Cố định enzyme - amylase bằng gel alginate

1
Phần 1.
LỜI NÓI ĐẦU
Enzyme là một chất xúc tác sinh học không chỉ có ý nghóa cho quá trình sinh
trưởng, sinh sản của mọi sinh vật mà nó còn đóng vai trò rất quan trọng trong công
nghệ chế biến thức phẩm, trong y học, trong kỹ nghệ phân tích, trong công nghệ
gen và trong bảo vệ môi trường.
Ngày nay, những nghiên cứu về ứng dụng enzyme trong sản xuất công
nghiệp phát triển rất mạnh. Các hướng nghiên cứu nhằm mục đích tăng khả năng
sử dụng enzyme, kéo dài thời gian, số lần sử dụng enzyme giảm giá thành sử dụng
enzyme. Một trong những bước tiến quan trọng nhất hiện nay là kỹ thuật cố đònh
enzyme trên giá thể tạo ra các dạng enzyme cố đònh (enzyme không hòa tan).
Enzyme cố đònh ở các nước phát triển đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều qui
trình công nghệ như: chế biến thực phẩm, y sinh học và nghiên cứu khoa học. Tuy
nhiên hiện nay việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme cố đònh ở Việt Nam chưa
được phổ biến lắm và vẫn còn là hướng phát triển mới mẻ.
Để góp phần vào những nghiên cứu về enzyme cố đònh đồng thời được sự
chấp thuận của bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh và bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh,
dưới sự hướng dẫn của Th.S Huỳnh Ngọc Oanh, tôi thực hiện đề tài “Cố đònh
enzyme – amylase bằng gel alginate” tại phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học
thuộc trường Đại Học Bách Khoa Tp. Hồ Chí Minh.


2
Phần 2.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYME [2 ]
2.1.1 Khái niệm về enzyme

Trong các phản ứng hóa học nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào
đó phản ứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần. Chất cho thêm vào này gọi là
chất xúc tác.
Chất xúc tác có hai đặc điểm quan trọng
 Làm tăng phản ứng hóa học.
 Bản thân chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng.
Chất xúc tác hóa học chỉ làm thay đổi tốc độ phản ứng, chứ không tham gia
làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng hay năng lượng sử dụng
trong phản ứng. Trong các phản ứng sinh học xảy ra trong cơ thể sinh vật cũng có
các chất làm tăng phản ứng. Chất đó dược gọi là enzyme.
Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản
ứng hóa học trong cơ thể. Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi các chất xúc tác
hóa học thường là chất vô cơ. Sau này các nhà khoa học xác đònh bản chất của
enzyme là protein.
Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng
hóa học trong và ngoài cơ thể.
Điểm rất khác biệt của enzyme là chúng hoạt động trong điều kiện nhiệt
độ ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa trong cơ thể sinh vật. Trong khi đó, các chất
hóa học cần phải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng. Những ưu điểm cơ bản của
enzyme có thể tóm tắt như sau :


3
1. Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng
sinh hóa để giải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất.
2. Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng
chuyển hóa rất cao.
3. Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền. Khi đó sản phẩm
của phản ứng đầu sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo.
4. Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít.

5. Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật.
6. Có nhiều enzyme không bò mất đi sau phản ứng. Ngày nay, các nhà
khoa học đã tìm ra hơn 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số
lượng này là rất nhỏ so với số lượng thật có trong mỗi tế bào.

Dò hóa
ngoài tế bào




Vật chất
có kích thước nhỏ
Tế bào






Vật chất dò hóa ra
khỏi tế bào
Vật chất tổng hợp
ra khỏi tế bào
Môi trường Sinh khối
(sản phẩm bậc 1)
Sản phẩm bậc 2
Hình 2.1 : Hệ thống tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật

Enzym

ngoại bào
Vật chất có
kích thước lớn
Enzym Dò hóa
nội bào trong tế
Quá trình bào
tổng hợp


4
2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme
a. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt tính enzyme
Cơ chế tác động của enzyme vào cơ chất qua ba giai đoạn
Giai đoạn 1 : Enzyme tương tác với cơ chất tạo thành phức enzyme cơ
chất E S.
Giai đoạn 2 : Phức enzyme cơ chất sẽ được tách ra.
Giai đoạn 3 : Enzyme sẽ được giải phóng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm.
Như vậy ở giai đoạn đầu, nếu cơ chất có nồng độ thấp thì tốc độ phản ứng
enzyme sẽ phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.










Hình 2.2 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến tốc độ phản ứng của enzyme

Vận tốc phản ứng được tính như sau :
SK
S
VV
m
max

Phương trình trên gọi là phương trình Michealis Menten
Trong giai đoạn đầu khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng.
Nhưng khi tốc đố phản ứng đạt giá trò cực đại, cho dù có tăng nồng độ cơ chất, tốc
độ phản ứng cũng sẽ hoàn toàn không có khả năng tăng theo.
Nồng độ cơ chất
Tốc độ
phản ứng
Km


5
b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme
Trong các phản ứng hóa học, nhiệt độ càng tăng, tốc độ phản ứng xúc tác
càng tăng. Trong các phản ứng sinh học, nhiệt độ tăng khả năng xúc tác của
enzyme sẽ tăng. Nhưng khả năng tăng của tốc độ phản ứng có một giới hạn nhất
đònh. Quá giới hạn nhiệt độ đó, phản ứng enzyme sẽ giảm và giảm rất nhanh.

