Luận văn : Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate part 5 pptx

41
–Cho hổn hợp trên nhỏ từng giọt xuống dung dòch Ca 0.2M từ khoảng
cách 20cm tạo thành các hạt có kích thước từ 0.5–4 mm. Để yên trong 2 giờ để các
hạt gel tủa lại. Enzyme đã được bao bọc bên trong hạt gel.
 Sơ đồ thực hiện:
Sodium alginate


Nước
Khuấy, để yên trong 30 phút

Dung dòch enzyme tỉ lệ 1:1
Khuấy. Loại bỏ bọt khí

Glutaraldehyde
Để yên trong 6giờ

Xilanh nhỏ giọt


CaCl
2
0.2M
Loại enzyme dư.
Để yên trong 2 giờ
Gel


42

3.2.2. Phương pháp đánh giá hoạt tính enzyme amylase cố đònh
Chỉ tiêu theo dõi, đánh giá hoạt tính enzyme amylase dựa trên đònh lượng
đường maltose sinh ra sau phản ứng thủy phân tinh bột theo phương pháp
Wihstatetter Schudel :
a. Dụng cụ và hoá chất
Dụng cụ
Buret 2
ml
, 5
ml
, 10
ml

Erlen 250
ml

Hóa chất
Dung dòch tinh bột 0.5% trong dung dòch đệm pH 5.6
Na
2
S
2
O
3
N/20
NaOH N/10
Dung dòch iod N/10
b. Đònh lượng đường maltose
Lấy 2 erlen 250
ml

Erlen thứ nhất : (Thử thật): Cho vào 5
ml
hỗn hợp cần xác đònh đường
maltose, 10ml dung dòch iod N/10, 15
ml
dung dòch NaOH N/10. Thời gian nhỏ
dung dòch NaOH N/10 phải kéo dài gần 2 phút (nhỏ từng giọt). Để yên trong tối
15 20 phút. Sau đó lấy ra cho thêm vào 2
ml
H
2
SO
4
2N. Đònh phân lượng thừa
bằng dung dòch Na
2
S
2
O
3
N/20 (dùng hồ tinh bột cho thêm vào lúc cuối phản ứng
đònh phân để làm chất chỉ thò màu) .
Erlen thứ hai : (thử không) : thay 5
ml
hỗn hợp cần xác đònh lượng
đường maltose bằng 5
ml
nước cất. Các bước tiến hành thực hiện tương tự như ở
bình thứ nhất.

43
c. Tính kết quả
 Lượng đường maltose sinh ra do tác dụng phân giải của amylase
2.10.20
342).(
)(
3
0 t
VV
gX
(*)
V
0
: là thể tích Na
2
S
2
O
3
N/20 dùng đònh phân cho bình thử không.
V
t
: là thể tích Na
2
S
2
O
3

N/20 dùng đònh phân cho bình thử thật.
342 : trọng lượng phản ứng của maltose.

 Hoạt tính của amylase (UI) được tính theo công thức
).(.
.
IUK
tm
X
A Hđ
(**)
X : Lượng đường maltose sinh ra do tác dụng thủy phân của amylase.
m : Lượng mẫu enzyme sử dụng.
K : Hệ số pha loãng.
3.2.3. Phương pháp khảo sát hoạt tính enzyme cố đònh
a. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố đònh so với enzyme hòa tan
– Sử dụng 25 ml enzyme Termamyl đã được pha loãng với nước cất (hệ số
pha loãng là 2) tiến hành qui trình cố đònh với 25ml dung dòch alginate 3% như trên
tạo ra được 50 ml enzyme cố đònh.
– Lấy 10 erlen 250 ml chia thành hai lô, mỗi lô 5 erlen. Một lô tiến hành
thí nghiệm với enzyme cố đònh, một lô tiến hành với dòch enzyme hòa tan với hệ số
pha loãng là 2 để lấy giá trò trung bình.
– Tiến hành theo bảng sau :


44

Lô thứ 1
Lô thứ 2
100

ml
hồ tinh bột 0.5%
100
ml
hồ tinh bột 0.5%
10
ml
enzyme cố đònh
5
ml
dòch enzyme hòa tan
Đặt tên trên máy lắc ở nhiệt độ thường trong 1 giờ
Đem đònh lượng đường maltose sinh ra
Ở mỗi erlen lấy ra 25
ml
hỗn hợp, thêm 10
ml
dung dòch NaOH 0.5N để làm
bất hoạt amylase, thêm nước cho đủ 50
ml
. Lấy 5
ml
hỗn hợp vừa pha loãng để
đònh lượng đường maltose sinh ra sau phản ứng thủy phân tinh bột theo phương
pháp Wilistatettet Schudel.
b. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme cố đònh
– Sử dụng 45 ml enzyme Termamyl đã được pha loãng với nước cất (hệ số
pha loãng là 2) tiến hành qui trình cố đònh với 45ml dung dòch alginate 3% như trên
tạo ra được 90 ml enzyme cố đònh.
– Bố trí thí nghiệm theo 3 lô thí nghiệm, mỗi lô 3 mẫu tiến hành theo dõi

