Luận văn : Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP part 3 pps

21
Bảng 2.6. Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA.
Thành phần
Tên gọi
Bản chất
Tác dụng
pH


Ức chế hoạt động của
những enzyme phân hủy
(như enzyme DNase hoạt
động ở pH=7).
Tris-HCl

Dung dịch đệm
Duy trì pH phù hợp.
EDTA
ethylenediamine
-tetraacetate

Ức chế những enzyme
phân hủy DNA.
sodium acetat.

Muối
-Kết hợp với ethanol 100%
kết tủa và rửa sạch DNA.

-Bảo vệ DNA.
CTAB
hexadecyltrime-
thylammonium-
bromide.
Chất tẩy cation.
-Hòa tan màng tế bào.
-Biến tính protein.
-Thành lập phức hợp với
những protein, polysaccha-
ride.
CIA
chloroform-
isoamylalcohol.

Chiết xuất protein và
những polycaccharide.
isopropanol


Kết tủa DNA.
ß-mercaptoetha-
nol

Tác nhân phá
hủy màng nhân
và kháng lại sự
oxi hóa.
-Ức chế quá trình oxi hóa.
-Phá vỡ màng nhân.

-Bảo vệ DNA khỏi những
quinone, disulfite, peroxi-
dase, polyphenoloxydase.
ethanol 100%


-Kết tủa DNA.
-Rửa sạch DNA. Có thể
gây hại cho DNA do vậy
phải kết hợp với muối.
ethanol 70%


Rửa sạch DNA. Không
gây hại cho DNA do ở
nồng độ thấp.




22
 Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện với các
primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản
phẩm không chính xác.
 Bước 3: Điện di phát hiện: Kết quả PCR – RAPD được điện di trên gel
agarose.
2.2.6.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD
 Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không
cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản. Chất
lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng

nhân bản cao.
 Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thường được sử
dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận
diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [6].
2.2.6.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD
 Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức
độ lặp lại giống nhau thấp).
 Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa
hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ
tin cậy không cao [1] [6].
2.2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời,
mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm
dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:
 Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các đối tượng: cúc lai,
cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,…
 Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và
mối tương quan giữa kiểu gene RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số
giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1999) [1] [6].



23
 Xây dựng bản đồ gene: Sử dụng phương pháp BSA kết hợp kỹ thuật RFLP
và RAPD lập bản đồ gene tms – 1 của dòng lúa TGMS (5460S) (Wang và ctv, 1995)
[1] [6].
2.2.7. Kỹ thuật AFLP
2.2.7.1. Nguyên lý kỹ thuật AFLP
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình chiều
dài những đoạn DNA được nhân bản) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau

và Vos (1993) phát minh ra, sau đó được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997)
tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng
những cặp primer đặc biệt được thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR được thiết lập
nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA được cắt giới hạn
từ bộ gene của đối tượng nghiên cứu. Những đoạn DNA được nhân bản có độ dài
khoảng từ 60 – 500 basepairs. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền
của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao [1] [6] [17] [18]. Nguyên
lý kỹ thuật AFLP được trình bày trong hình 2.2.











Hình 2.2 Nguyên lý kỹ thuật AFLP



24
2.2.7.2. Các bƣớc của kỹ thuật AFLP [17]
Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bước cơ bản:
 Bước 1: Tách chiết DNA. Tương tự như ở kỹ thuật RAPD, tuy nhiên chất
lượng DNA sử dụng cho kỹ thuật AFLP phải tốt hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD.
 Bước 2: Cắt giới hạn và gắn adapter
Bước này gồm có hai giai đoạn:

Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn bằng 2
enzyme cắt.
Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu
dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ xung với
những đoạn DNA vừa được cắt. Mục đích để tạo ra những khuôn DNA có trình tự 2
đầu đã biết, để trong 2 phản ứng PCR sau này người ta sử dụng những primer có trình
tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn.
Để không cho các đoạn DNA vừa được cắt ra không bắt cặp lại với nhau,
giai đoạn cắt và gắn adapter được thực hiện đồng thời và được coi như một bước.
 Bước 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification)
Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn
adapter từ bước 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi
DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bước 2 và cộng thêm
1 nucleotide ở đầu 3
’
.
Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự
của adapter MseI + 1 nucleotide (thường là C).
Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự
của adapter EcoRI + 1 nucleotide (thường là A).
Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp
những đoạn DNA được cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lượng của những đoạn có
thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn
lọc). Với việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt được nhiều đoạn có gắn với adapter.



