Luận văn : Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP part 5 doc

41
Bảng 3.4. Thí nghiệm 1.
Các mẫu thực hiện
Thành phần (25 μl/ống)
Chu trình nhiệt
TT1
TT4
TT5
TT6
TT7
TT8
Taq buffer 10 X
1,5 mM MgCl
2

0,5 U Taq polymerase
100 μM dNTPs
20 ng primer (0,65 μl) (*)
20 ng DNA khuôn
Thêm nước đến 25 μl.
94
o
C – 4 phút.
Lặp lại 45 chu kỳ:
94
o
C – 1 phút;
33

o
C – 1 phút(**);
72
o
C – 2 phút.
72
o
C – 10 phút.
Giữ 4
o
C.
(*): Dung dịch primer sử dụng có nồng độ 10 pmol/μl.
(**): Nhiệt độ bắt cặp được ước lượng bằng công thức Ta = Tm – 2
o
C.
 Thí nghiệm 2: Thực hiện giảm số chu kỳ nhiệt độ xuống còn 35 chu kỳ và
giữ nguyên nồng độ các thành phần hoá chất như thí nghiệm 1 (bảng 3.5). Thực hiện
với 4 primer: 1, 2, 9 và 11.
Bảng 3.5. Thí nghiệm 2.
Các mẫu thực hiện
Thành phần (25 μl/ống)
Chu trình nhiệt
TT1
TT4
TT5
TT6
TT7
TT8
Taq buffer 10 X
1,5 mM MgCl

2

0,5 U Taq polymerase
100 μM dNTPs
20 ng primer (0,65 μl) (*)
20 ng DNA khuôn
Thêm nước đến 25 μl.
94
o
C – 4 phút.
Lặp lại 35 chu kỳ:
94
o
C – 1 phút;
33
o
C – 1 phút(**);
72
o
C – 2 phút.
72
o
C – 10 phút.
Giữ 4
o
C.



42

 Thí nghiệm 3: Thực hiện tăng số chu kỳ nhiệt độ lên 37 chu kỳ, đồng thời
giữ nguyên nồng độ các thành phần phản ứng như thí nghiệm 2 (bảng 3.6). Thực hiện
với 4 primer: 1, 2, 9 và 11.
Bảng 3.6. Thí nghiệm 3.
Các mẫu thực hiện
Thành phần (25 μl/ống)
Chu trình nhiệt
TT1
TT4
TT5
TT6
TT7
TT8
Taq buffer 10 X
1,5 mM MgCl
2

0,5 U Taq polymerase
100 μM dNTPs
20 ng primer (0,65 μl) (*)
20 ng DNA khuôn
Thêm nước đến 25 μl.
94
o
C – 4 phút.
Lặp lại 37 chu kỳ:
94
o
C – 1 phút;
33

o
C – 1 phút (**);
72
o
C – 2 phút.
72
o
C – 10 phút.
Giữ 4
o
C.

 Thí nghiệm 4: Chúng tôi thực hiện 6 nghiệm thức thay đổi nồng độ các
thành phần tham gia phản ứng (được trình bày trong bảng 3.7), đồng thời giữ nguyên
chu trình phản ứng như thí nghiệm 3. Sử dụng primer 11, thực hiện với DNA của các
mẫu TT1, TT4 và TT8.
Chu trình phản ứng thí nghiệm 4:
94
o
C – 4 phút.
Lặp lại 37 chu kỳ: 94
o
C – 1 phút; 33
o
C – 1 phút; 72
o
C – 2 phút.
72
o
C – 10 phút.

4
o
C – tùy ý.