Hình 2.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng của enzyme
Hiện tượng đặc biệt này ở enzyme có liên quan đến bản chất hóa học của
enzyme. Các enzyme là những protein thường không bền nhiệt. Trường hợp ta tăng
nhiệt độ trong giai đoạn đầu của phản ứng enzyme sẽ làm tăng khả năng tạo cấu
trúc không gian của enzyme cho phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất. Khi
vượt quá giới hạn về nhiệt độ, cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của
enzyme không còn phù hợp với cấu trúc không gian của cơ chất nữa, khi đó hoạt
tính enzyme sẽ mất dần và đi đến chỗ triệt tiêu.
c. Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme
Trong những nghiên cứu thí nghiệm về ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của
enzyme, các nhà khoa học cho thấy hiện tượng : nếu tăng hoặc giảm giá trò pH tới
một điểm xác đònh nào đó, vận tốc phản ứng enzyme sẽ tăng dần và đạt tới điểm cực
đại giá trò pH, mà ở đó vận tốc phản ứng enzyme đạt giá trò cực đại gọi là pH tối ưu
cho hoạt động của enzyme. Vượt quá giá trò pH này hoạt động enzyme sẽ giảm.
Nhiệt độ
Tốc độ
phản ứng


6

Hình 2.4: Ảnh hưởng pH đến hoạt tính enzyme
Mỗi loại enzyme sẽ có khoảng pH tối ưu và điểm pH tối ưu.
pH có ảnh hưởng rất lớn đến trạng thái ion hóa của các nhóm chức trong
trung tâm hoạt động của enzyme, trạng thái ion hóa của cơ chất và phức chất ES.
d. Ảnh hưởng của các chất kìm hãm các hoạt tính enzyme
Hoạt tính của enzyme có thể bò ảnh hưởng bởi những chất kìm hãm. Những
chất kìm hãm là những chất hoa học có khả năng làm giảm hoạt tính hoặc làm
ngưng hoạt tính của enzyme. Các chất kìm hãm thường là những ion, các phân tử
vô cơ, hữu cơ và cả protein.
Các chất chia ra làm 2 loại :
Chất kìm hãm cạnh tranh.
Chất kìm hãm không cạnh tranh.
Chất kìm hãm cạnh tranh : Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc
không gian tương tự cấu trúc không gian của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết
hợp với enzym, kết quả là enzym không thể kết hợp được với cơ chất để tạo thành
phức chất ES.
pH
Vận tốc
phản ứng
pH op


7

Hình 2.5 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm cạnh tranh đến hoạt tính enzyme
Chất kìm hãm không cạnh tranh :
Các chất kìm hãm không cạnh tranh tham gia kết hợp với enzym
không phải ở trung tâm hoạt động của enzym mà là ở một vò trí ngoài trung tâm
hoạt động của enzym. Người ta còn gọi vò trí này là trung tâm kìm hãm của
enzym.
Khi chất kìm hãm kết hợp với enzym ở ngoài trung tâm hoạt động của
enzym sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của enzym.
Nhờ vậy, chúng sẽ làm giảm tốc độ phản ứng của enzym. Trong rất nhiều trường
hợp, sản phẩm cuối của chuỗi phản ứng hay của một phản ứng thường là chất kìm
hãm không cạnh tranh.








Hình 2.6 : Ảnh hưởng của chất kìm hãm không cạnh tranh đến hoạt tính enzyme


8
e. Ảnh hưởng của chất hoạt hóa đến hoạt tính của enzym
Các chất hoạt hóa (activator) là những chất làm tăng khả năng xúc tác của
enzym. Các chất hoạt hóa có bản chất hóa học khác nhau. Các amin, các chất hữu
cơ có cấu trúc hóa học khác nhau.
Khả năng làm tăng hoạt tính của enzym của những chất hoạt hóa cũng có
một giới hạn nhất đònh, vượt quá giới hạn này rất có thể lại làm giảm hoạt tính của
enzym.

2.2. NHỮNG KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM CỐ ĐỊNH
2.2.1. Khái niệm, đặc điểm của enzym cố đònh
a. Khái niệm enzym cố đònh
Enzym cố đònh (immobilised enzym) hay enzym không hòa tan (insolube
enzym) được hiểu theo cả nghóa hẹp và nghóa rộng.
Theo nghóa hẹp : được hiểu theo Michael Trevan: thuật ngữ enzyme cố
đònh là những enzyme được đưa vào những pha riêng rẽ, pha này được tách riêng
với pha dung dòch tự do. Pha enzyme thường không tan trong nước và được gắn
với những polymer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.




