Luận văn : Đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Acanardium occidentale L.) hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận bằng kỹ thuật RAPD và AFLP part 6 pps

51
Coefficient
0.66 0.75 0.83 0.92 1.00
NP10
NP1
NP6
NP7
NH11
NP4
NH27
NP5
BA48
BA49
NH26
NP8
NP9
NH12
NH18
NH24
NH20
NH21
NH23
NH22
NS40
NS37
NS39
NS38
NS31

BA42
NS32
NS34
NS35
NH29
NH30
NS33
NS41
BA43
NH16
NP3
NH13
NS36
NH15
NH17
BA50
NP10
NP2
BA46
BA44
NH25
BA45
BA47

Hình 4.14: Cây phát sinh chủng loại của 47 mẫu điều tại tỉnh Ninh Thuận

X
Y
A
B

BII
BI
Similarity Coefficient




52
Để đánh giá tổng quát quần thể điều toàn tỉnh, chúng tôi đã tiến hành lập cây phát
sinh chủng loại thể hiện quan hệ di truyền giữa 47 mẫu điều nghiên cứu (hình 4.14). Kết
quả cho thấy các mẫu chia thành hai nhóm lớn (X và Y) có hệ số đồng dạng di truyền là
0,66. Trong 47 mẫu phân tích nhóm X chỉ có 6 mẫu, do đó có thể phân biệt 6 mẫu này với
các mẫu còn lại. Trong nhóm X mẫu NP2 và BA4 có hệ số đồng dạng di truyền 0,93 và
cùng có hệ số đồng dạng di truyền với NH5 khoảng 0,87. Điều này cho thấy các mẫu này
có quan hệ di truyền rất gần nhau và khá xa với các mẫu khác. 6 mẫu nhóm X được phân
bố trên cả 3 huyện Ninh Phước, Ninh Hải và Bác Ái của tỉnh Ninh Thuận.
Nhóm Y lại chia thành hai nhóm A và B có hệ số đồng dạng di truyền khoảng 0,68.
Nhóm B chia làm 2 nhóm nhỏ BI và BII. Nhóm BII chỉ có một mẫu NP10, trên thực tế
mẫu này có tính trạng đặc biệt là cây rất ít trái, tuy nhiên về mặt kiểu gene lại không có
những band khác lạ. Nhóm BI gồm 6 mẫu NP3, NH13, NS36, NH15, NH17 và BA50 có
hệ số đồng dạng di truyền dao động từ 0,86 đến 1,00. Có thể nhóm BI là một giống và
được phân bố đều ở 4 huyện Ninh Phước, Ninh Hải, Ninh Sơn và Bác Ái.
Nhóm A chia thành rất nhiều nhóm nhỏ, các mẫu trong nhóm này phân bố đều khắp
tỉnh Ninh Thuận. Có thể nhóm này chỉ gồm một vài giống nhưng có sự lai hỗn tạp giữa
các cá thể trong vườn, dẫn đến các cây lai có sự khác nhau ở một vài band trên gel điện
di. Đặc biệt là mẫu NH16 có kiểu gene rất khác với các mẫu trong nhóm, band 1100 bp
chỉ xuất hiện ở mẫu NH16 và BA47, nhưng ở mẫu NH16 band này rất sáng trong khi mẫu
BA47 rất mờ. Band 1100 bp là một band đặc biệt, có thể là marker của một tính trạng nào
đó nhưng trong giới hạn khóa luận này chúng tôi chưa xác định rõ. Để tìm hiểu sâu hơn,
nên tách band này ra giải trình tự DNA nhằm phục vụ cho việc nhận định: xem đây có

phải là một marker của tính trạng nào không?
Qua cây phát sinh chủng loại ở hình 4.14 cho thấy hệ số đồng dạng di truyền giữa
các mẫu phân tích biến thiên từ 0,66 đến 1,00. Điều này chứng tỏ các mẫu có đặc điểm di
truyền tương đối gần nhau nhưng cây phát sinh chủng loại có rất nhiều nhánh cho thấy
quần thể điều hiện được trồng tại tỉnh Ninh Thuận có nguồn gene rất phong phú.
Mẫu số 47 có kiểu gene khá xa với các mẫu còn lại và trên thực tế mẫu này có tính
trạng đặc biệt là khi chín trái màu xanh. Các mẫu NP2, NH25, BA44, BA45 và BA46 có