43
Bảng 3.7. Thí nghiệm 4.
TP
MgCl
2

25 mM
Taq poly-
merase 5 U
dNTPs
10 mM
Primer

Nƣớc và
DNA
template
Thể
tích
hút
(μl)
Nồng

độ
cuối
(mM)
Thể
tích
hút
(μl)
Nồng
độ
cuối
(U)
Thể
tích
hút
(μl)
Nồng
độ
cuối
(μM)
Thể
tích
hút
(μl)
Lượng
sử
dụng
(ng)
NT1(ĐC)
1,5
1,5

0,1
0,5
0,25
100
0,65
20
2,5 μl
Taq
buffer
10x.
Thêm
nước sau
cùng để
đạt
25μl/ống.
NT2
2
2
0,1
0,5
0,25
100
0,65
20
NT3
2
2
0,12
0,6
0,25

100
0,65
20
NT4
2
2
0,1
0,5
0,25
100
0,75
22
NT5
2
2
0,1
0,5
0,3
120
0,65
20
NT6
2
2
0,12
0,6
0,3
120
0,75
22

3.2.2.3. Kỹ thuật AFLP
Thực hiện kỹ thuật AFLP với 8 mẫu DNA có chất lượng tốt (nồng độ DNA cao
trên 100 ng/μl và tương đối sạch) là các mẫu: TT1, TT4, TT9, TT31, VT38, CĐ40,
CĐ45, XM78.
 Cắt giới hạn và gắn adapter:
Kiểm tra phản ứng cắt DNA của enzyme: Sau khi có được DNA,
bước đầu tiên là kiểm tra xem những enzyme cắt EcoRІ và MseІ có phù hợp với bộ
gene đó hay không. Phản ứng cắt thử:
 300 ng DNA bộ gene.
NT



44
 4 U enzyme EcoRI.
 3 U enzyme MseI.
 6 μl buffer 5 X.
Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hay ở 37
o
C trong 2h, sau đó để 15 phút
ở 70
o
C. Điện di kiểm tra trên gel agarose 1,5 %.
Thực hiện phản ứng cắt giới hạn và gắn adapter:
- Thực hiện biến tính adapter để bảo đảm các adapter hoàn toàn tách
ra khỏi nhau:
 Ủ ống chứa adapter ở 95
o
C trong 5 phút.

 Để nguội đến nhiệt độ phòng.
 Ly tâm 1.400 vòng/phút.
- Chuẩn bị hỗn hợp enzyme (cho 20 mẫu): Cho vào ống 200 μl:
 2 μl buffer 5 X T4 DNA ligase có ATP.
 2 μl 0,5 M NaCl.
 1 μl BSA1mg/ml (làm loãng từ dung dịch gốc 10 mg/ml).
 20 Unit MseI.
 100 Unit EcoRI.
 20 Weiss Unit T4 DNA ligase.
 Cho thêm nước cất siêu sạch để được 40 μl.
Trộn kỹ, ly tâm trong 10 giây. Luôn giữ trong đá.
- Chuẩn bị phản ứng cắt và gắn: Cho vào ống 200 μl/phản ứng:
 1 μl buffer T4 DNA ligase 10 X có ATP ( hay 2 μl đệm
T4 DNA ligase 5 X có ATP).
 1 μl NaCl 0,5 M.
 0,5 μl BSA1mg/ml.



45
 1 μl MseI adapter.
 1 μl EcoRI adapter.
 1 μl hỗn hợp enzyme đã chuẩn bị ở trên.
 Cho thêm 0,5 μl mẫu (mẫu đối chứng cho 5,5 μl DNA từ
KIT).
Trộn kỹ, ly tâm 10 giây. Để ở nhiệt độ phòng qua đêm hay 37
o
C
trong 2 giờ.
 Nhân bản tiền chọn lọc:

Thành phần hỗn hợp phản ứng:
- Pha loãng sản phẩm của phản ứng cắt và gắn adapter: Cho thêm
189 μl TE vào mỗi ống phản ứng cắt và gắn, bảo quản ở 4
o
C hay
–20
o
C.
- Trộn các thành phần sau trong ống 200 μl:
 4 μl DNA đã cắt và pha loãng.
 1 μl primer tiền nhân bản.
 15 μl AFLP mix (P/N 402005).
Chu trình nhiệt phản ứng nhân bản tiền chọn lọc: bảng 3.8.
Bảng 3.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản tiền chọn lọc.
Nhiệt độ
và thời
gian
Chu trình
Nhiệt độ
và thời
gian
Nhiệt độ
và thời
gian
Thực hiện 20 chu kỳ.
72
o
C
2 phút.
94

o
C
20 giây.
56
o
C
30 giây.
72
o
C
2 phút.
60
o
C
30 giây.
4
o
C
giữ tùy
ý.

