Luận văn : BƯỚC ĐẦU ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA QUẦN THỂ ĐIỀU (Anacardium occidental L.) TẠI TỈNH BÀ RỊA – VŨNG TÀU BẰNG KỸ THUẬT RAPD VÀ AFLP part 1 pdf

1


Phần 1. Mở đầu

1.1. Đặt vấn đề
Hiện nay, máy luân nhiệt (Thermocycles - PCR) được sử dụng rộng rãi tại các
trường Đại học, phòng thí nghiệm, bệnh viện, viện nghiên cứu… Máy PCR là công cụ
không thể thiếu đối với các thí nghiệm liên quan đến khuếch đại đoạn DNA.
Những máy PCR đang sử dụng tất cả đều nhập từ nước ngoài với giá thành cao,
hơn nữa trong quá trình sử dụng gặp hư hỏng chi phí sửa chữa khá cao; đôi khi trong
nước không sửa chữa được phải ra nước ngoài, tốn thời gian và chi phí vận chuyển.
Với những thiết bị đắt tiền như vậy, sinh viên khó tiếp cận thực hiện các thí
nghiệm của mình, chỉ có thể kiến tập hoặc nhiều sinh viên thực tập trên một máy. Số
lượng máy PCR hiện nay tại các trường đại học còn khiêm tốn, trong khi lượng sinh
viên ngày một nhiều. Do vậy, việc chế tạo máy PCR trong nước với giá thành hạ rất
cần thiết.
Khi chưa có máy PCR, ta cũng có thể thực hiện khuếch đại đoạn DNA với các
hộp chứa nước ở nhiệt độ khác nhau. Tuy nhiên, việc làm này tốn nhiều thời gian và
công sức, độ tin cậy không cao, không thích hợp khi lượng mẫu cần phân tích nhiều.
Máy PCR lúc đầu mới ra dùng dầu, còn có nhiều nhược điểm như: hút DNA ra
khó dễ bị lẫn dầu, thu được lượng DNA sạch ít hơn dự kiến v.v…
Để khắc phục những khuyết điểm đó, dòng máy thứ hai ra đời dùng nguyên lý
điện nhiệt học để chuyển tải nhiệt có thêm nắp chống ngưng tụ, khắc phục được những
khuyết điểm trên.
Đề tài nghiên cứu này, được thực hiện với mục đích hạ thấp giá thành của máy,
kiểm tra độ hoạt động ổn định của máy và kiểm tra chạy phản ứng PCR.

1.2. Yêu cầu

Máy được thiết kế tiện dụng, dễ nâng cấp, sử dụng, sửa chữa và bảo trì. Có độ bền
cao, hoạt động ổn định, cho kết quả trong việc chạy PCR.
Khoảng nhiệt độ 4
o
C – 95
o
C và không ngưng tụ hơi nước trên nắp ống eppendorf
trong khoảng nhiệt độ này.
Sai số nhiệt độ nằm trong giới hạn cho phép.


2


Chạy chương trình trực tiếp không lưu vào bộ nhớ.

1.2. Giới hạn của đề tài
Đây là máy lần đầu chế tạo tại Việt Nam, thời gian chế tạo có hạn vì vậy độ tin
cậy có thể không cao bằng máy nhập ngoại hiện đại. Vì vậy, cần có thời gian chạy thử
để tối ưu từng bộ phận của máy và đưa ra tiêu chuẩn cụ thể cho từng bộ phận và linh
kiện của máy.

3


Phần 2. Tổng quan tài liệu

2.1. Nguyên lý phản ứng PCR
PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc
tác của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình
nhiệt lặp lại (có thể đến 35 lần) gồm đun nóng (khoảng 95
o
C), làm nguội (37 – 65
o
C)

và ủ lâu ở khoảng 72
o
C. Trong dung dịch có các primer (đoạn mồi), mỗi loại primer sẽ
bắt cặp bổ sung với mạch đơn tương ứng.
Nhờ vậy 1 đoạn mạch kép DNA, sau một chu kỳ phản ứng do DNA polymerase
thực hiện, thành hai mạch DNA kép và có thể thực hiện chu trình khuếch đại mới : 2
thành 4 và 4 thành 8 theo cấp số nhân với công bội là 2 theo lý thuyết.
Phản ứng được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ (eppendorff), có DNA
khuôn mẫu, primer và DNA polymerase, được gắn vào hệ thống nung nóng có điều
chỉnh thành chu kỳ nung nóng và làm nguội theo chương trình gọi là thermocycler,
đây chính là máy PCR.