53
kiểu gene khá gần nhau và khác xa với các mẫu khác nhưng trên thực tế mẫu NH25 lại có
tính trạng đối lập với các mẫu NP2, BA44 và BA46. Các mẫu NH16, NH17 và NS34 có
những tính trạng gần nhau (một năm 2, 3 đợt trái) nhưng kiểu gene lại khá xa nhau. Tuy
nhiên cũng có các mẫu có kiểu hình giống nhau và kiểu gene cũng gần nhau như mẫu
NP8, NP9, NH12, NH18 và NH24; mẫu NP4 và NH27; mẫu NP3, NH13 và NS36
Kết quả trên cho thấy tính đa hình của quần thể điều tại tỉnh Ninh Thuận đối với
primer 11 và tính trạng kiểu hình thực tế có sự khác biệt rất lớn, cần phải nghiên cứu kỹ
về chỉ thị DNA để có cơ sở chọn giống phù hợp và hiệu quả.
4.3.5. Một vài điểm lƣu ý khi thực hiện kỹ thuật RAPD
 Không dùng giấy dán vào thành eppendorf để đánh dấu mẫu khi chạy RAPD - PCR
 RAPD – PCR rất nhạy cảm với các thành phần hóa chất, chỉ cần thay đổi 1 yếu tố
thì sản phẩm thu được sẽ khác nhau. Do đó cần kiểm tra lại toàn bộ quy trình khi có sự
thay đổi về một yếu tố nào đó
 Khi thay đổi về nhiệt độ bắt cặp của primer thì thường biến thiên 2
0
C, thay đổi 1
0
C
ít có sự khác biệt

 Máy PCR khác nhau cho kết quả sản phẩm khác nhau.
Khi gặp trở ngại về việc điện di thì nguyên nhân có thể do:
 Kỹ thuật đổ gel: Agarose chưa tan đều hoặc do agarose quá nguội khi đổ.
 Điện trường của máy điện di: Do điện thế không ổn định hoặc điện cực bị cong.v.v.
 Dung dịch điện di: Cần thay dung dịch điện di khác.
4.4. Kết quả bƣớc đầu của việc sử dụng kỹ thuật AFLP trong nghiên cứu tính đa
hình của một số mẫu
Chúng tôi thực hiện kỹ thuật AFLP đối với 12 tổ hợp primer chọn lọc trên 4 mẫu
NP10, NH12, NS40 và BA46








54
Bảng 4.2:Kết quả các cặp tổ hợp primer chọn lọc dùng trong AFLP
Tổ hợp
Primer MseI
Primer EcoRI
Màu huỳnh quang
Số band
1
MseI-CAA
EcoRI-ACT
xanh dương
16
2

MseI-CAA
EcoRI-AAC
vàng
1
3
MseI-CAA
EcoRI-AGG
xanh lá cây
19
4
MseI-CAA
EcoRI-ACC
xanh dương
2
5
MseI-CAA
EcoRI-AGC
vàng
4
6
MseI-CAA
EcoRI-ACG
xanh lá cây
1
7
MseI-CAG
EcoRI-ACA
xanh dương
5
8

MseI-CAG
EcoRI-AGC
vàng
6
9
MseI-CAG
EcoRI- AAG
xanh lá cây
4
10
MseI-CAG
EcoRI-AGT
xanh dương
3
11
MseI-CAG
EcoRI-AAC
vàng
3
12
MseI-CAG
EcoRI-AGG
xanh lá cây
2

4.4.1. Kết quả phản ứng cắt và gắn

Hình 4.15: Sản phẩm phản ứng cắt và gắn (ĐC: Đối chứng)
Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm của phản ứng cắt và gắn cho thấy DNA bị cắt
thành rất nhiều đoạn nhỏ trải dài trên gel điện di. Phản ứng được thực hiện khá thành

công, DNA được cắt hoàn toàn.
NP10 NH12 NS40 BA46 ĐC



55
4.4.2. Kết quả khuếch đại tiền chọn lọc

Hình 4.16: Sản phẩm PCR tiền chọn lọc (ĐC: Đối chứng)
Qua hình 4.16 cho thấy kết quả PCR tiền chọn lọc chưa tốt lắm. Lượng sản phẩm tạo
thành còn ít nên kết quả điện di còn mờ và chưa thấy dấu hiệu phân chia các band. Tuy
nhiên với kết quả này có thể thực hiện tiếp giai đoạn PCR với các tổ hợp primer chọn lọc.
4.4.3. Kết quả khuếch đại chọn lọc
Sau khi điện di sản phẩm PCR khuếch đại chọn lọc trên máy giải trình tự DNA,
chúng tôi nhận thấy 2 cặp tổ hợp primer 1 và 3 là cho kết quả tốt nhất. Cặp primer 1 cho
16 band và cặp primer 3 cho 19 band, tuy nhiên cặp primer 1 cho band ở cả 4 mẫu trong
khi cặp primer 3 chỉ cho các band ở mẫu BA46, NS40 và NH12. 2 cặp primer này có thể
được dùng để chạy AFLP trong việc đánh giá đa dạng quần thể điều.