Pha enzyme
// Pha dung dòch tự do
Hình 2.7 : Mô hình hệ thống hai pha của enzym cố đònh
Theo nghóa rộng : Theo Kkaus Mosbach : Các chất xúc tác cố đònh là
các enzyme, tế bào, cơ thể sống ở trạng thái cho phép sử dụng lại. Như vậy theo
nghóa rộng, enzyme không hòa tan bao gồm cả enzyme đã được cố đònh và một


9
chất mang, bao gồm cả enzyme có trong tế bào sống được cố đònh trong các bình
phản ứng sinh học có sự gắn kết vào một chất mang cho phép ta sử dụng nhiều lần.
Enzyme cố đònh thường là những enzyme hòa tan được gắn vào một chất
mang bằng nhiều kỹ thuật khác nhau. Nhờ quá trình gắn này enzyme chuyển từ
trạng thái hòa tan sang trạng thái không hòa tan.
b. Đặc điểm của enzyme cố đònh
Nhờ những tính chất ưu việt do đó ngày nay enzyme cố đònh đang ngày
càng sử dụng rộng rãi trong các lónh vực công nghệ : Những ưu điểm nổi bật của

enzyme cố đònh.
Enzyme là những chế phẩm sinh học đắt tiền, nếu sử dụng ở dạng hòa
tan thì chỉ sử dụng được một lần và khó thu hồi trở lại. Ngược lại khi enzyme được
cố đònh trên giá thể polymer nên có thể sử dụng liên tục trong nhiều ngày, thậm chí
hàng tháng mà không mất hoặc chỉ giảm hoạt tính, vì vậy rất kinh tế.
Do được cố đònh ở một pha riêng, do đó dễ dàng tách sản phẩm ra khỏi
enzyme, vì vậy sản phẩm dễ tinh sạch hơn do không trộn lẫn với enzyme. Điều này
đặc biệt có ý nghóa khi ứng dụng enzyme cố đònh trong dược học, trong công nghệ
sản xuất hóa chất và trong phân tích.
Có thể dừng hóa trình chuyển hóa ở bất kỳ giai đoạn nào cần thiết khi dễ
dàng tách enzyme cố đònh ra khỏi cơ chất trong trường hợp yêu cầu sản phẩm chỉ là
các sản phẩm trung gian của quá trình chuyển hóa.
– Khi được cố đònh trên giá thể enzyme có khả năng bền vững hơn, hoạt
tính ổn đònh hơn khi có những thay đổi của môi trường như nhiệt độ, pH,… so với
enzyme tự do. Nhờ được cố đònh trên giá thể nên enzyme ít bò biến tính hơn khi
môi trường thay đổi.
Sử dụng chế phẩm enzyme cố đònh, đặc biệt thích hợp với các qui trình
công nghệ liên tục, tự động hóa ngày nay. Thường thì enzyme cố đònh được nhồi


10
vào các cột, tháp, fermentor, với dòng cơ chất liên tục được chảy vào và đầu ra là
sản phẩm.
Tuy nhiên enzyme cố đònh cũng có những nhược điểm nhất đònh là vì
được cố đònh nên đã hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Vì vậy
hoạt tính riêng (specific activity) của enzyme cố đònh thường thấp hơn so với
enzyme tự do, đặc biệt là trong trường hợp cơ chất là các chất có trọng lượng
phân tử lớn như : protein, tinh bột, chitosan. Trong trường hợp enzyme được cố đònh
bằng phương pháp nhốt (entrapment method) trong khuôn gel thì chỉ một phần
enzyme nằm ở lớp vỏ ngoài của gel là hoạt động. Đặc biệt khi enzyme được cố

đònh bằng phương pháp cộng hóa trò thì một lượng đáng kể enzyme bò mất hoạt tính
do chất hoạt hóa và có thể do liên kết không đặc hiệu xảy ra ở trung tâm hoạt động
của enzyme.
2.2.2. Chất mang dùng để cố đònh enzyme
 Theo Michael Trevan, một chất mang lý tưởng cần có những tính chất
sau đây :
+ Chất mang lý tưởng trong sử dụng cố đònh enzyme điều trước hết là
cần phải rẻ. Điều này liên quan đến hiệu quả kinh tế của qui trình công nghệ.
+ Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn đònh.
+ Về mặt hóa học, chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường
phản ứng. Chất mang không được làm mất hoạt tính enzyme.
+ Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với sự tấn công
của vi sinh vật.
+ Chất mang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Tính
chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố đònh enzyme vừa tăng khả năng
tiếp xúc của cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme cố đònh và
số lần tái sử dụng.


11
+ Chất mang có thể có cấu trúc lỗ xốp, siêu lỗ, có thể sử dụng ở dạng
hạt, dạng màng, dạng phim mỏng …
 Phân loại chất mang :
Tất cả chất mang dùng trong cố đònh enzyme được chia làm 2 nhóm :
Chất mang polymer hữu cơ.
Chất mang vô cơ.
a. Chất mang là polymer hữu cơ
Trong nhóm chất mang là polymer hữu cơ được chia làm 2 nhóm là
polymer tổng hợp và polymer tự nhiên.
 Chất mang là polymer tự nhiên (natural polymer)

