Luận văn : Cố định enzyme – amylase bằng gel alginate part 4 doc

31
Clark dùng điện cực alcohol oxydoreductase để xác đònh nồng độ cồn.
Ngoài ra enzyme còn có thể dùng vào nhiều mục đích khác nhau như:
hoạt hóa zymogen, nghiên cứu cấu trúc phân tử protein, sử dụng phương pháp
sắc ký ái lực để tinh chế một số chất có khả năng liên kết đặc biệt với enzyme.
Ngày nay có nhiều qui trình sử dụng chế phẩm tế bào cố đònh để xử lý nước thải
đạt hiệu quả.
Các nghiên cứu về màng enzyme cố đònh ngày càng tăng, những kết
quả đạt được cũng phụ thuộc nhiều vào tính chất của màng dùng để gắn enzyme.
Trên cơ sở nghiên cứu tính chất của enzyme cố đònh sẽ góp phần giải
quyết nhiều vấn đề lớn khác nhau như :
– Giải thích toàn diện hơn chức năng xúc tác sinh học trong tế bào sống
và điều hòa hoạt động enzyme trong tế bào.
– Điều hòa tính thấm của màng và khuếch tán qua màng.
– Đặc tính của phản ứng enzyme ở giới hạn phân cách giữa các phase
của màng, trong môi trường kỵ nước, môi trường nước trong màng tế bào.
Ngày nay, việc nghiên cứu enzyme cố đònh được tiến hành theo hướng
ngày càng phức tạp dần, mô hình từ một enzyme riêng lẻ đến hệ thống nhiều
enzyme, sẽ tiến đến tạo những cấu trúc trên phân tử có trật tự bao gồm nhiều phức
hệ enzyme. Nghiên cứu quá trình xúc tác nhờ các hệ thống phức tạp sẽ giúp hiều
biết đầy đủ cơ chế các quá trình trao đổi chất của tế bào.
2.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH
2.4.1. Các nghiên cứu trong nước
Việc nghiên cứu và ứng dụng enzyme cố đònh ở Việt Nam chưa phổ biến
lắm và vẫn còn được xem là hướng mới mẻ, kết quả thu được còn hạn chế.
Tuy nhiên, gần đây đã có một số cuộc thử nghiệm về vấn đề cố đònh
enzyme ở tế bào vi sinh, enzyme trích từ động vật, thực vật trong đó nổi bật là :

32
 Nhóm nghiên cứu của GS TS Nguyễn Văn Uyển thử nghiệm sản
xuất cồn bằng kỹ thuật cố đònh tế bào nấm men Saccharomyces Cerevisiae trên
gel calcium alginate. Phương pháp này không đòi hỏi thiết bò phức tạp và có thể
thực hiện nhanh chóng. Ưu điểm phương pháp sản xuất liên tục nên năng suất
tạo cồn tăng, ít đầu tư vốn, nấm men hoạt động liên tục (100 ngày) thay vì phải
cấy và nhân giống hàng ngày nếu theo qui trình cũ.
 Nhóm nghiên cứu của Viện Sinh Học Nhiệt Đới kết hợp với bộ môn
sinh hóa trường Đại học Khoa Học Tự nhiên năm 1994 nghiên cứu thử nghiệm
tạo pepsin cố đònh và năm 1995 thử nghiệm tạo pancreatin cố đònh trên
cytochrom. Kết quả thu được mở ra hướng nghiên cứu tiếp theo cho các enzyme khác.
 Phòng nghiên cứu công nghệ bức xạ Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân Đà
Lạt có nhiều công trình nghiên cứu enzyme cố đònh trên tế bào vi sinh và các
chất có hoạt tính sinh học bằng kỹ thuật bức xạ như cố đònh glucoamylase,
protease, vi khuẩn tả (Vibrio Cholerae), tế bào nấm men (Saccharomyces
Serevisae), vi khuẩn xử lý nước thải (Pseudomonas Maltophila) và progesteron
trên các giá thể polymer tổng hợp.
 Nghiên cứu của Nguyễn Anh Dũng tại Viện Nghiên Cứu Hạt Nhân
Đà Lạt năm 1999 ứng dụng kỹ thuật bức xạ theo 2 hướng chính là : chế tạo vật
kiệu tương hợp sinh học và cố đònh các chất có hoạt chất sinh học lên các vật
liệu polymer ghép bằng bức xạ. Để chế tạo vật liệu tương hợp sinh học thường
dùng phương pháp copolymer hóa các monomer với polymer và phương pháp
khâu mạch bức xạ.
Để cố đònh các chất có hoạt chất có hoạt tính sinh học bằng cách tạo liên
kết với polymer hoặc nhốt trong polymer. Tác giả đã cố đònh được trypsin trong gel
chitosan g.co HEMA tránh sự tác động trực tiếp của bức xạ có thể đáp ứng
được yêu cầu ứng dụng trong công nghiệp.