Hình 4.17: Các band thể hiện dƣới dạng peak trong kết quả điện di trên máy giải
trình tự DNA
Trong 12 cặp primer chọn lọc được sử dụng có 6 cặp dùng primer MseI-CAA và 6 cặp
dùng primer MseI-CAG. Vậy sự khác biệt của kết quả là dựa vào primer EcoRI-AXX. Ở đây kết
NP10 NH12 NS40 BA46 ĐC



56
quả thu được chỉ có 35 band (số band của tổ hợp primer 1 và 3) và mẫu NP10 chỉ có 4 band,
mẫu NH12 có 6 band. Điều này cho thấy việc sử dụng tổ hợp primer EcoRI-AXX thu được

thông tin quá ít, có thể chưa đủ số liệu để đánh giá chính xác mối quan hệ của các mẫu nghiên
cứu. Để thu được lượng thông tin nhiều hơn nên khảo sát thêm các tổ hợp primer EcoRI-AX.
Sau khi điện di sản phẩm PCR chọn lọc trên máy giải trình tự DNA, kết quả được đưa qua
phần mềm NTSYS để sử lý số liệu (mã hóa số liệu được trình bày ở bảng 4.4 phần phụ lục II)
Bảng 4.3: Hệ số đồng dạng di truyền của 4 mẫu điều trong kỹ thuật AFLP
Tên Mẫu
NP10
NH12
NS40
BA46
NP10
1.0000000



NH12
0.6774194
1.0000000


NS40
0.4193548
0.2258065
1.0000000

BA46
0.5161290
0.1935484
0.5806452
1.0000000

Qua bảng 4.3 chúng tôi thấy hệ số đồng dạng di truyền biến thiên từ 0,19 đến 0,67,
các mẫu này có quan hệ di truyền rất xa nhau, so với bảng 4.1 hệ số đồng dạng di truyền
của các mẫu khác nhau. Điều này nói lên mức độ tin cậy giữa 2 kỹ thuật. Tuy nhiên vì kỹ
thuật AFLP chỉ thực hiện trên 4 mẫu và chỉ ở mức độ khảo sát 12 cặp tổ hợp primer nên
chưa thể đưa ra kết luận để so sánh và đánh giá các mẫu.
Coefficient
0.34 0.42 0.51 0.59 0.68
NP10
NP10
NH12
NS40
BA46

Hình 4.18: Cây phát sinh chủng loại của 4 mẫu trong kỹ thuật AFLP
Qua hình 4.18 chúng tôi thấy mẫu NP10 và NH12 có hệ số đồng dạng di truyền
khoảng 0,68 gần giống với kỹ thuật RAPD (0,61). Mẫu NS40 và BA46 có quan hệ di
truyền giống nhau khoảng 58% trong khi kỹ thuật RAPD là 76%. Điều này cho thấy độ
tin cậy của 2 kỹ thuật có một sự chênh lệch nhất định.
Similarity Coefficient




57
CHƢƠNG V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1.Kết luận
Từ các kết quả thu được, chúng tôi rút ra một số kết luận như sau:
 Quy trình tách chiết DNA của lá điều khá ổn định. Ly trích được 50 mẫu (trên tổng
số 55 mẫu) đạt DNA tiêu chuẩn dùng trong các kỹ thuật sinh học phân tử