25
Bước này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %.
 Bước 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification)

Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có
trình tự tương tự như primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở
đầu 3
’
. Mục đích chính của bước này nhằm chọn lọc tối đa các đoạn DNA đã được cắt
giới hạn và gắn adapter đã được nhân bản ở bước 3, chỉ nhân bản những đoạn DNA có
trình tự 2 đầu hoàn toàn bổ xung với trình tự của các primer nhân bản chọn lọc, qua đó
làm giảm nhiều độ phức tạp của kết quả.
Primer nhân bản chọn lọc MseІ = trình tự bổ xung với trình tự của
adapter MseI + 2 hay 3 nucleotide.
Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ xung với trình tự
của adapter EcoRI + 3 nucleotide + chất phát màu huỳnh quang (giúp phát hiện sản
phẩm khi điện di).
Bảng 2.7. Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc.
Những primer EcoRІ nhân bản chọn
lọc dùng cho bộ gene có kích thƣớc
lớn.
Những primer EcoRІ nhân bản chọn
lọc dùng cho bộ gene có kích thƣớc
nhỏ.
EcoRІ-ACT FAM
EcoRІ -ACA FAM
EcoRІ -AAC NED
EcoRІ -ACC NED
EcoRІ -AGC NED
EcoRІ -AAG JOE
EcoRІ -AGG JOE
EcoRІ -ACG JOE
EcoRІ-TG FAM
EcoRІ-TC FAM

EcoRІ-AC FAM
EcoRІ-TT NED
EcoRІ-AT NED
EcoRІ-TA JOE
EcoRІ-AG JOE
EcoRІ-AA JOE






26
Bảng 2.8. Những primer MseI nhân bản chọn lọc.
Những primer MseІ nhân bản chọn lọc
MseІ-CAA
MseІ-CAC
MseІ-CAG
MseІ-CAT
MseІ-CTA
MseІ-CTC
MseІ-CTG
MseІ-CTT

 Bước 5: Điện di và phân tích kết quả
Kết quả AFLP có thể được điện di trên máy giải trình tự gene hay điện di
trên gel polyacrylamide.
Nguyên lý hoạt động của máy giải trình tự: Khi sử dụng máy giải trình tự
để điện di, các sản phẩm của phản ứng nhân bản chọn lọc sẽ được hút qua những ống
mao quản có đường kính rất nhỏ, bên trong có polymer. Trong phản ứng nhân bản

chọn lọc, các primer EcoRI có gắn chất phát huỳnh quang trước đó, vì vậy khi các sản
phẩm nhân bản chọn lọc đi qua một camera laser, chúng sẽ phát màu, khi đó một đầu
dò cực nhạy sẽ thu nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra này và truyền tín hiệu về máy
tính sử lý. Độ dài của các đoạn được nhân bản chọn lọc sẽ được tính toán dựa vào vị
trí tương đối của chúng với những band chuẩn có kích thước đã biết. Kết quả điện di
trên máy giải trình tự cho độ chính xác rất cao, có thể phân biệt các band chỉ chênh
lệch nhau đến vài nucleotide [17].





27
2.2.7.3. Những ƣu điểm của kỹ thuật AFLP
 Kỹ thuật AFLP phù hợp cho tất cả các đối tượng nghiên cứu là thực vật,
động vật và vi sinh vật mà không cần biết trước trình tự bộ gene.
 Không giống như kỹ thuật RAPD sử dụng những primer ngắn và nhân bản
một cách ngẫu nhiên, cho kết quả có độ tin cậy không cao, kỹ thuật AFLP sử dụng 2
primer dài, cho kết quả đáng tin cậy và ổn định (kết quả giống nhau khi được lập lại
nhiều lần) do điều kiện thực hiện 2 phản ứng PCR nghiêm ngặt.
 Kết quả AFLP có thể được điện di trên máy giải trình tự gene có độ phân
tách các band cao giúp phát hiện hầu hết những đoạn được nhân bản chọn lọc có độ
dài gần bằng nhau mà khi điện di trên gel agarose hay gel polyacrylamide khó phát
hiện được.
 Khả năng xuất hiện đa hình lớn, nhận diện được chỉ thị trội với độ tin cậy
cao. Đánh giá đa dạng di truyền với độ tin cậy cao.
 Sử dụng một lượng ít DNA so với RFLP [17].
2.2.7.4. Những hạn chế của kỹ thuật AFLP
 AFLP là kỹ thuật mới nên chưa được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu.
Chi phí tiến hành cao và thiết bị phức tạp nên chưa thể thay thế hoàn toàn các kỹ thuật

khác, đặc biệt là với các đối tượng nghiên cứu hoàn toàn mới.
 Thao tác thực hiện khó, cần có đội ngũ chuyên viên được đào tạo lành
nghề.
2.2.7.5. Ứng dụng của kỹ thuật AFLP
Kỹ thuật AFLP được sử dụng cho những công việc:
 Đánh giá đa dạng di truyền.
 Nhận diện chỉ thị phân tử.
 Xây dựng bản đồ gene.