Kiểm tra sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc bằng gel agarose 1,5%.



46
 Nhân bản chọn lọc: Để thực hiện bước này chúng tôi tiến hành chọn những
tổ hợp primer EcoRI – MseI. Sau khi thực hiện phản ứng nhân bản chọn lọc xong, sản
phẩm được điện di trên máy giải trình tự.
Thành phần hỗn hợp phản ứng:

- Chuẩn bị khuôn DNA:
 10 μl sản phẩm tiền nhân bản.
 190 μl đệm TE.
Trộn kỹ, ly tâm 10 giây tốc độ thấp và giữ ở 4
o
C.
- Chúng tôi tiến hành thử nghiệm với 12 tổ hợp primer nhân bản chọn
lọc:
 MseI + CAA – EcoRI + ACT (phát màu xanh dương).
 MseI + CAA – EcoRI + AAC (phát màu vàng).
 MseI + CAA – EcoRI + AGG (phát màu xanh lá cây).
 MseI + CAA – EcoRI + ACA (phát màu xanh dương).
 MseI + CAA – EcoRI + AGC (phát màu vàng).
 MseI + CAA – EcoRI + ACG (phát màu xanh lá cây).
 MseI + CAG – EcoRI + ACT (phát màu xanh dương).
 MseI + CAG – EcoRI + AAC (phát màu vàng).
 MseI + CAG – EcoRI + AGG (phát màu xanh lá cây).
 MseI + CAG – EcoRI + ACA (phát màu xanh dương).
 MseI + CAG – EcoRI + AGC (phát màu vàng).
 MseI + CAG – EcoRI + AAG (phát màu xanh lá cây).
- Trộn hỗn hợp phản ứng:
 3,0 μl sản phẩm nhân bản tiền chọn lọc đã pha loãng.
 1,0 μl primer MseI + Cxx (5 μM).



47
 1,0 μl primer EcoRI + Axx đánh dấu huỳnh quang (1 μM).
 15,0 μl hổn hợp AFLP (P/N 402005).
(Luôn để hỗn hợp trong đá)

Chu trình nhiệt phản ứng nhân bản chọn lọc: bảng 3.9.
Bảng 3.9. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân bản chọn lọc.
Nhiệt độ,
thời gian
Chu trình
Số chu
kỳ
94
o
C, 2 phút.










60
o
C, 30 phút.
4
o
C, giữ tùy ý.
94
o
C, 20 giây.
94

o
C, 20 giây.
94
o
C, 20 giây.
94
o
C, 20 giây.
94
o
C, 20 giây.
94
o
C, 20 giây.
94
o
C, 20 giây.
94
o
C, 20 giây.
94
o
C, 20 giây.
94
o
C, 20 giây.
94
o
C, 20 giây.

66
o
C, 30 giây.
65
o
C, 30 giây.
64
o
C, 30 giây.
63
o
C, 30 giây.
62
o
C, 30 giây.
61
o
C, 30 giây.
60
o
C, 30 giây.
59
o
C, 30 giây.
58
o
C, 30 giây.
57
o
C, 30 giây.

56
o
C, 30 giây.

72
o
C, 2 phút.
72
o
C, 2 phút.
72
o
C, 2 phút.
72
o
C, 2 phút.
72
o
C, 2 phút.
72
o
C, 2 phút.
72
o
C, 2 phút.
72
o
C, 2 phút.
72
o

C, 2 phút.
72
o
C, 2 phút.
72
o
C, 2 phút.
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
20
1
1

 Điện di: Kết quả phản ứng nhân bản chọn lọc được điện di trên máy giải
trình tự AB sequencer 3100.