 Quy trình RAPD – PCR tốt nhất là quy trình ở nghiệm thức 2 của thí nghiệm 3
(Bảng 3.5 trang 31).
 Primer 11 dùng trong kỹ thuật RAPD – PCR cho 13 band đối với các mẫu thí
nghiệm, trong đó có 2 band đồng hình và 11 band đa hình. Primer 11 có tính đa hình
cao đối với quần thể điều.
 Với việc phân tích RAPD sử dụng primer 11 thì quần thể điều hiện được trồng tại
tỉnh Ninh Thuận có hệ số đồng dạng di truyền trên cây phát sinh chủng loại dao động
trong khoảng 0,65 – 1,00.
 Cây phát sinh chủng loại có rất nhiều nhánh chứng tỏ quần thể điều ở tỉnh Ninh
Thuận có sự tạp giao rất phức tạp.
 Quy trình kỹ thuật AFLP ổn định, 2 tổ hợp primer MseI-CAA với EcoRI-ACT và
MseI-CAA với EcoRI-AGG cho tính đa hình cao, có thể được dùng để đánh giá tính
đa dạng của quần thể điều.
5.2. Đề nghị
 Tối ưu quy trình ly trích DNA đối với lá điều non bằng cách cho thêm 10% CTAB
vào bước 3, tiếp theo cho dung dịch kết tủa vào, sau đó cho dung dịch NaCl – TE.
 Khảo sát thêm các primer khác dùng trong kỹ thuật RAPD
 Tách riêng các band 750 bp và 1100 bp khi chạy RAPD với primer 11 để giải trình
tự nhằm giải đáp cho sự chênh lệch giữa các mẫu và phục vụ cho công tác phân biệt và
chọn giống.
 Thực hiện kỹ thuật AFLP đối với các tổ hợp primer chọn lọc khác và trên các tổ
hợp primer chọn lọc MseI-CXX với EcoRI-AX.



58
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tài liệu trong nƣớc:

1. Nguyễn Thị Thanh Bình, Hoàng Thị Hằng, Nông Văn Hải, 2005. Nghiên cứu đa hình
một số giống tằm dâu bằng kỹ thuật RAPD. Tạp chí di truyền học và ứng dụng

2. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang,1999. Di truyền phân tử: những nguyên tắc cơ bản
trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. 275 trang

3. Hoàng Chương và Cao Vĩnh Hải,1999. Kỹ thuật trồng điều. Nhà xuất bản nông nghiệp
TP Hồ Chí Minh.Trang 3; 12-14; 21-26; 34-39

4. Hồ Huỳnh Thuỳ Dương, 2002. Sinh học phân tử. Nhà xuất bản giáo dục. Trang 24-30;
122-124.

5. Đỗ Thị Hòa, 2005. Bước đầu điều tra hiện trạng canh tác và xây dựng ngân hàng di
truyền invitro các giống điều ở một số huyện trồng điều chính ở Tỉnh Bình Dương. Luận
văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học - Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh.

6. Phạm Thành Hổ, 1998. Di truyền học. Nhà xuất bản giáo dục TP Hồ Chí Minh. 612
trang.

7. Nguyễn Thị Huyền, 2005. Bước đầu xây dựng ngân hàng gen trên cây điều ở một số
huyện của tỉnh Đồng Nai. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông Học - Đại học Nông Lâm TP
Hồ Chí Minh

8. Hoàng Thị Liễu, 2004. Phân tích mức độ đa dạng di truyền và xây dựng phương pháp
nhận diện một số giống cacao trên cơ sở kỹ thuật PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư Nông
Học - Đại học Nông Lâm TP Hồ Chí Minh

9. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. Nhà xuất bản khoa
học và kỹ thuật Hà Nội. 221 trang.

10. Phạm Đình Thanh, 2003. Hạt điều: sản xuất và chế biến. Nhà xuất bản nông nghiệp
TP Hồ Chí Minh. Trang 9-12; 28-36.

11. Nguyễn Đức Thành, 2004. Một số kỹ thuật chỉ thị phân tử. Nhà xuất bản viện khoa
hoc và công nghệ Việt Nam – Viện Công nghệ Sinh học Hà Nội.

12. Lê Duy Thành, 2001. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. Nhà xuất bản khoa học và
kỹ thuật Hà Nội. 159 trang.




59
13. Nguyễn Văn Uyển, 1996. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật - tập II.
Nhà xuất bản nông nghiệp TP Hồ Chí Minh. trang 56.

Tài liệu nƣớc ngoài:

14. Kazutoshi Okuno and shuichi Fukuoka, 1998. Manual for DNA extraction in plants.
Japan international cooperation agency.

15. Sunil Archak, Ambika B. Gaikwad, Diksha Gautam, E.V.V.B. Rao, K.R.M. Swamy
and J.L. Karihaloo, 2003. DNA fingerprinting of Indian cashew (Anacardium occidentale
L.) varieties using RAPD and ISSR techniques. Euphytica 230: p. 397 - 404

16. Samal. S, Rout G.R., Lenka P.C., 2003. Analysis of genetic relationships between
populations of cashew (Anacardium occidentale L.) by using morphological characterisation
and RAPD markers. Plant soil environ 49: p. 176 - 182

17.

18. http: //www.biotech.ufl.edu/WorkshopsCourses/
Word_files/AFLP%20Workshop%20Manual.doc

19. http: //www.weihenstephan.de/pbpz/bambara/html/rapd.htm