28
2.2.8. So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân
tử
Việc chọn lựa một kỹ thuật sinh học phân tử để sử dụng phải căn cứ vào nhiều yếu
tố, cụ thể như những ưu và khuyết điểm của kỹ thuật đó hay tùy thuộc vào tình hình
nghiên cứu thực tế, tuy nhiên các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ
thị phân tử có thể được so sánh một cách tương đối theo những tiêu chí như bảng 2.9.
Bảng 2.9. So sánh các kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử.
Các yếu tố chính
AFLP
RAPD
SSR
RFLP
Allozyme
Số lượng thông tin
Khả năng đáng tin cậy
Độ phân giải

Cách tiến hành
Thời gian tiến hành
Cao
Cao
Cao
Vừa phải
Ngắn
Cao
Biến đổi
Vừa phải
Dễ
Ngắn
Cao
Cao
Cao
Khó
(*)
Dài
(*)
Thấp
Cao
Cao
Khó
Dài
Thấp
Cao
Vừa phải
Dễ
Ngắn

(*): Khi chưa phát hiện được trình tự primer. Nếu đã có trình tự primer thì thời
gian tiến hành ngắn và cách thức tiến hành dễ (Theo Hillis và ctv, Karp và Edwards,
1998) [17]
2.2.9. Kỹ thuật PCR
Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) là phản ứng nhân bản nhanh chóng
một chuỗi DNA khuôn thành hàng triệu bản giống hệt nhau và giống hệt chuỗi DNA
khuôn qua vài chục chu kỳ nhiệt độ luân chuyển liên tục, sử dụng các primer bắt cặp
bổ sung với chuỗi DNA khuôn, enzyme polymerase gắn các dNTPs vào với nhau theo
một trình tự bổ xung với trình tự của chuỗi DNA khuôn, bắt đầu từ đầu 3
’
của các
primer [1] [5] [6] [8] [10] [11] [12] [14].
2.2.9.1. Nguyên lý kỹ thuật PCR
Được miêu tả qua 3 giai đoạn:



29
 Giai đoạn 1 – Biến tính (denature): Biến tính DNA mạch đôi ở nhiệt độ cao
(khoảng 92
o
C – 96
o
C) tạo những khuôn DNA mạch đơn có độ dài bằng nhau và bằng
DNA mạch đôi tạo ra nó.
 Giai đoạn 2 – Bắt cặp (annealing): Gắn các primer vào các khuôn DNA
mạch đơn (tạo ra ở giai đoạn 1), dựa trên nguyên tắc bổ sung. Primer là các
oligonucleotide có khoảng 10 – 25 nucleotide, có trình tự bắt cặp bổ sung với một
đoạn nào đó trên DNA khuôn. Giai đoạn này thường được tiến hành ở nhiệt độ 50
o

C –
56
o
C.
 Giai đoạn 3 – Kéo dài (extension): kéo dài mạch đơn DNA bắt đầu từ
nucleotide cuối cùng của primer ở đầu 3
’
do tác dụng của enzyme polymerase gắn các
nucleotide vào với nhau, theo nguyên tắc bắt cặp bổ sung (A – T, G – C) với những
nucleotide của mạch khuôn (DNA template). Kết quả là từ một phân tử DNA ban đầu
sẽ cho 2 phân tử DNA hoàn toàn giống nhau và giống với phân tử DNA ban đầu về
chiều dài và trình tự các nucleotide. Giai đoạn này thường được tiến hành ở 70
o
C –
72
o
C.
Phản ứng PCR được tiến hành với sự hiện diện của: đoạn DNA khuôn (DNA
template), các dNTPs, enzyme polymerase, các primer, MgCl
2
, dung dịch đệm (buffer)
và máy thermocycler – máy điều khiển chu kỳ nhiệt độ, thực hiện duy trì và luân
chuyển nhiệt độ của từng giai đoạn một cách chính xác và ổn định trong một khoảng
thời gian chính xác trong 30 – 45 chu kỳ.
Nguyên lý kỹ thuật PCR được trình bày trong hình 2.3 và hình 2.4.

30





















Hình 2.3 Nguyên lý kỹ thuật PCR

2.2.9.2. Quy trình chuẩn của phản ứng PCR
Tiến hành qua 25 – 35 chu kì, trong điều kiện nhiệt độ và nồng độ các chất:
 Nồng độ các chất trong hỗn hợp PCR:
Nồng độ enzyme: thường sử dụng ở nồng độ 0,1 – 0,5 U/25 μl dung
dịch phản ứng. Nếu như nồng độ enzyme Taq polymerase quá cao có thể làm phát sinh
những sản phẩm không đặc hiệu, còn nếu nồng độ enzyme Taq polymerase quá thấp
thì phản ứng không xảy ra hoàn toàn do không có đủ enzyme.
Các dNTPs: Hàm lượng các dNTPs trong khoảng 20 – 200 μM cho
kết quả ổn định và đặc hiệu. Bốn loại dNTPs (A, T, G, C) phải có nồng độ gần tương
đương nhau.
Hàm lượng MgCl
2
: Nồng độ tối ưu của MgCl
2
cho kết quả PCR tốt.
Ion Mg
+
có thể ảnh hưởng đến:
- Nhiệt độ để biến tính mạch đôi thành mạch đơn.
Nguyên lý kỹ thuật PCR
Từ 30 – 45 chu
kỳ
Bƣớc 1: Biến
tính



Bƣớc 2: Bắt cặp

Bƣớc 3: Nối dài