2.2. Các thành phần của phản ứng
Trong các ống nghiệm plastic nhỏ có các thành phần chủ yếu sau:
 Khuôn mẫu (Template) tức là đoạn DNA cần khuyếch đại.
 Các oligonucleotide primer (các mồi) còn gọi là amplifier (nhân tố khuyếch đại),
oligo hay primer.
 DNA polymerase chịu nhiệt.
 dNTP : các loại nucleotide triphosphate.
 Dung dịch đệm (buffer) tích hợp và MgCl
2
.
 Nước

2.2.1. Các enzyme polymerase chịu nhiệt
Lúc đầu, các enzyme polymerase bình thường được sử dụng, nhưng hiệu quả kém
do phải chờ hạ nhiệt độ xuống thấp (30 – 50
o
C). Hiện nay, hầu như chỉ sử dụng
enzyme polymerase chịu nhiệt là Taq polymerase bắt nguồn từ vi khuẩn Thermophilus

4


aquaticus và một số khác cải biến từ chủng này. Phản ứng PCR có thể thực hiện cả với
RNA.

2.2.2. DNA khuôn mẫu
Độ nhạy cao là một đặc tính hấp dẫn của PCR. Sự khuếch đại có thể thực hiện với
một phân tử ban đầu được nhân lên. Yêu cầu tối thiểu này đối với đoạn DNA mẫu
tương phản với kĩ thuật tạo dòng. Cũng do sự nhạy cảm cao này mà kết quả PCR dễ bị
sai nếu bị nhiễm DNA khác. Dễ bị nhiễm tạp là nhược điểm lớn của PCR.
Ưu thế khác đối với mẫu là không cần sự tinh sạch cao. Nhờ vậy có thể sử dụng
PCR với các vết máu, mẫu khảo cổ, DNA cổ xưa hoặc vi khuẩn đã bị hấp khử trùng.
Tuy vậy, trong nhiều trường hợp cần chuẩn bị mẫu tốt để kết quả chắc chắn hơn.
2.2.3. Primer
Primer là thành phần quan trọng trong PCR. Primer được tổng hợp hóa học trên
chất nền rắn được sử dụng trong máy tổng hợp oligonucleotide (oligonucleotide
synthestizer). Các primer có vai trò quan trọng đối với thành công của PCR.
Trình tự primer phải có kích thước hợp lý, khoảng 18 – 25 nucleotide. Việc lựa
chọn trình tự primer cũng có vai trò quan trọng. Cần chọn thế nào để tránh sự bắt cặp
bổ sung bên trong hoặc bên ngoài phân tử không như ý và tránh có tỉ lệ G + C cao.

2.3. Nguyên lý hoạt động của máy PCR

Hình 2.1 Mô hình hoạt động của máy PCR
Sensor nhiệt cảm ứng nhiệt độ truyền tín hiệu về cổng chuyển đổi được tích hợp
trên chip, tín hiệu điện được chuyển sang dạng số. Vi điều khiển nhận tín hiệu số này
và xử lý theo chương trình được lập trình. Kết quả chip xuất ra dạng số và được
Bộ điều khiển
Cảm biến
Bộ công suất
Nguồn cung cấp
Te, quạt, điện trở


5


chuyển thành dạng tương tự (Analog) là tín hiệu điều khiển bộ khuếch đại, dựa vào đó
mà bộ khuếch đại cung cấp điện áp và đảo cực cho thermoelectric module, quạt, điện
trở.

2.4. Nguyên lý Peltier
Năm 1834, nhà khoa học Pháp Jean Charles Althanase Peltier đã phát hiện khi
điện áp một chiều khi thông qua một mạch điện tạo bởi hai mạch điện dẫn điện khác
nhau, điểm nối của nó sẽ sinh ra một hiện tượng hút nhiệt. Hiện tượng này gọi là hiệu
ứng Peltier (Hoàng Oanh, 2002, trang 30).

2.5. Thermoelectric module
2.5.1. Giới thiệu
Thermoelectric module là ứng dụng cụ thể trong kỹ thuật của hiệu ứng Peltier.

Hình 2.2 Thermoelectric module
Các vật liệu bán dẫn dùng để làm lạnh có rất nhiều loại chẳng hạn như: PbTe,
ZnSb, SiGe, AgSbTe v.v… Vật liệu bán dẫn có hiệu suất cao hay thấp phụ thuộc vào
tham số chính, được đánh giá bởi hệ số Z, Z càng lớn thì hiệu suất càng cao.
Z = a
2
/(k.ρ) (2.1)
Trong công thức: Z là hệ số ưu trị
a là điện thế điện động sai lệch nhiệt độ
k là dẫn xuất nhiệt
ρ là điện trở suất


6


Hiện nay, nghiên cứu sử dụng nhiều nhất là các vật liệu bán dẫn P-Bi
2
Te
3
/Sb
2
Te
3
,
N-Bi
2
Te
3
/Bi