33

2.4.2. Các nghiên cứu ngoài nước
 Enzyme cố đònh đã được các nhà khoa học quan tâm và đưa ra nhiều
hướng nghiên cứu từ rất lâu. Năm 1916 khi Nelson và Griffin quan sát khả năng
thủy phân đường saccharose bằng invertase ở nấm men hấp thụ trên than hoạt tính.
 Sau đó đến năm 1953, Grubhofer và Schleith cố đònh carboxipeptidase,
pepsin, ribonuclease bằng liên kết cộng hóa trò trên nhựa polyaminostyren được
diazo hóa.
 Vào năm 1963 Bernfeld và Wan đã mô tả phương pháp nhốt. Các
enzyme trypsin, papain, amylase và ribonuclease trong gel polyacrylamide.
 Vào năm 1964, Richard lần đầu tiên dùng glutaraldehyde 1% để điều
chế ra carboxypeptidase axit amin ở dạng tinh thể không tan, sau khixử lý enzyme
vẫn không thay đổi hình dạng và giữ được 30% hoạt độ ban đầu. Cùng năm này
Chang đã nhốt enzyme hydratase trong các vi hạt.
 Năm 1970, Mosbach đã cố đònh 3 loại enzyme : galactosidase,
hexokinase và gluco 6 phosphate dehydrogenase được gắn bằng liên kết đồng
hóa trò lên hạt sephadex và hiệu quả của phản ứng được xúc tác bởi enzyme liên
kết là cao hơn nhiều.
 Cùng năm này Bernty đã dùng glucooxidase gắn bằng liên kết đồng hóa
trò ở trong cột polystirol để xác đònh tự động glucose.
 Năm 1971, người ta đã thành công trong việc dùng chymotrypsin liên
kết đồng hóa trò với các carboximethyl cellulose để làm đông tụ sửa thay cho
renin đắt tiền.
 Năm 1974, Ichiro Chibata và 1976 Koro Yamoto lần đầu tiên thành
công trong việc sản xuất enzyme cố đònh đem ứng dụng trong sản xuất công
nghiệp, tạo ra sản xuất là L– malic và acid fumaric người ta dùng vật liệu cố đònh
là polyacryllamide và carrageenan được hoạt hóa bởi glutaraldehyde và hexamethyl
enediamine để cố đònh tế bào vi sinh. Dùng carrageenan để cố đònh nhiều loại tế


34

bào vi sinh thì có kết quả tốt hơn dùng gel polyarylamide trong sản xuất công
nghiệp.
 Năm 1978 Sten Ohlsan, Per Olof Larsson và Klaus Mosbach cố đònh tế
bào vi sinh Artbrobacter simplex bằng gel calcium alginate.
 Năm 1979 Yodogawaku (Japan) đã sử dụng tế bào B. Flavum cố đònh
trên carrageenan để thực hiện phản ứng chuyển từ L– fumaric tạo ra sản phẩm L –
malic với hiệu suất thu sản phẩm cao hơn.
 Ngày nay, những enzyme đắt tiền đang được chú ý đặc biệt để nghiên
cứu và đưa vào ứng dụng trong sản xuất công nghiệp với dạng enzyme cố đònh.
Ngoài việc cố đònh tế bào vi sinh, người ta còn cố đònh lục lạp, ty thể, trên các vật
liệu cố đònh khác nhau. Từ đó mở ra một hướng mới trong việc sử dụng tế bào vi
sinh vật và cao hơn nữa là cơ quan của thực vật, động vật để sản xuất các hợp chất
thứ cấp có hoạt tính sinh học và có giá trò kinh tế hơn.
2.5. GIỚI THIỆU TỔNG QUAN VỀ ENZYME AMYLASE
amylase có khả năng phân cắt các liên kết 1,4 glucoside nằm
phía trong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên không theo một trật tự nào cả.
Quá trình thủy phân tinh bột bởi amylase là một quá trình đa giai đoạn.
Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa) chỉ một số phân tử cơ chất bò thủy phân tạo
thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp ( dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột
giảm nhanh. Sang giai đoạn hai (giai đoạn đường hóa) các dextrin phân tử thấp vừa
được tạo thành bò thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra trimaltose không bắt màu với
iodine. Các chất này bò thủy phân rất chậm bởi amylase cho tới di và
monosaccharide. Dưới tác dụng của amylase, tinh bột bò phân giải khá nhanh
thành oliigosaccharide gồm 6 7 gốc glucose. Sau đó các polyglucose này lại bò
phân cắt tiếp nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bò phân giải chậm
đến maltotetrose và matotriose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy
phân bởi amylase chứa 13% glucose và 87% maltose, tác dụng của