 Chất mang là polysaccharide (gluxit) :
Là nhóm chất mang đang thònh hành và được sử dụng rộng rãi nhất hiện
nay, đó là cellulose, agarose, dextran, sephadex và các dẫn xuất của chúng.
Agarose là vật liệu ổn đònh, đồng nhất dễ dàng tạo hạt. Tuy nhiên do
vấn đề về giá cả nên agarose chỉ thường được sử dụng trong nghiên cứu và mục
đích y học (theo signa : 800 2000 USD/kg).
Cellulose và các dẫn suất của chúng như CM Cellulose, DEAE
Cellulose có tính chất cơ lý khá tốt, giá rẻ nhưng lại không đồng nhất và ổn đònh
nên chỉ sử dụng ở dạng sợi và dạng vi hạt.
Alginate và carrageenam là hai loại vật liệu khá mới mẻ. Cả hai loại
vật liệu này tạo gel trong dung dòch CaCl
2
dùng để nhốt tế bào và enzyme. Tuy
nhiên, hai loại vật liệu này có một nhược điểm căn bản là gel không ổn đònh
trong môi trường có phosphate.
Tinh bột là vật liệu phong phú và rẻ tiền. Từ lâu tinh bột, tinh bột khâu
mạch, diathanolamin tinh bột đã được dùng làm chất mang cố đònh enzyme như
lipase, glucoisomerase, tripsin, amilase. Tuy nhiên tinh bột có nhược điểm là độ
trương còn hạn chế và thiếu các nhóm chức năng (functional groups). Vì vậy khả


12
năng cố đònh và hoạt tính enzyme cố đònh còn thấp : để khắc phục nhược điểm
này tinh bột thường được ghép copolymer với các vinyl monomer ưa nước,
acrylamide, acrylic acid vừa cải thiện tính chất cơ lý, độ trương, vừa tạo các
nhóm chức năng trên bề mặt như [ NH
2
], [ COOH] làm tăng diện tích tiếp xúc
và khả năng cố đònh enzyme.
Chitin và chitosan là vật liệu polymer có nhiều triển vọng trong cố

đònh tế bào và enzyme. Chitin là một polymer rất phổ biến trong tự nhiên, chỉ
đứng thứ hai sau cellulose, chitin có cấu trúc tương tự cellulose, là polymer của 2
acetomido deoxy D glucose. Chitin tham gia vào thành phần cấu
trúc của vỏ tôm cua, côn trùng, thành tế bào vi sinh vật. Chitosan là dẫn xuất
của chitin khi xử lý bằng kiềm đặc. Chitin, chitosan có cấu trúc siêu lỗ, dễ tạo
màng, tạo hạt, khả năng hấp thụ tốt, tính chất cơ lý bền vững, ổn đònh, thường
được dùng cố đònh enzyme qua cầu nối glutaraldehyde.
Tuy nhiên cả chitin và chitosan đều có một nhược điểm là tính chất kỵ
nước, độ trương kém, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ. Để khắc phục nhược điểm này,
hiện nay đang có xu hướng ghép copolymer với monomer ưa nước như acrylamide,
acrylic acid, hydroxy ethylmethacrylate.
Hiện nay, cũng có xu hướng chung là các vật liệu tự nhiên được ghép
copolymer với các polymer tổng hợp để cải thiện tính chất cơ lý.
 Chất mang là Protein :
Chất mang là protein thường dùng là getalin, keratin, albumin. Vật liệu
thuộc nhóm này thường dễ tạo màng, tạo hạt, có nhóm chức năng là nhóm NH
2

và vì vậy thường dùng sử dụng nhốt enzyme trong khuôn gel với tác nhân khâu
mạch là glutaraldehyde. Nhóm chất mang này là protein có nhược điểm là thường
kém bền, dễ nhiễm khuẩn.




13
 Chất mang là các polymer tổng hợp :
Hiện nay có rất nhiều polymer tổng hợp được sử dụng làm chất mang cố
đònh enzyme như polyacrylamide, polyester, polyvinilalcohol, polyvinylacetate,
polyacrylic, polyhydroxylethylacrylate, polystyren, polyethylen ghép với vinyl

monomer, …Ưu điểm chung của các polymer tổng hợp là bền, tính chất cơ lý tốt,
hoàn toàn trơ với sự tấn công của vi khuẩn, độ trương tốt, một số polymer có thể
điều chỉnh được kích thước siêu lỗ, …
– Polyhydroxyethylmethacrylate : khả năng tương hợp sinh học kém và
một nhược điểm quan trọng nữa là do quá bền vững, không phân hủy trong tự
nhiên. Vì vậy gây ô nhiễm môi trường. Đây là vấn đề quan trọng đòi hỏi con người
cần quan tâm giải quyết.
– Polyacrylamide là một polymer rất đồng nhất, độ trương tốt, kích thước lỗ
gel có thể điều chỉnh được và diện tích bề mặt tiếp xúc lớn. Polyacrylamide và
polyacrylate thường được nạp vào cột, và có rất nhiều dạng khác nhau như polymer
có nhóm amin hoặc aldehyde. Phương pháp cố đònh chủ yếu là nhốt enzyme tế bào
trong khuôn gel khi được polymer bằng hóa chất như ammoniumpersulphate, bức
xạ gamma, tia rơnghen, thường thì để tăng khả năng khâu mạnh của gel poly
acrylamide, cần phải bổ sung thêm N, N methylenbisacrylamide làm chất khâu
mạch (crosslinking agent). Ngoài ra còn có thể cố đònh enzyme trên các vật liệu
này bằng phương pháp hấp thụ, liên kết cộng hóa trò và microcapsule.
b. Chất mang vô cơ
Ngoài các polymer được sử dụng làm chất mang, còn có một số chất mang
vô cơ đã được sử dụng thương mại như sợi bông thủy tinh (contra pore glass), oxyde
silica, oxyde nhôm, oxyde magie. Đây là những dạng oxyde có cấu trúc lỗ và có
khả năng hấp thụ tốt. Một số vấn đề cần chú ý khi dùng các vật liệu có nguồn gốc
từ silic là khá đắt tiền, nên chỉ sử dụng trong sắc ký lọc gel và cố đònh những
enzyme đặc biệt. Nhược điểm của các vật liệu này là tan trong kiềm, có pH > 7.5.


