắn mỗi đĩa là 40 l
- Đối với mẫu lá sau khi tăng sinh dùng pipet vô trùng hút 100 l cấy vào môi
trường rắn
- Sau khi cấy chuyển vào môi trường rắn đem tất cả các đĩa môi trường đã cấy vi
khuẩn nuôi ở nhiệt độ 30
0
C. Sau 2 – 4 ngày xem kết quả và chọn khuẩn lạc
hồng đặt trưng để làm thuần.
3.2.4. Làm thuần.
Khuẩn lạc thuần đóng vai trò quan trọng quyết định đến kết quả và độ chính xác
trong thử nghiệm sinh hóa cũng như các thử nghiệm khác. Do đó, để có khuẩn lạc
thuần phục vụ cho tiến trình thử nghiệm sinh hóa chúng tôi tiến chọn lọc khuẩn lạc có
màu hồng đặc trưng trên môi trường phân lập cấy ria trên đĩa môi trường mới nhiều
lần (3 – 4 lần), để tạo chủng thuần.
3.2.5. Giữ giống.
Để có chủng vi khuẩn tiến hành các nghiên cứu có liên quan nên chúng tôi dùng
vi khuẩn thuần cấy sang môi trường giữ giống GPA và bảo quản giống trong glycerol
50% trong điều kiện đông lạnh.
3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Được tiến hành với các thử nghiệm chủ yếu sau:
3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thƣớc tế bào [4], [6], [7]
Thử nghiệm Gram là thử nghiệm đầu tiên, đơn giản trong các thử nghiệm sinh hóa
nhưng thử nghiệm Gram có ý nghĩa quan trọng trong quá trình định danh vi sinh vật.
Để xác định Gram các chủng đã phân lập và làm thuần chúng tôi tiến hành theo hai

phương pháp:
+ Phương pháp String test - Thử nghiệm String [15]


30
Phương pháp này dựa vào khả năng tạo nhầy giữa sinh khối của vi khuẩn với
dung dịch KOH 3%. Dưới tác dụng của dung dịch kiềm loãng vách tế bào vi khuẩn
Gram âm bị phân hủy làm giải phóng DNA và tạo dịch nhầy khi phản ứng với KOH.
String dương (dương tính) khi giữa que cấy và dung dịch có sợi nhầy mảnh, tức là vi
khuẩn Gram âm, ngược lại khi String âm thì vi khuẩn là Gram dương.
+ Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên tắc:
Phương pháp nhuộm Gram dựa vào khả năng lưu giữ crystal violet của thành
tế bào các dòng vi khuẩn sau khi bị tẩy bằng cồn. Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn bắt
màu Gram dương gồm các thành phần peptidoglycan nhiều hơn ở thành tế bào vi
khuẩn bắt màu Gram âm, ngược lại thành phần lipid của chúng lại thấp hơn. Iod được
thêm vào như một chất cắn màu để tạo thành hợp chất crystal violet-iodine bền với
cồn. Giai đoạn này là giai đoạn cố định màu. Ở giai đoạn rửa cồn, lớp chất béo ở vi
khuẩn gram âm bị cồn hòa tan dẫn đến chất nhuộm ban đầu bị hòa tan vào dung môi.
Ngược lại, ở vi khuẩn gram dương chất nhuộm ban đầu bao bọc thành tế bào thành lớp
dày và hợp chất violet-iodine không bị phai ra môi trường xung quanh. Do đó, vi
khuẩn gram dương vẫn giữ được màu nhuộm ban đầu.
Vi khuẩn gram âm sau khi nhuộm có màu hồng đỏ còn vi khuẩn gram dương có màu
tím.
Tiến hành:
- Cho sinh khối vi khuẩn lên lam kính sạch để khô tự nhiên.
- Hơ mặt dưới của lam trên ngọn lửa 2 – 3 lần (tránh để tiêu bản quá nóng).
- Phủ dung dịch Crystal violet lên lam kính trong một phút.
- Đổ bỏ dịch Crystal violet và rửa bằng nước cất.
- Phủ dung dịch lugol để một phút sau đó đổ bỏ lugol và rửa nhẹ bằng nước.

