Luận văn : BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐIỀU (Anacardium occidental L.) TẠI TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ AFLP part 5 doc

37


Bảng 4.2 Nhiệt độ giảm từ 90
o
C về 10
o
C

STT
Thời gian (s)
Nhiệt độ máy (
o
C)
0
0
90
1
5
83,1
2
10
76,2
3
15
69,4
4
20
62,9

5
25
56,7
6
30
51,2
7
35
46,3
8
40
41,7
9
45
36,8
10
50
32,7
11
55
28,9
12
60
25,3
13
65
23
14
70
20,8

15
75
18,7
16
80
17,2
17
85
15,8
18
90
14,5
19
95
13,2
20
100
12,1
21
105
11,2
22
110
10,3



38

Nhiệt độ máy
0
20
40
60
80
100
0
15
30
45
60
75
90
105
Thời gian
Nhiệt độ
Nhiệt độ máy

Đồ thị 4.2 Nhiệt độ giảm từ 90
o
C về 10
o
C
Nhận xét:
Khi nhiệt độ hạ xuống thấp, tốc độ giảm nhiệt chậm lại do ΔT tăng. Cần hạ thấp
ΔT bằng cách bố trí quạt tạo tốc độ gió đủ lớn thổi vào tấm tản nhiệt và nhiệt độ tấm
tản nhiệt thích hợp.

39


Bảng 4.3 Nhiệt độ duy trì

STT
Thời gian (s)
Nhiệt độ máy (
o
C)
0

0
65
1
5
65
2
10
65,2
3
15
65,1
4
20
64,8
5
25
65
6
30
65,1
7
35
65
8
40
64,5
9
45
65,2
10

50
65
11
55
64,9
12
60
65,1
13
65
65,2
14
70
64,7
15
75
65
16
80
65,1
17
85
65,1
18
90
65
19
96
65,2
20

100
64,9



40


Nhiệt độ máy
64
64,5
65
65,5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Thời gian
Nhiệt độ
Nhiệt độ máy

Đồ thị 4.3 Nhiệt độ duy trì ở 65
o

C
Nhận xét:
Nhiệt độ duy trì còn biến thiên lớn, khắc phục điều điều này có 2 cách:
Cách 1: Khảo sát tìm điện áp nguồn điện nuôi thích hợp cho nhiệt độ cần duy trì. Cách
này không hay, vì mỗi khoảng nhiệt độ khác nhau cần có điện áp nuôi khác nhau. Nếu
làm theo cách này, phải dùng thêm một số thiết bị tải và điện áp kích tốn kinh phí chế
tạo và làm máy cồng kềnh.
Cách 2: Dùng phương pháp băm xung, tức là từ điện xoay chiều được chuyển thành
điện một chiều, sau đó được đưa qua thiết bị băm xung được điều khiển bởi vi xử lý.
Dòng điện dạng xung được đưa qua bộ phận chỉnh lưu thành dòng một chiều có điện
thế phụ thuộc vào băm xung. Dùng điện áp này để kích tải. Chương trình trên vi xử lý
được viết dạng băm xung tự động, khi nhiệt độ máy bằng nhiệt độ cần thiết, vi xử lý sẽ
tự động xuất dòng điện "nuôi" có công suất tỏa nhiệt đúng bằng nhiệt lượng tiêu hao.
Vì vậy nhiệt độ sẽ rất ổn định.












41


Bảng 4.4 So sánh nhiệt độ máy và nhiệt độ nhiệt kế DT150 (Korea)

Nhiệt độ máy
Nhiệt độ kế
29
19,5
32,6
24,4
34,4
26,1
36,5
28,5
38,5
31,2
40,4
33,5
44,2
37,5
46
40,6
48
44,7
50
47,7
51,8
51,1
56
57,5
57,9
59,9
59,7
62,9

62
65,7
64,1
67,7
66,2
70
68,2
72,2
70,1
74,4
72,2
77
74
78,9
76,1
81
78
83,2

42


Kết quả xử lý số liệu nhiệt độ máy và nhiệt độ nhiệt kế
SUMMARY OUTPUT
















Regression Statistics

Multiple R
0,997964







R Square
0,995931







Adjusted R
Square
0,995738

Standard
Error
0,987181







Observations
23

ANOVA









df
SS
MS
F
Significance F



Regression
1
5009,645
5009,645
5140,592
1,37E-26



Residual
21
20,46506

0,974527





Total
22
5030,11
















Coefficients
Standard
Error
t Stat
P-value

Lower 95%
Upper 95%
Lower
0.95%
Upper
0.95%
Intercept
14,98439
0,589689
25,41069
2,98E-17
13,75807
16,21072
13,75807
16,21072
X Variable 1
0,737742
0,01029
71,69792
1,37E-26
0,716344
0,75914
0,716344
0,75914