14
Để hạn chế điều này pore glass, pore silics được phủ lớp ziconia để tạo một lớp ổn
đònh với kiềm, hoặc để tránh vấn đề này có thể sử dụng ceramic xốp để cố đònh
enzyme.
Gần đây một số vật liệu vô cơ được giới thiệu thương mại hóa là các sản

phẩm diatomic, có tên thương mại là celite. Đây là một vật liệu không đồng nhất,
chứa nhiều ion kim loại, là loại vật liệu rẻ tiền, nhưng có rất nhiều ứng dụng trong
công nghiệp, đặc biệt là trong cố đònh enzyme và trong công nghiệp.
Vật liệu từ tính (magnetic materials) có rất nhiều dạng đã được sử dụng
trong cố đònh enzyme. Burns đã so sánh dạng hạt của vật liệu từ tính với các vật
liệu khác và với sự cải tiến của tổ hợp alginite/ vi hạt từ tính. Alginite thường sử
dụng ở dạng cộng hóa trò vì ligand với enzyme hơn là ở dạng nhốt. Vi hạt
(microphere) của vật liệu alginite/ vi hạt từ tính có tính chất cơ lý tốt, diện tích bề
mặt và độ phân tán tốt, các khả năng cố đònh bằng phương pháp cộng hóa trò cao.
Những ứng dụng của vật liệu này vô cùng phong phú.
2.2.3. Các phương pháp cố đònh enzyme
Hiện nay có 4 phương pháp chính điều chế enzyme cố đònh dựa trên cơ sở
lý hóa học như sau :
– Phương pháp hấp thụ vật lý enzyme lên các vật liệu cố đònh không
hòa tan có mang hoặc không mang điện tích.
– Phương pháp nhốt enzyme ở bên trong polymer tạo thành xung quanh
enzyme một hệ thống lưới có lỗ nhỏ để không cho phân tử enzyme đi khỏi
màng, nhưng các lỗ đủ lớn để cơ chất và sản phẩm tạo ra đi qua được dễ dàng.
– Phương pháp hóa học : liên kết cộng hóa trò và liên lết ion.
– Phương pháp khâu mạch.
a. Phương pháp hấp thụ vật lý (Physical Absortion)
Phương pháp này có ứng dụng rộng rãi, đặc biệt là trong giai đoạn đầu của
việc nghiên cứu enzyme cố đònh. Quá trình thực hiện hấp thụ khá đơn giản : chất


15
hấp thụ và enzyme được trộn lẫn với nhau, ủ một thời gian rồi lọc, rửa phần
enzyme không hấp thụ. Enzyme gắn được trên giá thể nhờ tương tác của các liên
kết yếu như liên kết : ion, kỵ nước, hydrogen và lực Vander Waals. Khả năng hấp
thụ của enzyme phụ thuộc vào các điều kiện môi trường như : nhiệt độ, nồng độ

enzyme, diện tích bề mặt tiếp xúc của vật liệu cố đònh.
Vật liệu cố đònh hữu cơ chủ yếu được sử dụng là các dẫn xuất của
polysacchride tự nhiên như : cellulose và dextran. Theo Mitz và Schlueter thì các
enzyme có tính acid như pepsin dễ dàng kết hợp với DEAE Cellulose, còn các
enzyme có tính kiềm như trypsin và chymotrypsin thì kết hợp dễ dàng với CM
cellulose, phosphate cellulosehoặc citrate cellulose. Các dẫn xuất cellulose này có
thể gắn được 2 50% enzyme.
Vật liệu cố đònh vô cơ như: thủy tinh xốp, silicagel, cytochrom cũng được
sử dụng, các vật liệu này có ưu điểm là chúng có khả năng thay đổi độ xốp lớn và
có khả năng hấp thụ cao đối với protein.
Phương pháp này có nhược điểm là quá trình giải hấp thụ enzyme (enzyme
cố đònh trở thành dễ hòa tan) dễ dàng xảy ra khi thay đổi pH, nhiệt độ và thành
phần ion.
 Yếu tố ảnh hưởng đến khả năng cố đònh của vật liệu
Nồng độ enzyme : nồng độ enzyme càng cao thì sự hấp thụ càng nhiều,
theo công thức của Freundlick.
2
.
1
K
CKm

