Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 6 pps

33
PHẦN 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. KẾT QUẢ
4.1.1. Định tính
Để xác định thời điểm xuất hiện và thời gian tồn tại của kháng thể trong kháng
huyết thanh (KHT) ta thực hiện phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với KHT
thu đƣợc sau khi li tâm tách huyết thanh.
4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày (35 ngày)
Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều tăng dần từ 0,5 ml đến 2 ml dịch vi khuẩn.
Khoảng cách giữa 2 lần tiêm là 5 ngày. Sau khi tiêm mũi nhắc lại thứ 4 tiến hành lấy
máu thu kháng thể, lấy máu 3 lần mỗi lần cách nhau 5 ngày và lần cuối cùng lấy hết
máu.
Trƣớc khi gây miễn dịch và sau mỗi lần tiêm kháng nguyên vi khuẩn 4 ngày tiến
hành lấy máu kiểm tra kháng thể bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính, kết
quả đƣợc trình bày bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng
huyết thanh của thỏ 1 và thỏ 2
Thỏ
Lấy máu
Thỏ 1
Thỏ 2
Trƣớc khi tiêm
-
-
Sau mũi mẫn cảm
-
-

Sau mũi nhắc lại 1
-
-
Sau mũi nhắc lại 2
+
+
Sau mũi nhắc lại 3
+
+
Sau mũi nhắc lại 4
(lấy máu lần 1)
+
+
Lấy máu lần 2
+
+
Lấy máu lần 3
+
+
Ghi chú:
 Lấy máu lần 1: 5 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4
 Lấy máu lần 2: 10 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4
 Lấy máu lần 3: 15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4


34
Dựa vào bảng kết quả ta thấy qui trình ngắn ngày đƣợc áp dụng trong nghiên cứu
đã gây đƣợc đáp ứng miễn dịch trên thỏ, tạo kháng thể phát hiện đƣợc bằng phản ứng
ngƣng kết nhanh trên phiến kính. Kháng thể xuất hiện trong kháng huyết thanh sau
mũi nhắc lại lần 2 (sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày) và vẫn tồn tại cho đến lần lấy

máu lần 3 (15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần cuối – mũi 4 ).
4.1.1.2. Qui trình dài ngày (154 ngày)
Thỏ đƣợc tiêm kháng nguyên với liều từ cao xuống thấp. Khoảng cách giữa 2 lần
tiêm là 28 ngày. Kể từ khi tiêm mũi nhắc lại thứ 3 tiến hành lấy máu thu kháng thể sau
mỗi lần tiêm kháng nguyên 14 ngày.
Trƣớc khi tiêm và sau khi tiêm mũi mẫn cảm, các mũi nhắc lại 14 ngày tiến hành
lấy máu để thử phản ứng ngƣng kết xác định sự hiện diện của kháng thể trong kháng
huyết thanh. Kết quả đƣợc trình bày qua bảng 4.2.
Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng
huyết thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5
Thỏ
L.máu
Thỏ 3
(liều tiêm 1 ml)
Thỏ 4
(liều tiêm 1,5 ml)
Thỏ 5
(liều tiêm 2 ml)
Trƣớc khi tiêm
-
-
-
Sau mũi mẫn cảm
±
±
-
Sau mũi nhắc lại 1
±
±
Chết

Sau mũi nhắc lại 2
±
±
Sau mũi nhắc lại 3
±
+
Sau mũi nhắc lại 4
+
++

Kết quả cho thấy sau khi tiêm mũi mẫn cảm 14 ngày thì kháng thể xuất hiện và
phản ứng ngƣng kết thấy rõ hơn khi tiêm mũi gây mẫn cảm với liều cao hơn. Ở các
mũi nhắc lại tiếp theo thì phản ứng ngƣng kết thấy càng rõ. Qui trình dài ngày đƣợc áp
dụng trong nghiên cứu cũng đã tạo đáp ứng miễn dịch trên thỏ với kháng thể có thể
phát hiện đƣợc bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính
4.1.2. Định lƣợng
Để xác định hiệu giá kháng thể ta thực hiện phản ứng ngƣng kết chậm trong ống
nghiệm với KHT lúc đầu và KHT đã thẩm tích (KHT tủa trong ammonium sulfate và
thẩm tích) ở các độ pha loãng khác nhau.