2
Se
3
là hợp kim với 3 nguyên tố chuẩn. Chúng có hệ số ưu trị tương đối
tốt, hệ số ưu trị vật liệu bán dẫn kiểu P có hệ số Zp > 3,5x10
-3
k
-1
. Các hệ số ưu trị của
vật liệu bán dẫn kiểu N có hệ số Zn > 3x10
-3
k
-1
nếu làm cho việc làm lạnh bán dẫn về
mặt kinh tế đạt tới mức độ tương đương như làm lạnh kiểu máy nén, hệ số ưu trị có thể
đạt tới 13x10
-3
k
-1
(Hoàng Oanh, 2002, trang 30)

2.5.2. Cấu tạo và nguyên lý hoạt động
2.5.2.1. Cấu tạo
Thermoelectric module, cấu tạo bởi hai loại bán dẫn loại P và N nối tiếp nhau bởi
các cầu nối thường được làm bằng kim loại đồng (Cu) có vai trò dẫn điện và chuyển
tải nhiệt. Để module hoạt động ổn định và độ bền cao, đòi hỏi cách điện tốt và chống
hơi nước ngưng tụ bên trong thermoelectric module trong quá trình làm lạnh. Vì vậy,
nhà sản xuất thường dùng vật liệu ceramic cách điện hai mặt. Ceramic này có đặc tính
cách điện, dẫn nhiệt tốt và có độ bền cơ học cao. Muốn cho thermoelectric dẫn nhiệt
tốt, hai bề mặt phải phẳng và nhẵn, thường phủ thêm một lớp mỏng silicon làm tăng

thêm vai trò dẫn nhiệt và chống hơi nước ngưng tụ bên trong.
Bên trong thermoelectric module các bán dẫn P và N nối tiếp nhau, có cùng chiều
truyền nhiệt tùy vào mục đích sử dụng mà nhà sản xuất tạo ra nhiều thermoelectric có
số lượng cặp PN khác nhau. Số lượng PN càng nhiều độ chênh lệch nhiệt độ trên bề
mặt càng thấp và chịu được lực nén cao.

Hình 2.3 Cấu tạo Thermoelectric module




7


2.5.2.2. Nguyên lý hoạt động
Hoạt động dựa trên nguyên lý Peltier. Khi có dòng điện một chiều chạy qua, tùy
theo bán dẫn loại P hay N mà có sự truyền tải nhiệt khác nhau so với chiều dòng điện
đi qua. Đối với bán dẫn loại N sự truyền tải nhiệt ngược chiều với chiều dòng điện, đối
với bán dẫn loại P truyền tải nhiệt cùng với chiều dòng điện. Vì vậy, thermoelectric
một mặt nóng và một mặt lạnh khi có dòng điện một chiều đi qua (hình 2.4).

Hình 2.4 Sự truyền tải nhiệt

Công suất truyền tải nhiệt của thermoelectric module cao hay thấp phụ thuộc vào
vật liệu bán dẫn, dòng điện đi qua và độ chênh lệch nhiệt độ hai bề mặt của
thermoelectric. Nếu dòng điện quá thấp thì truyền tải nhiệt kém, nếu quá cao truyền tải
nhiệt cũng giảm do dòng điện có tác dụng sinh nhiệt theo định luật Jun-Lenxơ. Tùy
theo vật liệu cấu tạo và kết cấu của thermoelectric mà ΔT
Max
khác nhau. Nếu chênh

lệch nhiệt độ hai bề mặt của vật liệu bán dẫn vượt qua giới hạn này thì truyền tải nhiệt
bằng không, xét theo tác dụng truyền tải nhiệt của thermoelectric. Mỗi loại
thermoelectric chịu được nhiệt độ nóng trong giới hạn nếu nhiệt độ lớn hơn dẫn đến hư
hỏng. Vì vậy, dùng tản nhiệt cho mặt nóng của thermoelectric là cần thiết cho quá
trình làm lạnh, hoặc tăng nhanh làm nóng.
Máy PCR có đặc tính thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ liên tục. Đòi hỏi
thermoelectric dùng cho máy phải thích hợp. Thermoelectric thông thường dùng cho
làm lạnh hoặc làm nóng không đáp ứng cho sự thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ. Nếu


8


dùng loại này cho máy PCR, máy sẽ hoạt động không ổn định sau một thời gian, do
điện trở của thermoelectric thay đổi lớn (www. ferotech.com).