hoạt tính của enzyme cố đònh ở các nhiệt độ khác nhau.
– Tiến hành theo bảng sau :
Tiến hành thí nghiệm
Lô 1
Lô 2
Lô 3
Dung dòch tinh bột 0,5% (ml)
100
100
100
Enzyme cố đònh (ml)
10
10
10
Nhiệt độ ủ (
0
C)
50
60
70
Thời gian ủ (h)
1
1
1
Sau thời gian ủ 1 giờ ở mỗi lô thí nghiệm lấy ra 25 ml hỗn hợp, thêm vào
10 ml dung dòch NaOH 0.5N để làm bất hoạt – amylase, thêm nước cho đủ 50 ml.
Lấy ra 5ml hỗn hợp vừa pha loãng để đònh lượng lượng đường maltose sinh ra sau
phản ứng thủy phân tinh bột theo phương pháp Wilistatettet Schudel.

45
c. Khảo sát hoạt tính enzyme cố đònh theo thời gian
– Sử dụng 75 ml enzyme Termamyl đã được pha loãng với nước cất (hệ số
pha loãng là 2) tiến hành qui trình cố đònh với 75ml dung dòch alginate 3% như trên
tạo ra được 150 ml enzyme cố đònh
Bố trí thí nghiệm theo 5 lô thí nghiệm, mỗi lô 3 mẫu, tiến hành theo dõi
hoạt tính của enzyme cố đònh ở các khoảng cách thời gian khác nhau.
Tiến hành theo bảng sau :
Tiến hành thí nghiệm
Lô 1
Lô 2
Lô 3
Lô 4
Lô 5
Dòch hồ tinh bột 0.5% (ml)
100
100
100
100
100
Enzyme cố đònh (ml)
10
10
10
10
10
Thời gian ủ ở nhiệt độ thường (h)
1.5
2
2.5

3
3.5
Sau thời gian ủ nhất đònh ở mỗi lô thí nghiệm lấy ra 25 ml hỗn hợp, thêm
vào 10 ml dung dòch NaOH 0.5N để làm bất hoạt – amylase, thêm nước cho đủ
50 ml. Lấy ra 5ml hỗn hợp vừa pha loãng để đònh lượng lượng đường maltose sinh
ra sau phản ứng thủy phân tinh bột theo phương pháp Wilistatettet Schudel.
d. Thí nghiệm sử dụng enzyme cố đònh trong thiết bò dòng chảy liên tục
tuần hoàn
Tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme cố đònh trong cột cố đònh hình trụ
tròn với thể tích 300
ml
, chiều cao 40
cm
, tiến hành phản ứng thủy phân tinh bột theo
dạng thiết bò tuần hoàn liên tục.
– Nhồi vào cột 150 ml enzyme cố đònh. Tiến hành chạy thiết bò với lưu
lượng nguyên liệu đầu vào 50 ml/ 1 giờ; Lưu lượng sản phẩm 50 ml/ 1 giờ; Lưu
lượng dòng tuần hoàn 30 ml/ 1 giờ.
– Sau những khoảng thời gian nhất đònh tiến hành xác đònh hàm lượng
đường maltose sinh ra trong sản phẩm thu được, đánh giá hoạt tính enzyme cố đònh,
đồng thời khảo sát thời gian sử dụng được enzyme một cách liên tục. Tuy nhiên do
thời gian ở phòng thí nghiệm không cho phép khảo sát liên tục trong nhiều giờ do


46
đó sau mỗi lần sử dụng enzyme cố đònh được rửa qua dung dòch CaCl
2
0,2 M và sau
đó được ngâm trong dung dòch CaCl
2

0,2 M đặt ở nhiệt độ lạnh.




Hình 3.1: Mô hình thiết bò tuần hoàn liên tục





47
Phần 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả khảo sát hoạt tính của enzyme cố đònh so với enzyme hòa tan
Sau khi tiến hành khảo sát hoạt tính của enzyme cố đònh so với
enzyme hoà tan theo phương pháp đã được trình bày ở phần III.3, thu được
kết quả như sau (Bảng 4.1; Bảng 4.2) :
Bảng 4.1: Kết quả hoạt tính của enzyme cố đònh ở nhiệt độ thường
LÔ THỨ NHẤT (E. CỐ ĐỊNH)
STT
V
0
(ml)
V
t
(ml)
X(g)
Hoạt tính (UI)
1

22,5
19,9
0.0222
0.0062
2
22,5
20.5
0.0171
0.0048
3
22,5
20.4
0.0180
0.0050
4
22,5
21
0.0128
0.0036
5
22,5
19.9
0.0222
0.0062
Tb
22,5
20.34
0.0185
0.0052
Bảng 4.2: Kết quả hoạt tính của enzyme hòa tan ở nhiệt độ thường