- Tẩy màu bằng cồn trong khoảng 10 – 15 giây.
- Rửa lại bằng nước.
- Phủ dịch fuschin lên lam kính trong khoảng 30 giây. Đổ bỏ fuschin và rửa bằng
nước.
- Dùng giấy thấm để thấm hay để khô tự nhiên.
- Xem kết quả dưới kính hiển vi độ phóng đại của vật kính 100X với một giọt
dầu


31
 Các chủng vi khuẩn trong thí nghịêm được thử nghiệm sau 2, 4, 6, 8 ngày nuôi
cấy trên môi trường CMS.
+ Đo kích thước tế bào
Sau khi nhuộm gram, quan sát dưới khính hiển vi độ phóng đại vật kính 100X và đo
kích thước tế bào.
3.2.6.2. Mối quan hệ với oxi
Được tiến hành qua thử nghiệm catalase và hoạt tính oxidase trong bộ thử
nghiệm IDS14GR.
+ Thử nghiệm catalase
Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi khuẩn.
Phương pháp thử:
- Thử trên lam: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một
giọt H
2
O
2
30% lên vi sinh vật trên lam.
- Thử trong ống nghiệm: Nhỏ trực tiếp 1ml H
2
O

2
30% lên dòng thuần vi sinh vật
cấy dày đặt trên mặt thạch nghiêng.
Kết quả: Thử nghiệm dương tính khi có bóng khí xuất hiện, âm tính khi không
có bóng khí.
+ Thử nghiệm oxidase:
Nguyên tắc: nhằm xác định hoạt tính cytochrome oxidase trong các loài sinh
vật hiếu khí hay hiếu khí tùy ý.
Phương pháp: dàn điều sinh khối vi khuẩn lên đĩa giấy có tẩm dung dịch
tetramethyl-p-phenylenediamine dihydrochloride (TMPD) quan sát sự xuất hiện
màu xanh dương trong khoảng một phút.
3.2.6.3. Khảo sát khả năng di động
Khả năng di động của vi khuẩn được ghi nhận khi thử nghiệm cấy vi khuẩn
trong thạch mềm. Nếu vi khuẩn chỉ phát triển xung quanh đường cấy thì vi khuẩn
không di động nếu vi khuẩn mọc lan rộng khỏi đường cấy thì vi khuẩn có khả năng di
động.
Môi trường thử nghiệm là môi trường thạch mềm LDC (trong IDS14GR)
3.2.6.4. Thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn cacbon của vi khuẩn.
Nguyên tắc: Trong quá trình biến dưỡng vi khuẩn sử dụng các nguồn cacbon
để tăng trưởng, đồng thời tiết ra các chất làm thay đổi pH môi trường. Do đó, khi sử


32
dụng chất chỉ thị pH là bromothymol blue thì khả năng sử dụng các nguồn cacbon của
vi khuẩn được ghi nhận bằng sự thay đổi màu của môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Ở pH
trung tính thì màu môi trường là xanh lá cây, acid là màu vàng và màu xanh dương khi
pH kiềm. Phản ứng dương khi màu môi trường thay đổi so với màu môi trường đối
chứng âm (màu xanh lá cây, không cấy vi khuẩn).
Mục đích: Nhằm sàng lọc và xác định các nhóm khuẩn lạc đã phân lập theo
các đặc tính sinh hóa, tạo tiền đề thuận lợi cho các thử nghiệm định danh sau này nên

chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của các khuẩn lạc
thuần phân lập được.
Vật liệu: Các khuẩn lạc thuần đã phân lập.
Tiến hành: Pha môi trường MMS hấp vô trùng, sau đó bổ sung 1% chất cung
cấp nguồn cacbon và chất chỉ thị pH 2ml/l vào môi trường điều chỉnh pH môi trường ở
7 2 bằng KOH 1N và HCl 1N. Sau đó cho môi trường vào các lổ của microplate
1ml/lỗ, cấy vi khuẩn vào các lỗ ngoài trừ lỗ đối chứng.
Các chất cung cấp nguồn cacbon đã thử nghiệm: L-arabinose, fructose, ethanol, L-
glutamate, acetate, methylamine, trimethylamine, serbacate, D-glocose, sucrose,
manitol, maltose, betaine, citrate, lactose và môi trường nutrient agar tổng hợp (Merk).
3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR.
Để có thể định danh chính xác hơn các dòng vi khuẩn đã phân lập và thử
nghiệm ở trên, nên chúng tôi tiếp tục khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác
bằng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm IDS 14GNR của công ty
Nam Khoa.
Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR bao gồm:
+ Khả năng lên men glucose (MR)
Nhằm kiểm tra khả năng của vi sinh vật lên men glucose tạo các sản phẩm
cuối mang tính acid và vượt qua khả năng ổn định pH của môi trường. Đây là phép thử
định tính về khả năng sinh acid (xác định pH) do một số vi sinh vật sinh acid nhiều
hơn các vi sinh vật khác.
+ Khả năng khử nitrate
Xác định sự hiện diện của enzyme nitratreductase ở vi sinh vật, và chúng có
khả năng sử dụng nitrate làm nguồn thức ăn nitơ. Ngoài ra, một số vi sinh vật có khả


33
năng sử dụng nitrate làm chất nhận electron hay H
+
trong hô hấp kị khí để oxy hóa các

hợp chất hữu cơ
NO
3
-
+ 2e
-
+ 2H
+
 NO
2
-
+ H
2
O.
+ Khả năng sinh tổng hợp galactosidase (thử nghiệm ONPG, o-nitrophenyl-β -D-
galactopyranoside)
Nhằm xác định sự có mặt của enzyme β-galactosidase có ở vi sinh vật nhờ sự
hiện diện của cơ chất ONPG. Khi vi khuẩn có enzyme này thì nó sẽ phân cắt ONPG
làm giải phóng nitrophenyl làm môi trường xuất hiện màu vàng.
Mục đích: Phân biệt vi khuẩn có khả năng sử dụng lactose.
+ Khả năng tạo urease
Xác định khả năng của vi sinh vật phân giải urea tạo ra hai phân tử ammonia
do tác dụng của enzyme urease làm kiềm hóa môi trường
+ Khả năng tạo phenylalanine deaminase (PAD)
Nhằm xác định sự hiện diện của enzyme PDA ở vi khuẩn và khử nhóm amine
của phenylalanine.
+ Khả năng sử dụng citrate
Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sử dụng citrate như nguồn cacbon duy
nhất cho hoạt động trao đổi chất và làm kiềm hóa môi trường.
+ Khả năng thủy giải Esculin

Nhằm xác định khả năng thủy phân glycoside esculin thành glucose và
esculetin của một số vi khuẩn, trong điều kiện có sự hiện diện của 40% muối mật.
+ Khả năng sinh H
2
S
Xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng sinh H
2
S từ các acid amin chứa
lưu huỳnh tạo chất tủa màu đen.
+ Thử nghiệm Voges – Proskauer
Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo sản phẩm cuối cùng
mang tính trung tính là acetoin (acetylmethylcarbinol – AMC) do lên men glucose.
+ LDC (lysin decarboxylase)
Mục đích: Phát hiện vi khuẩn có khả năng phân giải lysin trong môi trường
bằng cách khử nhóm carboxyl nhờ enzyme lysin decarboxylase.
+ Khả năng sử dụng malonate


34
Nhằm khảo sát khả năng của vi khuẩn sử dụng sodium malonate làm nguồn
cacbon. Khi vi khuẩn sử dụng malonate sẽ sinh ra phản ứng kiềm, và làm biến đổi màu
môi trường.
+ Khả năng sinh indole
Mục đích: Khảo sát khả năng thủy giải tryptophan trong môi trường tạo nhân
indole
Tất cả các hóa chất của phản ứng sinh hóa được tẩm trong các đĩa giấy, sau đó
cho vào các giếng được đánh số. Khi sử dụng lấy sinh khối vi khuẩn trên môi trường
thạch, huyền phù vào nước muối sinh lý, sau đó cho 200μl dịch huyền phù này cho
vào mỗi giếng ủ 36 giờ và đọc kết quả theo bảng sau:
Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hoá IDS14GNR.