Với : K
1
, K
2
hằng số.
m số lượng enzyme có khả năng hấp thụ lên bề mặt vật liệu.
C : Nồng độ enzyme
Công thức của Langmuiz :

CK
CKK
m
.1
..
2
21



16
Thời gian tiếp xúc : cho enzyme tiếp xúc với bề mặt của vật liệu cố
đònh, tốc độ hấp thụ phụ thuộc vào đặc tính lý hóa của chất hấp thụ và enzyme.
Kích thước của vật liệu cố đònh : tốc độ hấp thụ càng tăng khi kích
thước càng giảm.
Nhiệt độ : khi nhiệt độ tăng, tốc độ hấp thụ tăng, quá trình hấp thụ xảy
ra rất nhanh chỉ sau vài phút thì enzyme sẽ hấp thụ lên trên bề mặt.
pH : quá cao hoặc quá thấp đều làm giảm khả năng hấp thụ, thông
thường sự hấp thụ tối đa ở pH điểm đẳng điện.
Thành phần môi trường : các chất làm giảm tính hòa tan của enzyme
trong pha nước, sẽ làm tăng khả năng hấp thụ. Như vậy muốn hấp thụ càng
nhiều, càng làm giảm tính hòa tan của enzyme.
b. Phương pháp “nhốt” enzyme (Entrapment Method)
Đây là phương pháp đơn giản, enzyme ít bò biến đổi bởi quá trình cố đònh.
Phương pháp này có thể cố đònh nhiều enzyme cùng một lúc. Giới hạn của phương
pháp này là hạn chế khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, do đó hoạt tính
enzyme thường thấp, nhất là trong trường hợp cơ chất có trọng lượng phân tử lớn.
Enzyme được bao bọc trong một màng không thẩm thấu đối với enzyme và
các chất có trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm thẩm thấu
qua một cách dễ dàng. Phương pháp này cho phép giữ enzyme trong dung dòch gần

giống với tự nhiên và sử dụng enzyme nhiều lần vì có thể tách và thu nó dễ dàng
khỏi sản phẩm của quá trình phản ứng bằng cách lọc.
Các phương pháp nhốt enzyme trong màng bán thấm :




Hình 2.8: Nhốt Enzym trong sợi có lỗ nhỏ
E
E
E


17



Hình 2.9: Enzym được nhốt trong sợi mãûnh




Hình 2.10: Nhốt enzym trong gel Hình 2.11: Nhốt enzym trong micro – capsule
 Nhốt trong cấu trúc mạng Gel
Enzyme được nhốt trong cấu trúc mạng gel của các polymer như poly
sacchride, protein, polymer tổng hợp như polyacrylamide, polyhydroethylacrylate …
Các polysaccharide thường dùng là gel alginate và carrageenan là các poly anion
dễ dàng tạo hạt trong dung dòch muối Ca, K và không bền trong môi trường có
phosphate. Khắc phục nhược điểm này bằng cách cho gel khâu mạch trong dung
dòch glutaraldehyde. Gel chitosan ổn đònh hơn, chitosan được tạo hạt trong dung

dòch khâu mạch là polyphosphate, K
4
Fe(CN)
6
thường được sử dụng nhốt tế bào và
enzyme.
Protein thường dùng là gelatin, enzym được trộn với gel gelatin sau đó được
khâu mạch trong dung dòch glutaraldehyde hoặc aldehyte collagen là vật liệu
protein có thể dùng để nhốt enzyme trong gel của nó, nhờ khả năng khâu mạch của
gel trong dung dòch khâu mạch glutaraldehyde khi được khâu mạch hạt gel không
tan và ổn đònh cao.
E
E
E
E
E
E


18
 Giới thiệu về gel alginate thương phẩm
Là loại vật liệu thích hợp nhốt enzyme. Phương pháp tạo hạt rất đơn giản. Hỗn
hợp enzyme và alginate được nhỏ xuống dung dòch CaCl
2
để tạo hạt gel bao bọc
lấy enzyme.
Sản phẩm khi hòa tan hoàn toàn trong nước sẽ tạo thành dạng gel liên kết
thành một chuỗi các polyanion với sự sắp xếp của 2 thành phần: mannuronate và
glucuronate có thể là một chuỗi (M M M) (G G G) hoặc có thể đó là (M
G M G). Tỉ lệ cao của glucuronate làm gia tăng sự bền vững của gel.

Cấu trúc liên kết do Phillips, Wedlock and Williams đưa ra :





Khi cho hỗn hợp enzyme và sodium alginate nhỏ từng giọt xuống dung dòch
CaCl
2
sẽ tạo thành những hạt kết tủa có cấu trúc bền vững (0.5 4mm) chứa
enzyme bên trong. Enzyme được bao bọc trong một màng không thẩm thấu đối với
enzyme và các chất có trọng lượng phân tử cao, nhưng lại cho cơ chất và sản phẩm
thẩm thấu qua một cách dễ dàng. Điều này cho phép giữ enzyme trong dung dòch
gần giống với tự nhiên và sử dụng enzyme nhiều lần.