LÔ THỨ HAI (E. HÒA TAN)
STT
V
0
(ml)
V
t
(ml)
X(g)
Hoạt tính (UI)
1
22,5
19.3
0.0274
0.0077
2
22,5
18.9
0.0308
0.0086
3
22,5
19.4
0.0265
0.0074
4
22,5
20
0.0214
0.0060

5
22,5
18.9
0.0308
0.0086
Tb
22.5
19.3
0.0274
0.0077


48
Trong đó :
V
o
: thể tích Na
2
S
2
O
3
N/20 dùng đònh phân cho bình thử không.
V
t
: thể tích Na
2
S
2
O

3
N/20 dùng đònh phân cho bình thử thật.
X : Khối lượng đường maltose sinh ra được tính theo công thức (*)
Họat tính enzyme được tính theo công thức (**)
 Nhận xét
Hoạt tính enzyme – amylase cố đònh giảm 32,5% so với hoạt tính enzyme
hòa tan. Điều này là do :
– Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất.
– Tinh bột là nguồn cơ chất cao phân tử do đó khả năng thẩm thấu qua
màng alginate thấp dẫn đến hạn chế chất lượng sản phẩm tạo ra.
4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cố đònh
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến enzyme cố đònh được trình
bày trong bảng 4.3
Bảng 4.3: Kết quả họat tính của enzyme cố đònh ở các nhiệt độ khác nhau
Nhiệt độ
Lô 1 (50
0
C)
Lô 2 (60
0
C)
Lô 3 (70
0
C)
V
t
Bercher thứ1 (ml)
19.0
18.5
17

V
t
Bercher thứ 2 (ml)
18.0
18.7
16.3
V
t
Bercher thứ 3 (ml)
19.3
18.4
15.5
Giá trò V
t
trung bình (ml)
19.03
18.53
16.27
Hàm lượng đường maltose X(g)
0.03
0.034
0.053
Hoạt tính enzyme (UI)
0.0083
0.0095
0.0149

V
o
: thể tích Na

2
S
2
O
3
N/20 dùng đònh phân cho bình thử không (22.5ml)
V
t
: thể tích Na
2
S
2
O
3
N/20 dùng đònh phân cho bình thử thật.
X : Khối lượng đường maltose sinh ra được tính theo công thức (*)
Hoạt tính enzyme được tính theo công thức (**)


49


50

 Nhận xét
Hoạt tính enzyme tăng rõ rệt khi ta gia tăng nhiệt độ phản ứng đến 70
0
C. Ở
nhiệt độ này, hiệu suất sử dụng cao hơn, mang lại hiệu quả sử dụng cao hơn. Tuy
nhiên, theo nhận đònh của cảm quan, ta không thể tiếp tục gia tăng nhiệt độ, vì ở

nhiệt độ cao hơn hạt gel sẽ không bền vững, hạt gel bò mềm đi khi đó enzyme sẽ
thoát ra ngoài. Đây cũng là một trở ngại rất lớn khi ta sử dụng gel alginate để cố
đònh enzyme có nhiệt độ tối ưu cao như enzyme – amylase.
4.3. Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cố đònh theo thời gian
Bảng 4.4 : Kết quả khảo sát hoạt tính enzyme cố đònh theo thời gian
Thời gian
Lô 1
Lô 2
Lô 3
Lô 4
Lô 5
V
t
Bercher thứ1 (ml)
19,2
18,7
18,1
18,3
18,2
V
t
Bercher thứ 2 (ml)
19,3
18,6
17,8
18,1
18,2
V
t
Bercher thứ 3 (ml)

19,3
18,9
18,2
17,9
18,0
Giá trò V
t
trung bình (ml)
19,27
18,73
18,03
18,10
18,13
Hàm lượng đường maltose X(g) (*)
0,0276
0,0322
0,0382
0,0376
0,0373
Hoạt tính enzyme (**)
0,0052
0,0045
0,0043
0,0035
0,0030
V
o
: thể tích Na
2
S

2
O
3
N/20 dùng đònh phân cho bình thử không(22.5ml)
V
t
: thể tích Na
2
S
2
O
3
N/20 dùng đònh phân cho bình thử thật.
X : Khối lượng đường maltose sinh ra được tính theo công thức (*)
Hoạt tính enzyme được tính theo công thức (**)
Từ bảng kết quả trên, ta rút ra được sự thay đổi hoạt tính của enzyme cố
đònh theo thời gian như sau:
Bảng 4.5 : Sự thay đổi hoạt tính của enzyme theo thời gian
Thời gian (giờ)
1
1.5
2
2.5
3
3.5
Hoạt tính amylase
0.0052
0.0052
0.0045
0.0043

0.0035
0.0030