35

amylase không phân cắt được liên kết 1,6 glucoside ở chỗ mạch nhánh trong
phân tử amylopectin nên dù có chòu tác dụng lâu dài thì trong sản phẩm cuối cùng,
ngoài các đường nói trên (72% maltose, 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp
và izomaltose (8%).tóm lại dưới tác dụng của amylase, tinh bột có thể chuyển
thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp.
2.5.1 Đặc tính
Trung tâm hoạt động của amylase có chứa nhóm [ COOH] và [NH
2
].
amylase dễ tan trong nước, trong các dung dòch muối và rượu loãng.
Protein của amylase có tính acid yếu và tính chất của globulin.
Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH 4.2–5.7. Phân tử lượng của
amylase từ các nguồn gốc khác nhau rất khác nhau (của nấm mốc 45.000 50.000,
của malt 59.000) (Knin 1956; Fisher, Stein 1970).
amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim). Các amylase
đều chứa từ 1 30 nguyên tử gam Ca/mol. Song không ít hơn 1 6 nguyên tử
gam Ca/mol. Khi tách hoàn toàn Ca ra khỏi protein của enzyme thì amylase
mất hết khả năng thủy phân cơ chất. Và Ca tham gia vào sự hình thành và ổn
đònh cấu trúc bậc ba của enzyme, duy trì cấu hình hoạt động của enzyme
(Molodova, 1956) . Ca còn có tác dụng đảm bảo cho amylase có độ bền cực
lớn đối với các tác động gây biến tính và sự phân hủy bởi các enzyme phân giải
protein. amylase bền nhiệt hơn so với các loại amylase khác. Người ta cho
rằng đặc tính này của amylase có liên quan đến hàm lượng của Ca trong
phân tử của nó ( amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa Ca nhiều hơn
amylase của nấm mốc 3 4 lần nên nó bền nhiệt hơn). Tất cả những
amylase đều bò kìm hãm bởi những kim loại nặng như : Cu
2+
, Li
+
, Mg

2+
, Cr
3+,

Mn
2+
, Zn
2+
, Co
2+
, Sn
2+
,…


36
amylase từ các nguồn gốc khác nhau có thành phần amino acid khác
nhau. Mỗi loại amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng song chúng
đều khá giàu tyrosine và tryptophan. Các glutamic acid và aspatic chiếm ¼
tổng lượng amino acid cấu thành phân tử enzyme. Trong amylase rất ít
methionine và chỉ có khoảng 7 10 gốc cysteine, trừ amylase của Bac. Subtilis
không có các liên kết sulfhydryl và disulfhydryl.
Điều kiện hoạt động của amylase từ các nguồn khác nhau cũng khác
nhau. pH tối thích cho hoạt động của amylase từ nấm sợi là 4,5 4,8 (có thể
hoạt động tốt trong vùng pH 4,5 4,8) của đại mạch nẩy mầm là 5,3 và của vi
khuẩn là 5,8 6,0 (hoạt động tốt trong vùng pH 5,8 7,0).
Độ bền đối với tác dụng acid cũng khác nhau. amylase của nấm sợi
bền vững với acid tốt hơn là của malt và vi khuẩn. Ở pH 3,6 và 0
0
C amylase

của malt bò vô hoạt hoàn toàn sau 15–30 phút, amylase của vi khuẩn bò vô
hoạt 50% trong khi đó hoạt lực của amylase của nấm sợi hầu như không
giảm bao nhiêu (Fenilxova, Rmoshinoi, 1989).
Ở pH <4,0 amylase của vi khuẩn bò vô hoạt hoàn toàn (Virits, 1971)
amylase của nấm sợi rất nhạy với nhiệt (nhiệt độ tối thích 50
0
C) Amylase
của thóc mầm và của malt bền nhiệt hơn và hoạt động tối thích ở 58 60
0
C,
amylase của vi khuẩn có độ bền cao hơn cả.
2.5.2. Giới thiệu về enzyme Termanyl
Termanyl là chế phẩm enzyme dạng nước chứa amylase chòu được
nhiệt độ cao và được sản xuất bởi chủng men Bacillus Licheniformis (enzyme này
là một amylase thủy phân liên kết) 1.4 glucosidic thành amylose và
amylosepectin.
a. Một số ứng dụng của termamyl trong công nghiệp (thông tin do hãng
Novo cung cấp) :