35
Trong thí nghiệm này chỉ tiến hành định hiệu giá kháng thể của KHT thu đƣợc ở
lần lấy máu thứ 1,2,3 sau mũi nhắc lại 4 (qui trình ngắn ngày) và sau mũi nhắc lại
thứ 3, thứ 4 (qui trình dài ngày).
4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày
Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh
thỏ 1 và thỏ 2
Thỏ
Lấy máu

Thỏ 1
Thỏ 2
Trung bình
Lần
1
Huyết thanh
1/1600
1/1600
1/1600
KHT đã thẩm tích
1/960
1/480
1/720
Lần
2
Huyết thanh
1/960
1/1280
1/1120
KHT đã thẩm tích
1/240
1/640
1/440
Lần
3
Huyết thanh
1/480
1/960
1/720
KHT đã thẩm tích

1/640
1/480
1/560
Ghi chú:
 Lấy máu lần 1: 5 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4
 Lấy máu lần 2: 10 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4
 Lấy máu lần 3: 15 ngày sau khi tiêm nhắc lại lần 4
Dựa vào kết quả bảng 4.3 ta thấy hàm lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh
giảm dần ở các lần lấy máu, lƣợng kháng thể nhiều nhất trong mẫu máu lấy lần 1 và
thấp nhất ở lần 3. Kết quả cũng cho thấy hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau
khi tủa trong amonium sulfate và thẩm tích thƣờng thấp hơn kháng huyết thanh lúc
đầu.
0
500
1000
1500
2000
lần 1 lần 2 lần 3
thời điểm lấy máu
hiệu giá KT
Thỏ 1
Thỏ 2

Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của
thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu.


36
0
500

1000
1500
2000
lần 1 lần 2 lần 3
thời điểm lấy máu
hiệu giá KT
Huyết thanh
KHT đã thẩm tích

Biểu đồ 4.2 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu
và KHT đã thẩm tích ở qui trình ngắn ngày
4.1.2.2. Qui trình dài ngày
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh
thỏ 3 và thỏ 4
Thỏ
Lấy máu
Thỏ 3
Thỏ 4
Trung bình
Sau mũi
nhắc lại 3
Huyết thanh
1/1280
1/960
1/1120
KHT đã thẩm tích
1/960
1/640
1/800
Sau mũi

nhắc lại 4
Huyết thanh
1/1280
1/2560
1/1920
KHT đã thẩm tích
1/320
1/1920
1/1120

Dựa vào kết quả bảng 4.4 ta thấy hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh của thỏ
3 và thỏ 4 ở mũi nhắc lại 4 bằng hoặc cao hơn mũi nhắc lại 3. Hiệu giá kháng thể trong
kháng huyết thanh sau mũi nhắc lại lần 4 không giảm so với mũi nhắc lại lần 3 mà đặc
biệt tăng cao 1/2560 so với 1/960 ở thỏ 4.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4
thời điểm lấy máu
hiệu giá KT
Thỏ 3
Thỏ 4

Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và
thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau.

37
Tƣơng tự nhƣ qui trình ngắn ngày, qui trình dài ngày có hàm lƣợng kháng thể
trong kháng huyết thanh sau khi tủa bằng ammonium sulfate và thẩm tích thƣờng thấp
hơn lƣợng kháng thể trong kháng huyết thanh thô lúc đầu.
0
500
1000
1500
2000
2500
mũi nhắc lại 3 mũi nhắc lại 4
thời điểm lấy máu
hiệu giá KT
huyết thanh
KHT đã thẩm tích

Biểu đồ 4.4 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu
và KHT đã thẩm tích ở qui trình dài ngày

4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình
Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch đƣợc đánh giá qua việc so sánh trung bình hiệu
giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ sau lần tiêm nhắc lại thứ 4 ở qui
trình ngắn ngày và sau lần tiêm nhắc lại thứ 3, thứ 4 ở qui trình dài ngày. Kết quả đƣợc
thể hiện qua bảng 4.5.
Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ
ở qui trình ngắn ngày và dài ngày
Qui trình ngắn ngày
Qui trình dài ngày
Lần 1

1/1600
Sau mũi nhắc lại 3
1/1120
Lần 2
1/1120
Sau mũi nhắc lại 4
1/1920
Lần 3
1/720


Trung bình
1/1147
Trung bình
1/1520

Kết quả cho thấy trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại 4 ở qui
trình ngắn ngày thấp hơn trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết sau mũi nhắc lại 3
và 4 ở qui trình dài ngày.