Stt
Phản ứng sinh hóa
Thuốc thử
Dương tính
Âm tính
1
Lên men glucose
Không
vàng
Tím
2
Khử nitrate
1 giấy tìm nitrate
đỏ
Vàng lợt
3
Galactosidase
Không
Vàng
không màu
4
Urease
Không
đỏ cánh sen
Đỏ nhạt/vàng
5
PDA
1 giọt FeCl
3

xanh lá đậm
Vàng lợt
6
Citrate
Không
xanh biển
Xanh lá/vàng
7
Esculin
Không
Đen
Không
8
Sinh H
2
S
Không
Đen
Không
9
Sinh indole
Kovac
Chuyển màu
đỏ
Không đổi màu
10
Voges – Poskauer
1 giọt KOH, 1 giọt
naphthol
Đỏ

Vàng nhạt
11
Sử dụng malonate
Không
Xanh biển
Vàng/ xanh lá
12
LDC
Không
Tím
Vàng

3.2.6.6. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH
Bao gồm các thí nghiệm:
+ Xác định đường tương quan tuyến tính giữa OD và mật độ tế bào [3], [6], [7]
Vi khuẩn nuôi cấy sau 48 giờ sau đó pha loãng thành các độ đục khác nhau có
OD lân cận 0,1, 0,2; 0,4; 0,5.


35
Từ các độ đục tiến hành pha loãng đến 10
-5
; 10
-6
; 10
-7
. Từ mỗi độ pha loãng cấy
0,1ml vào mỗi đĩa môi trường rắn CP. Ủ 30
0
C trong 48 giờ đếm khuẩn lạc ở các

đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 20 – 300.
Tính số lượng tế bào trên ml mẫu bằng công thức: N
di
= A x 10 x di. Trong đó:
- N
di
: số lượng tế bào ở độ pha loãng di
- A: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa.
- d: số lần pha loãng i.
Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD và log(N/ml) bằng phần mềm
excel.
+ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi khuẩn
Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sử phát triển của các chủng
đã phân lập phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này.
Vật liệu: Bốn chủng vi khuẩn đã phân nhóm ở những thí nghiệm trên được
nuôi cấy trên môi trường cao-pep lỏng ở 20, 25, 30, 35, và 40
0
C và đo OD ở
bước sóng 610nm sau ba ngày.
+ Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn
Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của các
chủng phân lập được để làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng sau này.
Tiến hành:
Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi trường cao thịt-peptone lỏng với
các khoảng pH từ 4,0 – 8,5 (cách nhau 0,5). Nuôi cấy lắc 100vòng/phút, sau ba ngày
ghi nhận độ đục OD
610nm
.
3.2.6.7. Xác định đƣờng cong tăng trƣởng của vi khuẩn
Nhằm xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối và các hoạt chất do vi

khuẩn tiết ra.
Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy lắc ở 25
0
C trong môi trường CMS và tiến
hành đo OD
610nm
4 giờ/lần trong vòng 48 giờ.
3.3. Định danh vi khuẩn
Mục tiêu này được thực hiện bằng các thí nghiệm sau:
3.3.1. Tính hệ số tƣơng đồng di truyền
Hệ số tương đồng di truyền Jaccard (Sj) cho phép xác định mức độ giống nhau
của hai loài vi khuẩn. Vì vậy, để xác định mối quan hệ họ hàng của các chủng