2.6. Bán dẫn loại N và bán dẫn loại P
Chất bán dẫn thuần khiết nếu được pha thêm tạp chất, chẳng hạn như Si được pha
thêm tạp chất nhóm 5 là Phosphore hoặc Asenic đối với Ge. Với hàm lượng thích hợp
sao cho các nguyên tử tạp chất này chiếm chỗ một trong những nút của mạng tinh thể
thì cơ chế dẫn điện sẽ thay đổi. Nguyên tử tạp chất (chẳng hạn như Phosphore), vỏ
ngoài cùng có 5 điện tử; trong đó 4 điện tử tham gia liên kết hóa trị với các nguyên tử
lân cận, điện tử thứ năm liên kết yếu hơn với hạt nhân và các nguyên tử xung quanh.
cho nên, chỉ cần cung cấp một năng lượng nhỏ (nhờ nhiệt độ, ánh sáng …), điện tử này
sẽ thoát khỏi trạng thái ràng buộc, trở thành hạt dẫn tự do. Nguyên tử tạp chất khi đó
bị ion hóa và trở thành một ion dương. Nếu có điện trường đặt vào, các hạt dẫn tự do
trên sẽ chuyển động có hướng, tạo nên dòng điện.
Như vậy tạp chất nhóm 5 cung cấp điện tử cho bán dẫn ban đầu nên được gọi là
tạp chất cho. Chất bán dẫn có pha tạp chất cho gọi là bán dẫn loại N.
Trường hợp tạp chất pha vào thuộc nhóm 3 của bảng tuần hoàn các nguyên tố, do

lớp vỏ ngoài cùng của nguyên tử tạp chất chỉ có 3 điện tử khi tham gia vào mạng tinh
thể của chất cơ bản chỉ tạo nên 3 mối liên kết hoàn chỉnh, còn mối liên kết thứ tư bị bỏ
hở. Khi có kích thích nhỏ là một trong những điện tử của các mối liên kết hoàn chỉnh
bên cạnh sẽ đến thế vào liên kết bỏ hở nói trên. Nguyên tử tạp chất lúc đó sẽ trở thành
một ion âm. Tại mối liên kết mà điện tử vừa đi khỏi sẽ dư ra một điện tích dương,
nghĩa là xuất hiện một lỗ trống. Nếu có điện trường đặt vào, các lỗ trống này sẽ tham
gia dẫn điện.
Như vậy, tạp chất nhóm 3 tiếp nhận điện tử từ chất cơ bản để làm sản sinh các lỗ
trống nên được gọi là tạp chất nhận. Chất bán dẫn có pha tạp chất nhóm 3 như trên gọi
là bán dẫn loại P.
Như vậy, tùy theo tạp chất pha vào thuộc nhóm 3 hay nhóm 5 (xét với Si hoặc Ge)
mà chất bán dẫn thuần trở thành bán dẫn P hay N. Hạt dẫn đa số tương ứng là lỗ trống
hoặc điện tử. Ở trạng thái cân bằng, mỗi chất bán dẫn đều trung hòa điện, nghĩa là tổng


9


điện tích dương bằng tổng điện tích âm trong thể tích (Dương Vũ Văn, 2002, trang
43).

p-type n-type Si 100%, 0
0
K
Hình 2.5 Điện tích và lỗ trống của bán dẫn
2.7. Sensor nhiệt
Để đo nhiệt độ ta có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau, dùng sensor nhiệt là
thích hợp nhất trong điều khiển, chúng có nhiều loại khác nhau. Để đo được nhiệt độ
chính xác cao và gia tốc biến thiên nhiệt nhanh, hai loại sensor nhiệt là „cặp nhiệt điện‟
và „điện trở palatin‟ đáp ứng tốt.

2.7.1. Nhiệt điện trở Platin
Platin là vật liệu cho nhiệt điện trở được dùng rộng rãi với dải đo nhiệt từ -200 đến
850
o
C. Nhiệt điện trở platin có nhiều loại: Pt – 100 là trị số điện trở ở định mức 0
o
C là
100Ω, Pt – 500, Pt – 1000. Các loại Pt – 500, Pt – 1000 có hệ số nhiệt độ lớn hơn. Do
đó, độ nhạy lớn hơn (điện trở thay đổi mạnh theo nhiệt độ). Với Pt – 1000, sự thay đổi
nhiệt khoảng chừng 4 Ω/
0
K.
Các tính chất của nhiệt điện trở này được qui định theo tiêu chuẩn quốc tế DIN
IEC 751. Theo tiêu chuẩn này, dải đo nhiệt độ của điện trở platin từ -200 đến 850
o
C.
Cho dải đo đầu tiên từ -200 đến 0
o
C ta có đa thức cấp ba:
R(t) = R
0
(1 + At + Bt
2
+ C[t-100
o
C

].t
3

) (2.2)
Cho dải đo từ 0 đến 850
o
C ta có đa thức cấp hai:
R(t) = R
0
(1 + At + Bt
2
) (2.3)
Các hệ số có giá trị như sau:
A = 3,90802 . 10
-3

0
C
-1
B = -5,802 . 10
-7

0
C
-2
C = -4,2735 . 10
-12

0
C
-3