0
20
40
60

80
100
19,5
28,5
37,5
47,7
59,9
67,7
74,4
81
Nhiệt độ nhiệt kế
Nhiệt độ máy
Nhiệt độ máy
Nhiệt kế

Đồ thị 4.4 Nhiệt độ máy và nhiệt độ thực trên nhiệt kế






43


Phương trình đường chuẩn nhiệt độ của nhiệt kế:
y = x (4.1)
Phương trình đường thẳng nhiệt độ máy
y = 0,75x + 14,98 (4.2)
Toạ độ điểm cắt

A (59,92; 59,92)
Tại điểm này nhiệt độ máy bằng nhiệt độ nhiệt kế
Qui nhiệt độ máy về nhiệt độ nhiệt kế
Khi nhiệt độ lớn hơn 59,92
y = y
o
+ (y'

- y
o
)/0,75 (4.3)
Khi nhiệt độ nhỏ hơn 59,92
y = y
o
- (y
o
- y')/0,75 (4.4)
y : Nhiệt độ thực tế
y
o
: Nhiệt độ tại điểm cắt
y' : Nhiệt độ vi xử lý đưa ra
Từ kết quả khảo sát thấy, hệ số tuyến tính còn thấp (0.9957), nhiệt độ biến thiên còn
lệch so với nhiệt độ chuẩn sau khi chuẩn lại chương trình đường nhiệt độ. Có hai lý do
dẫn đến sai số này:
- Nhiệt kế sai số và hệ số tuyến tính không cao. Đã đo thử nhiệt độ trên máy PCR
của hãng eppendorf thấy nhiệt độ trên máy là 94
o
C trong khi nhiệt độ trên nhiệt kế là
86

o
C.
- Nguyên nhân thứ hai là board mạch khuếch đại cho Pt có hệ số tuyến tính không
cao. Khắc phục, thay OP07 bởi MAX4236_37A.


44



Đồ thị 4.5 Hệ số tuyến tính board mạch khuyếch đại dùng MAX4236_37A

4.4. Về kết quả chạy mẫu
4.4.1. Hoạt động của máy

45


Khi khởi động máy, LCD hiện chu "Help??". Nếu nhấn nút Help trên bàn phím,
màn
hình sẽ hiện cách sử dụng máy. Để kêt thúc ấn phím Cancel muốn tiêp tục ấn phím
Help.
Sau khi ấn phím Cancel máy sẽ "khởi động", chờ đến khi màn hình hiện chữ "an
STAR". Lúc này máy khởi động xong. Sau khi ấn Star màn hình hiển thị nhập số liệu.
Đồng ý với số liệu nhập ấn phím OK, không đồng ý ấn Cancel. Khi nhập, nếu nhập sai
máy yêu cầu nhập lại số.
Nhập xong máy sẽ chạy theo chương trình cài đặc. Sau khi chạy xong phản ứng
PCR máy sẽ thông báo lên màn hình. Lúc này muốn chạy tiếp tục thì ấn phím Reset
nhập lại số liệu mới.
4.4.2. Chạy phản ứng PCR
Mẫu chạy trên hai máy đồng thời. Một trên máy của hãng eppendorf và một trên
máy chế tạo. Chạy RAPD trên đối tượng cây điều.

Trình tự của primer 11 (OPN 06): 5’GAGACGCACA 3’ và T
m
= 35,3
0
C

Bảng 4.5 Hoá chất chạy PCR

Hoá chất
Dung dịch gốc
Thể tích sử dụng
Nồng độ cuối
PCR buffer
MgCl
2

dNTP
Primer (OPN 06)
Taq DNA polymerase
DNA mẫu
H
2
O
25 mM
25 mM
10 mM
10 pmol/ul
5 U
20 ng/ul
2,5 ul
2 ul
3 ul
0,65 ul
0,1 ul
1 ul
19 ul
250 uM

200 uM
120 uM
6,5 pmol (260 uM )
0,5 U
20 ng