36
LM2, TS7, TN10 và TD15 với các loài Methylobacterium sp. đã được công bố thì
việc tính toán hệ số di truyền Jaccard là cần thiết.
Hệ số di truyền Jaccard được tình theo công thức sau:
Sj = a/(a +b). Trong đó:
a: tổng số các đặc điểm tương đồng của hai loài sinh vật
b: tổng số các đặc điểm khác biệt giữa hai loài sinh vật.
Hệ số Sj thay đổi trong khoảng từ 0 – 1 (0% - 100%). Nếu hai loài sinh vật có hệ số
Sj lớn hơn 0,8 (80%) thì chúng có khả năng cùng một loài.
3.3.2. Ly trích DNA vi khuẩn
Quy trình ly trích DNA bộ gen của các chủng Methylobacterium sp. theo quy
trình của Rogers S.O. và ctv (1994), quy trình CTAB [78]. Bao gồm các bước sau:
 Ly tâm thu sinh khối.
 Bổ sung 600 l CATB nóng, vortex, ủ 65
0
C trong 60 phút.

 Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút  thu dịch nổi.
 Biến tính bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform (1:1).
 Ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút  thu dịch nổi.
 Biến tính lần hai bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform, lắc nhẹ.
 Tủa DNA bằng 1ml cồn tuyệt đối lạnh, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4
0
C
 thu tủa.
 Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút ở 4
0
C để thu tủa DNA.
 Rửa tủa bằng 250 l cồn 70
0
.
 Phơi mẫu cho khô cồn.
 Hòa tan tủa trong 20 l dung dịch TE 0,1X.
 Bổ sung 20 l dung dịch RNase (1mg/ml), ủ 37
0
trong 60 phút.
 Giữ ở 4
0
C
Sản phẩm DNA bộ gen đã ly trích được đánh giá tính nguyên vẹn khi điện di trên gel
agarose 1% và độ tinh sạch được đánh giá thông qua tỷ số OD
260nm
/OD
280nm
.
Sản phẩm DNA bộ gen ly trích bao gồm bốn chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã
phân nhóm và DNA chủng đối chứng là vi khuẩn E.coli.

37
3.3.3. Tiến hành phản ứng PCR.
3.3.3.1. Thành phần cho một phản ứng PCR.
 Buffer 10X 2,5 l
 Mg
++
25mM 1,5 l
 dNTP 2mM 2,5 l
 Mồi xuôi (FPGS6 hay 2F) 10pmol/ l 1 l
 Mồi ngược (FPGS1509 hay 2R) 10pmol/ l 1 l
 DNA khuôn 0,5 l
 Taq polymerase 1U/ l 0,5 l
 Nước vừa đủ 25 l
3.3.3.2. Các primer sử dụng [9], [68]
FPGS1509: 5` AAGGAGGGGATCCAGCCGCA 3`.
FPGS6: 5` GGAGAGTTAGATCTTGGCTCAG 3`
2F: 5` GATCGGCCCGCGTCTGATTAG 3`.
2R: 5` CCGTCATTATCGTCCCGGACA 3`.
Hình 3.1: Vị trí bắt cặp của các mồi trên vùng 16S rDNA.
Để định danh các chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã phân lập được
chúng tôi tiến hành các phản ứng như sau:
- Định tính vi khuẩn thuộc chi Methylobacterium bằng phản ứng PCR với cặp
mồi 2R và 2F với sản phẩm tạo ra là đoạn DNA có kích thước khoảng 234bp.
Với chu trình nhiệt như sau:


38

Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với mồi 2F với 2R.
- Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của vi khuẩn Methylobacterium
phân lập được bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 và phối hợp sử dụng chung
cặp mồi 2R và 2F. Với kích thước đoạn DNA tạo ra là khoảng 500base và
1200base. Với chu trình nhiệt như sau:

Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và
FPGS1509 với 2F
3.3.3.3. Điện di và xem kết quả.
Sản phẩm sau khi khuếch đại bằng PCR được điện di trên gel agarose 2% ở
điện thế 50V trong 40 phút.
Sản phẩm điện di được ghi nhận bằng cách nhuộm ethidiumbromide và chiếu
dưới đèn UV(ultra-violet).
3.3.4. Giải trình tự.
Nhằm định danh chính xác và chi tiết hơn các chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. đã phân lập được, nên chúng tôi tiến hành giải trình tự để so
sánh với trình tự trên ngân hàng gen của NCBI (Mỹ).
Trình tự DNA của sản phẩm PCR của vi khuẩn được đọc bằng phương pháp
PCR trực tiếp tại Hàn Quốc.
Trình tự DNA được đọc theo hai chiều xuôi và ngược.