38
4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh
Để tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ta cho kháng thể trong
KHT gắn với protein A của Staphylococcus aureus.
4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh
KHT thỏ 1 thu đƣợc ở lần lấy máu cuối cùng (lấy máu lần 3) đƣợc gắn với
S. aureus ở các nồng độ khác nhau theo quy trình 3.4. Thực hiện phản ứng ngƣng kết

trên phiến kính ta thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh
gắn S. aureus ở các nồng độ khác nhau
V
KHT
: V
S. aureus

Nồng độ
S. aureus
(tế bào / ml)
1:4
1:9
10
9
++
+
10
10
++
+
10
11
++
+
10
12
++
+
10

13
++
++
10
14
+++
++
10
15
+++
++
Ghi chú: Đối chứng
 KHT của lần lấy máu thứ 3 (thỏ 1) không xử lí với S. aureus cho kết quả (+)
 KHT trƣớc khi gây đáp ứng miễn dịch đƣợc xử lí với S. aureus cho kết quả (-)
Dựa vào bảng kết quả trên ta thấy:
Phản ứng ngƣng kết thấy rõ nhất khi KHT gắn với S. aureus có nồng độ 10
14
, 10
15

tế bào/ ml. Trong đó, nồng độ S. aureus 10
14
cho kết quả không khác nồng độ 10
15
.
Tỉ lệ thể tích KHT kết hợp với S. aureus là 1:4 cho kết quả ngƣng kết trên phiến
kính rõ hơn tỉ lệ 1:9. Nhƣ vậy việc xử lí gắn kháng thể với protein A của S. aureus đã
làm tăng độ nhạy của phản ứng ngƣng kết, giúp cho việc đọc kết quả đƣợc dễ dàng
hơn.
4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn

S. aureus
Việc xử lí kháng huyết thanh với S. aureus đã làm tăng độ nhạy của phản ứng
ngƣng kết, điều này có thể sẽ cho phép xác định chính xác hơn thời điểm xuất hiện


39
kháng thể. Dựa vào kết quả ở mục 4.1.3.1., tiến hành xử lí kháng huyết thanh với dịch
vi khuẩn S. aureus có nồng độ 10
14
tế bào/ ml với tỉ lệ thể tích KHT : dịch vi khuẩn là
1:4. Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính đƣợc trình bày ở bảng 4.6 và 4.7

a. Qui trình ngắn ngày
Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng
huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2
Thỏ

Lấy máu
Thỏ 1
Thỏ 2
Không xử lí
với S. aureus
Xử lí với
S. aureus
Không xử lí
với S. aureus
Xử lí với
S. aureus
Trƣớc khi tiêm
-

-
-
-
Sau mũi mẫn cảm
-
-
-
-
Sau mũi nhắc lại 1
-
-
-
-
Sau mũi nhắc lại 2
+
+
+
++
Sau mũi nhắc lại 3
+
++
+
++
Sau mũi nhắc lại 4
(lấy máu lần 1)
+
++
+
++
Lấy máu lần 2

+
+
+
++
Lấy máu lần 3
+
+++
+
+

So với KHT không gắn S. aureus thì KHT gắn S. aureus cho kết quả phản ứng
ngƣng kết trên phiến kính rõ ràng hơn. Tuy nhiên không có sự khác biệt về thời điểm
phát hiện kháng thể. Ở cả hai trƣờng hợp đều cho kết quả phản ứng ngƣng kết dƣơng
tính với mẫu đƣợc lấy sau tiêm mũi nhắc lại lần 2.
b. Qui trình dài ngày
Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng
huyết thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5
Thỏ