Enzyme + alginate
CaCl
2
Hạt Calcium
alginate với
enzyme cố đònh

19
Phương trình phản ứng :
NainateACaCainateANa 2)lg()lg(2
2

 Đặc điểm của gel alginate
Gel alginate có khả năng nhốt một lượng lớn tế bào và enzyme, hiệu suất
nhốt enzyme cao, thao tác và kỹ thuật tiến hành đơn giản.
Hạt gel có kích thước có thay đổi từ 0.5 4mm. Hạt có cấu trúc bền
vững. Để ổn đònh hạt gel có thể cho hạt gel khâu mạch trong dung dòch
glutaraldehyde hoặc các chất khâu mạch khác. Tuy nhiên gel này lại không bền
trong môi trường có phosphate.
 Phương pháp nhốt gel trong hệ sợi
Năm 1972, Dinelli đã tiến hành một thí nghiệm khá độc đáo là nhốt
enzyme trong hệ sợi và những nghiên cứu này được kết thúc năm 1978. Theo kết
quả nghiên cứu của Dinelli, enzyme khi được nhốt vào hệ sợi phát huy khả năng
xúc tác rất tốt.
Phương pháp nhốt enzyme trong hệ sợi có khả năng xúc tác phản ứng tốt
hơn phương pháp nhốt enzyme trong gel. Các sợi sử dụng để nhốt enzyme thường
là sợi nhân tạo. Các loại sợi này có độ bền với acid, kiềm, các loại ion và các loại
dung môi hòa tan. Tính chất trên phụ thuộc rất nhiều vào bản chất hóa học của các
polymer tạo ra loại sợi này.
 Phương pháp tạo vi nang (microcapsule)
Khác với phương pháp nhốt trong gel, ở phương pháp này enzyme được
nhốt trong một màng bán thấm, nhưng cơ chất và sản phẩm dễ dàng đi qua. Vì hoạt
động trong môi trường dung dòch, nên khả năng tiếp xúc giữa cơ chất và enzyme
lớn hơn trong trường hợp nhốt trong khuôn gel.


20

Hình 2.12: Qui trình nhốt enzyme trong microcapsule
 Phương pháp siêu lọc (ultrafilitration)
Nguyên tắc của phương pháp này cũng tương tự phương pháp micro
capsule. Enzyme được giữ lại trong các màng, sợi siêu lọc. Phương pháp này đã
được ứng dụng cố đònh glucose amylase, glucose isomerase, galactosidase.
c. Phương pháp hóa học
 Liên kết cộng hóa trò
Cố đònh enzyme bằng liên kết cộng hóa trò với các polymer đã được hoạt
hóa, là một trong những phương pháp cố đònh enzyme phổ biến nhất, đảm bảo liên
kết vững chắc của enzyme với vật liệu cố đònh.
 Ưu điểm
Do liên kết chặt chẽ với vật liệu cố đònh bằng liên kết cộng hóa trò, nên
enzyme không bò ly giải trong suốt quá trình sử dụng.
Enzyme dễ dàng tiếp xúc cơ chất do enzyme được gắn trên bề mặt vật
liệu cố đònh.
Enzyme có khả năng ổn đònh với sự thay đổi nhiệt độ.
Monomer ưa nước
Pha nước
Pha hữu cơ
Monomer
kỵ nước

hóa
polymer
polymer


21
 Nhược điểm
Enzyme có thể bò mất hoạt tính vì cấu trúc của enzyme bò thay đổi do quá
trình liên kết.
Giảm khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất do đó làm giảm hoạt
tính enzyme cố đònh.
Vật liệu cố đònh không tái sử dụng được, phương pháp này áp dụng cho
các enzyme ổn đònh hoạt tính khi cố đònh.
 Enzyme cố đònh có thể tạo ra bằng hai cách
– Nối đồng hóa trò liên kết các phân tử enzyme riêng biệt lại thành một
liên hợp cao phân tử không hòa tan. Đây là phương pháp không sử dụng chất mang.
Các phân tử enzyme sẽ liên kết với nhau qua các cầu nối trung gian để trở thành
dạng không hòa tan. Các cầu nối trung gian thường dùng là glutaraldehyte.
– Kết hợp phân tử enzyme với vật liệu cố đònh không hòa tan bằng liên
kết cộng hóa trò.
Điều chế các enzyme cố đònh loại 1, khi dùng các tác nhân lưỡng chức như
bisdiazobenzidin, bisdiazobenzidin, 2,2’ disulfur acid và một số hợp chất khác. Đặc
biệt người ta thường dùng glutaraldehyte làm tác nhân để đính các phân tử enzyme
lại với nhau.
Các enzyme cố đònh loại 2 thường được điều chế phổ biến hơn. Chất mang để
cố đònh enzyme phải thỏa mãn những đòi hỏi nhất đònh sau :
Có độ hòa tan thấp và bền vững đối với các tác động cơ học và hóa học
nhất đònh …
Không gây tác dụng kìm hãm đến enzyme.
Không tạo ra hiện tượng hấp thụ không đặc hiệu đối với các protein.

Vì phản ứng enzyme thường xảy ra trong môi trường nước, nên vật liệu
cố đònh tốt hơn cả là có chất ưa nước.