39
Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn có kích thước khoảng 500base và 1200
base được pha loãng với nước cất khử ion sau đó tiến hành phản ứng PCR cho mẫu
pha loãng này nếu kết quả dương tính thì gởi mẫu pha loãng này để giải trình tự.
3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự.
Kết quả giải trình tự được xử lý độ chính xác bằng phần mềm fastPCR, so sánh
với trình tự trên ngân hàng gen bằng phần mềm BLAST, so sánh độ tương đồng của
trình tự của các chủng so với các chủng đã công bố bằng phần mềm CluxtalX và dựng

cây sinh loài bằng phần mềm Treeview.
3.4. Khảo sát khả năng tổng hợp các hợp chất thử cấp của vi khuẩn
Theo các nghiên cứu của các tác giả trước cho rằng các loài Methylobacterium
sp. có khả năng tổng hợp một số hợp chất có lợi nên chúng tôi tiến hành thử nghiệm
khả năng sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp của vi khuẩn đã định danh. Mục tiêu này
được tiến hành qua các thí nghiệm:
3.4.1. Định tính khả năng sinh tổng hợp auxin [16].
Mục tiêu: Sàn lọc các chủng có khả năng tổng hợp auxin để có thể ứng dụng
chúng trong nuôi cấy in vitro và làm chế phẩm vi sinh dùng trong nông nghiệp và chế
phẩm vi sinh cho cây lúa
Phương pháp tiến hành: Khuẩn lạc nuôi trên môi trường MS có bổ sung 1%
methanol cho giấy lọc vô trùng in trên bề mặt các khuẩn lạc vi khuẩn (sau 5 ngày nuôi
cấy), ủ tiếp 2 ngày. Sau đó dùng những tấm giấy này áp lên tấm giấy lọc có thấm
thuốc thử Salkowski (2,03g FeCl
3
.6H
2
O hoà tan trong 500ml nước và 300ml acid
H
2
SO
4
đậm đặc) hoặc Salkowski cải tiến (0,05 M FeCl
3
trong dung dịch HClO
4
35%)
sấy 15 phút quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu tím xanh (với thuốc thử salkowski
cải tiến).
3.4.2. Định tính khả năng sinh tổng hợp PHB [8].

Mục tiêu: Theo công trình nghiên cứu của J. U. Ackermann và ctv (1995), Trâm
(2006), cho rằng một số chủng Methylobacterium sp. có khả năng sinh tổng hợp nhựa
sinh học (PHB) nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm định tính khả năng sinh tổng hợp
PHB của các chủng đã phân lập nhằm sàng lọc sơ bộ các chủng có khả năng tổng hợp
PHB.
Vi khuẩn thí nghiệm: Bốn chủng vi khuẩn đã định danh trong thí nghiệm sinh
hóa, sinh ly ở trên.


40
Phương pháp tiến hành: Lấy 1 – 2 giọt huyền phù sinh khối vi khuẩn (có OD
600

khoảng 0,1) đặt lên tấm lam sạch. Hơ qua ngọn lửa đèn cồn nhiều lần để cố định tế bào
trên lam. Nhuộm tế bào đã được cố định bằng một giọt phẩm nhuộm Nile Blue A
trong 10 phút ở 55
0
C. Sau khi nhuộm xong, phẩm thừa được rửa sạch bằng nước máy
với bình xịt tia mạnh và sau đó rửa lại lần nữa với dung dịch acid acetic 8% trong 1
phút, dùng giấy thấm lau khô mẫu, cho một giọt nước lên lam đậy lamen lại.
Mẫu sau khi xử lý được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 460nm.
Ở bước sóng ánh sáng này, các hạt PHB trong tế bào được nhuộm sẽ có màu cam sáng
trên nền tế bào màu đen.