37
Trong kỹ nghệ tinh bột : Termamyl được dùng cho việc dòch hóa liên tục
tinh bột trong nồi hơi hoặc trong những thiết bò tương tự hoạt động ở nhiệt độ từ 105
110
0
C và vì vậy lợi dụng được tính ổn đònh nhiệt độ cao của enzyme.
Trong kỹ nghệ nấu cồn : Termamyl được dùng để phân tán tinh bột khi
nghiên cứu và chưng cất. Và ở giai đoạn này, cũng lợi dụng được độ ổn đònh nhiệt
của enzyme
Trong kỹ nghệ nấu bia : Termamyl được dùng để giúp cho việc dòch hóa

được dễ dàng. Do độ ổn đònh nhiệt độ cao của enzyme.
Trong kỹ nghệ đường : Termamyl được sử dụng để phá vỡ lượng tinh bột
hiện diện trong mía.
Trong kỹ nghệ dệt : Termamyl được sử dụng ở tốc độ cao, nhiệt độ cao
để rủ hồ trước khi nhuộm. Loại enzyme kỹ thuật được áp dụng cho công nghệ này.
b. Hoạt tính của enzyme thương phẩm
Các thông số về hoạt tính
Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme trong điều
kiện thử nghiệm :

– Chất nền : 0,5%
tinh bột.
– Chất ổn đònh :
30 – 60 ppm Ca.







300

225

150

75

4
6
8
10




90
0
C

60
0
C

37
0
C

Hoạt tính (Knu/g)


38
Hình 2.13: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của enzyme Termanyl tại các nhiệt độ


39

– Chất nền : 0,5%
tinh bột.
– Chất ổn đònh :
30 – 60 ppm Ca.
– pH : 5.7




Hình 2.14: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của enyme Termamyl
Độ ổn đònh của Termamyl Ảnh hưởng của calci
Trong bột nhão, tính ổn đònh của Termamyl được thỏa mãn với sự hiện diện
từ 50 70 ppm ion Ca
2+
.
Ngoài ra hoạt tính của enzyme cũng có thể biểu thò bằng tốc độ gia
tăng ban đầu của DE (đương lượng Dextrose) với nồng độ enzyme đã cho sẳn. Tốc
độ gia tăng trung bình đương lượng DE trên một thời gian cho sẳn sẽ tùy thuộc vào
độ ổn đònh tốc độ ban đầu đối với hàm lượng Termamyl 0.1% trên trọng lượng như
sau :
Nhiệt độ
90
0
C
95
0
C
100
0

C
105
0
C
Độ gia tăng ban đầu đương lượng DE/giờ
5.1
5.5
5.9
6.2
Độ gia tăng trung bình đương lượng DE
5.1
5.3
5.3
4.3
sau 1 giờ đầu tiên (điều kiện tiêu chuẩn)






100

75

50

25

40
50
60
70
80
90


% hoạt tính
tương đối

0
C



40
Phần 3.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1. VẬT LIỆU
 Enzyme – amylase
Trong quá trình tiến hành thí nghiệm, sử dụng enzyme amylase thương
phẩm: Termamyl do hãng Novo sản xuất.
 Gel calcium alginate
Alginate sử dụng trong quá trình thí nghiệm là muối sodium alginate do
hãng Kanto của Nhật sản xuất. Sản phẩm ở dạng bột mòn hòa tan hoàn toàn
trong nước.
3.2. PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.2.1. Phương pháp cố đònh enzyme
a. Chuẩn bò dụng vụ & hóa chất cố đònh enzyme

Dụng cụ
– Bercher 500
ml
, 1000
ml
.
– Pipet.
– Que khuấy.
– Xilanh tạo giọt.
Hóa chất
– Sodium alginate dạng bột mòn do Nhật sản xuất.
– CaCl
2
0.2M
– Enzyme Termamyl thương phẩm dạng lỏng.
b. Qui trình cố đònh enzyme
–Tạo dung dòch sodium alginate 3%.
–Trộn đều enzyme và dung dòch sodium alginate theo tỉ lệ 1:1 tạo ra
hổ hợp enzyme–sodium alginate