22
Trò số và dấu điện tích của vật liệu cố đònh cũng có vai trò nhất đònh.
Việc gắn enzyme có hiệu quả hơn cả khi điện tích của enzyme và của vật liệu cố
đònh có dấu ngược nhau. Vì lẽ điện tích cùng dấu có thể ngăn cản sự liên kết.
Quá trình cố đònh enzyme có thể xảy ra qua một giai đoạn nếu vật liệu cố
đònh cố đònh có chứa các nhóm có khả năng tham gia tương tác trực tiếp với nhóm
amin của enzyme. Trường hợp ngược lại quá trình xảy ra qua 2 giai đoạn :
 Giai đoạn hoạt hóa vật liệu cố đònh bằng cách đưa vào các nhóm chức
năng có khả năng phản ứng hơn.
 Giai đoạn hai giai đoạn kết hợp enzyme.
Trường hợp không cần hoạt hóa vật liệu cố đònh thể hiện rõ trong trường hợp
copolymer của maleic alhydric và ethylen. Copolymer được dùng phổ biến làm vật
liệu cố đònh để điều chế các dẫn xuất không tan của protease và một số enzyme khác.
Trường hợp hoạt hóa vật liệu cố đònh :
 Hoạt hóa chất mang bằng cyanogen halogenur :
Các chất mang có bản chất là polysaccharide ( OH) thường được hoạt
hóa sơ bộ bằng cyanogen halogenur. Phản ứng hoạt hóa xảy ra trong môi trường
kiềm. Chất mang hoạt hóa có khả năng liên kết cộng hóa trò với [ NH
2
] của
protein của enzyme.
Porath và Bar Eli lần đầu tiên hoạt hóa cellulose, agarose và dextran
bằng phương pháp này. Quá trình diễn ra như sau:
Khi xử lý polysaccharide bằng BrCN sẽ tạo ra imidocarbonate. Carbonate
bền vững, còn imidocarbonate tương tác với [ NH
2

]


23

NH C
O
O


OH
N CNOH

OH
OH

CNBr


+ ENZYME + ENZYME

OH
ENZYMENHCO
NH

OH
ENZYMENHCO
O

 Hoạt hóa bằng ethyl chloroformate :

Khi sử dụng phương pháp hoạt hóa bằng cyanogenbromide, Cyanogenbromide
và các sản phẩm trung gian rất độc. Chloroformate có thể được sử dụng để tạo ra
các sản phẩm trung gian tương tự nhưng không có độc tính. Phương pháp được
thực hiện như sau :
OH
ENZYMENHCO
O


O C
O
O

HCClO
OH
OH
ENZYM

522


 Hoạt hóa bằng carbodiimide
Các chất mang có chứa nhóm carboxyl, có thể được hoạt hóa bằng các
dẫn xuất carbodiimide. Phản ứng xảy ra trong môi trường acid yếu (pH = 5), nên
phương pháp hoạt hóa này phù hợp với các enzyme amylase, pepsin, cellulase …


24
ENZYMNHC
O

R'
N
C CO
NH O


HOC
O
ENZYMR'NCNR
R

 Hoạt hóa bằng glutaraldehyde
Các chất mang có chứa nhóm NH
2
như polyacrylamide,chitin, chitosan,
cellulose, tinh bột ghép acrylamide đều có thể sử dụng phương pháp này.
Glutaraldehyde là chất có chứa hai nhóm aldehyde hoạt hóa. Một nhóm sẽ gắn
với NH
2
của chất mang, nhóm còn lại sẽ gắn vào NH
2
của enzyme.
OCH
CH
CH
CH
OCH
2

2
2
22

22

22

CHCHC
OCH
CHCHCHC
OCH
CHCHCHC
OCH
CH

22

22

22

CHCHCH
OCH
CHCHCH
ENZYMNCH
CHCHCH
OCH
NH

CH

 Hoạt hóa bằng 3 aminopropyltriethoxysilane
Hoạt hóa bằng trialkoxysilane cho phép hoạt hóa những vật liệu trơ như
thủy tinh có thể gắn với enzyme. Thực hiện như sau :
ENZYM
+ ENZYM


25
232
232
NH)Si(CHO)H(C
NH)(CHSiOSiO
O O
NH)(CHSiOSiO
O
OHSiO
O
OHSiO
O
232352


2
CClS


NCS)(CHSiOSiO
O O

NCS)(CHSiOSiO
O
32
32

+ ENZYM
ENZYMNHCNH)(CHSiOSiO
S O O
ENZYMNHCNH)(CHSiOSiO
S O
32
32

 Hoạt hóa bằng azide
Hiện nay phương pháp này được xem là phương pháp hàng đầu. Các
chất mang có chứa nhóm chức COOH như CM Cellulose, polyacrylamide và
nylon có thể hoạt hóa bằng phương pháp này. Trước hết là ester hóa CM
Cellulose. Sau đó chuyển ester thành hydrazide, rồi azide. Azide trong môi
trường kiềm sẽ phản ứng [ NH
2
] của enzyme. Phản ứng xảy ra theo sơ đồ :
Glass