L.máu
Thỏ 3
Thỏ 4
Thỏ 5
Không
xử lí với
S.aureus
Xử lí với
S. aureus
Không
xử lí với

S. aureus
Xử lí với
S. aureus
Không
xử lí với
S. aureus
Xử lí với
S. aureus
Trƣớc khi tiêm
-
-
-
-
-
-
Sau mũi mẫn cảm
±
±
±
+
-
+
Sau mũi nhắc lại 1
±
±
±
+
Chết
Sau mũi nhắc lại 2
±

+
±
+
Sau mũi nhắc lại 3
±
++
+
++
Sau mũi nhắc lại 4
+
+++
++
+++


40
Kết quả cho thấy kháng thể nếu đƣợc gắn với protein A của S. aureus sẽ cho phản
ứng ngƣng kết rõ hơn so với kháng thể không gắn protein A. Sau khi tiêm mũi mẫn
cảm 14 ngày thì kháng thể xuất hiện và phản ứng ngƣng kết thấy rõ hơn khi tiêm mũi
gây mẫn cảm với liều cao hơn. Ở các mũi nhắc lại tiếp theo thì phản ứng ngƣng kết
thấy càng rõ. Đặc biệt ở thỏ 5, sau khi xử lí với S. aureus đã có thể phát hiện đƣợc
kháng thể ngƣng kết ngay sau mũi tiêm mẫn cảm trong khi với kháng huyết thanh
không xử lí cho kết quả (-).
4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh
Do kháng nguyên sử dụng là nguyên tế bào vi khuẩn E. coli vì vậy sẽ có các
kháng thể đặc hiệu chung cho các loài vi khuẩn E. coli đƣợc tạo thành trong kháng
huyết thanh. Nhằm tăng độ đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết cần thiết phải loại bỏ các
kháng thể đặc hiệu chung này. Trong thí nghiệm, chúng tôi đã thử cho KHT hấp phụ
với kháng nguyên chủng vi khuẩn E. coli E68 để trong KHT chỉ còn lại những kháng
thể đặc hiệu cho H28.

KHT đƣợc hấp phụ với vi khuẩn E. coli E68, sau đó định hiệu giá kháng thể bằng
phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp
phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày)

Thỏ

Lấy máu
T1
T2
Trung
bình
H. thanh
KHT đã
thẩm tích
H. thanh
KHT đã
thẩm tích
Lần
1
Không h. phụ
(n=2)
1/1600
1/960
1/1600
1/480
1/1160
Hấp phụ E
68

(n=2)
1/48
1/48
1/48
1/20
1/41
Lần
2
Không h. phụ
(n=2)
1/960
1/240
1/1280
1/640
1/780
Hấp phụ E
68

(n=2)
1/48
1/6
1/48
1/48
1/38
Lần
3
Không h. phụ
(n=2)
1/480
1/640

1/960
1/480
1/640
Hấp phụ E
68

(n=2)
1/24
1/10
1/32
1/20
1/22



41
Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi
hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày)
Thỏ
Lấy máu
T3
T4
Trung
bình
H. thanh
KT đã
thẩm tích
H. thanh
KT đã
thẩm tích

Mũi
nhắc
lại 3
Không h. phụ
(n=2)
1/1280
1/960
1/960
1/640
1/960
Hấp phụ E
68
(n=2)
1/16
1/12
1/64
1/24
1/29
Mũi
nhắc
lại 4
Không h. phụ
(n=2)
1/1280
1/320
1/2560
1/1920
1/1520
Hấp phụ E
68

(n=2)
1/48
1/6
1/128
1/96
1/70

Dựa vào kết quả bảng 4.9 và 4.10 ta thấy có sự giảm đáng kể hiệu giá kháng thể
ngƣng kết của KHT đã hấp phụ so với KHT không hấp phụ.

0
200
400
600
800
1000
1200
1400
lần 1 lần 2 lần 3
thời điểm lấy máu
hiệu giá KT
Huyết thanh
HT hấp phụ E68

Biểu đồ 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc
hoặc không đƣợc hấp phụ ở qui trình ngắn ngày