48
Chƣơng 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sau thời gian thực hiện các thí nghiệm chúng tôi thu được một số kết quả:
4.1. Phần điều tra và thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu
Sau giai đoạn thu thập mẫu chúng tôi có được 80 mẫu lá của những cây điều có
những đặc điểm nổi bật và điển hình tại các địa phương thuộc tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu:
Thành phố Vũng Tàu; Thị xã Bà Rịa; các huyện: Châu Đức, Long Điền, Long Đất,
Tân Thành, Xuyên Mộc. Đặc điểm các mẫu được thống kê trong bảng 4.1
Bảng 4.1. Kết quả thu thập mẫu lá cây điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
Đặc điểm cây chọn lấy mẫu
Tỉ lệ %
Năng suất
Cao
79 % (63/80 mẫu)
Thấp
21 % (17/80 mẫu)
Hoa
Ra nhiều hoa
90 % (72/80 mẫu)
Ra ít hoa
10 % (8/80 mẫu)
Ra hoa sớm
71 % (56/80 mẫu)
Ra hoa muộn
29 % (24/80 mẫu)
Ra hoa một đợt
55 % (44/80 mẫu)

Ra hoa nhiều đợt
45 % (36/80mẫu)
Hoa nở đồng loạt
59 % (47/80 mẫu)
Hoa nở phân tán
41 % (33/80 mẫu)



49

Chùm
Nhiều chùm
65 % (52/80 mẫu)
Ít chùm
22 % (18/80 mẫu)
Chùm có nhiều hạt
81 % (65/80 mẫu)
Chùm có ít hạt
19 % (15/80 mẫu)
Hạt
To
73 % (58/80 mẫu)
Nhỏ
27 % (22/80 mẫu)
Thân và cành
cây
Sum suê
86 % (69/80 mẫu)
Thưa thớt

14 % (11/80 mẫu)
Hiện tƣợng rụng
trái non
Nhiều
22 % (18/80 mẫu)
Ít
68 % (55/80 mẫu)
Quả giả
To
37 % (30/80 mẫu)
Nhỏ
63 % (50/80 mẫu)
Quả màu vàng
33 % (26/80 mẫu)
Quả màu đỏ
67 % (54/80 mẫu)
Quả ngon
23 % (18/80 mẫu)
Quả dở
4 % (5/80 mẫu)
Khả năng chống
chịu sâu hại
Cao
100 % (80/80 mẫu)
Thấp
0 % (0/80 mẫu)
Khả năng chống
chịu bệnh
Cao
76 % (62/80 mẫu)

Thấp
24 % (18/80 mẫu)



50
Như vậy, thông qua điều tra và thu thập mẫu chúng tôi nhận thấy sự phân bố kiểu
hình của cây điều ở tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu rất đa dạng.
4.2. Phần nghiên cứu và phân tích trong phòng thí nghiệm
4.2.1. Kết quả tách chiết DNA
4.2.1.1. Kết quả chung
Chúng tôi thực hiện tách chiết DNA 80 mẫu lá điều thu thập được, kết quả có
55 mẫu đạt yêu cầu, đạt tỉ lệ khoảng 70 %. Chúng tôi chỉ sử dụng những mẫu DNA sau
khi tách chiết điện di thấy có band và đo OD thấy giá trị OD từ 1,5 trở lên. Nồng độ
DNA trung bình khoảng 70 – 80 ng/μl. Chất lượng DNA được chia làm 2 nhóm:
 Tỉ số OD từ 1,5 – 1,8: Có chất lượng trung bình, có 16/55 mẫu, chiếm
29 %.
 Tỉ số OD từ 1,8 – 2,2: Có chất lượng tốt, có 39/55 mẫu, chiếm 71 %.
Kết quả được minh họa trên hình 4.1.








Hình 4.1 Kết quả tách chiết DNA lá điều tươi trưởng thành.
4.2.1.2. Một số vấn đề tách chiết DNA ở lá điều
 Đặc điểm: Sau khi tách chiết, DNA lá điều thường bị gãy nhiều (hình 4.1),

có lẽ do tế bào lá điều có lớp thành tế bào dày và cứng, khó nghiền nên khi nghiền
mạnh tay dễ làm gãy DNA. Lượng DNA thu được trong nghiên cứu này không cao,
TT1 TT7 TT13 TT27TT33 CĐ45CĐ50 CĐ79