Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E. coli

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC





KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH
KHÁNG VI KHUẨN E. coli




Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001-2005
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN VÂN ANH





Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
ii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC










THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH
KHÁNG VI KHUẨN E. coli







Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện:

TS. NGUYỄN NGỌC HẢI NGUYỄN VÂN ANH
PGS. TSKH. NGUYỄN LÊ TRANG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005
iii

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Ban Giám Hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.
- Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các Thầy Cô đã luôn
tận tình hƣớng dẫn, giảng dạy, giúp đỡ và động viên tôi.
- TS. Nguyễn Ngọc Hải và PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang đã trực tiếp
hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.
- Các chị Nguyễn Thị Nguyệt Thu, Đỗ Thị Châm, Dƣơng Ngọc Diễm, Võ Thị
Mỹ Duyên, Lạc Thị Thêm, Doãn Thị Sim thuộc phòng Miễn dịch viện
Pasteur Tp. HCM đã tận tình giúp đỡ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian thực
hiện khoá luận.
- Thầy Lê Anh Phụng, cô Nguyễn Thị Kim Loan phụ trách phòng thí
nghiệm Vi Sinh và các thầy cô thuộc Bệnh xá Thú y đã tạo mọi điều kiện
thuận lợi và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua.
- Toàn thể lớp CNSH27 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời
gian làm đề tài.
Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình luôn tạo
điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trƣờng.

Chân thành cảm ơn.

Tháng 08 năm 2005
Nguyễn Vân Anh


iv

TÓM TẮT

NGUYỄN VÂN ANH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8/2005. “THỬ
NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli”

Hội đồng hƣớng dẫn:
1. TS. Nguyễn Ngọc Hải
2. PGS. TSKH. Nguyễn Lê Trang

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 2/2005 đến tháng 8/2005

Địa điểm nghiên cứu:
 Viện Pasteur Tp. HCM
 Bệnh xá Thú y Trƣờng Đại học Nông Lâm Tp. HCM
 Phòng thí nghiệm Vi Sinh.

Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc ở hai qui trình gây đáp ứng miễn
dịch ngắn ngày và dài ngày.
Đề tài thực hiện trên 2 lô thỏ thí nghiệm đƣợc gây miễn dịch theo hai qui trình
khác nhau: qui trình ngắn ngày (35 ngày) và qui trình dài ngày (154 ngày). Kháng
huyết thanh thu đƣợc từ hai qui trình tủa trong amonium sulfate bão hòa và có thể
phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm tích. Hiệu quả đáp ứng miễn dịch của hai qui trình

đƣợc đánh giá qua phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính (định tính) và phản ứng
ngƣng kết chậm trong ống nghiệm (định lƣợng). Ngoài ra để tăng cƣờng độ nhạy và độ
đặc hiệu của phản ứng ngƣng kết kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với
Staphylococcus aureus và hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn K88
+
.
Kết quả đạt đƣợc:
1. Cả hai qui trình ngắn ngày và dài ngày đều gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ.
2. Phát hiện đƣợc kháng thể trong kháng huyết thanh sau khi tiêm mũi mẫn cảm
14 ngày bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính.
3. Xác định đƣợc nồng độ S. aureus thích hợp để gắn với KHT nhằm tăng độ
nhạy của phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính. KHT đƣợc xử lí gắn với
S. aureus (nồng độ 10
14
tế bào/ ml) và tỉ lệ thể tích KHT : S. aureus là 1:4.
4. Hiệu giá kháng thể ngƣng kết ở qui trình dài ngày cao hơn qui trình ngắn
ngày.
5. Tách kháng thể ra khỏi kháng huyết thanh bằng cách tủa trong muối amonium
sulfate bão hòa.
6. Hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh.

v

MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm ơn ........................................................................................................... iii
Tóm tắt ................................................................................................................. iv
Mục lục ................................................................................................................. v

Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... ix
Danh sách các hình ............................................................................................... x
Danh sách các bảng .............................................................................................. xi
Danh sách các biểu đồ ......................................................................................... xii
Danh sách các sơ đồ ........................................................................................... xiii

1. MỞ ĐẦU ............................................................................................................... 1
1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................. 1
1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU ................................................................................. 2
1.2.1. Mục đích .................................................................................................. 2
1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................... 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3
2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ................................................................................. 3
2.1.1. Khái niệm miễn dịch ................................................................................ 3
2.1.2. Kháng nguyên .......................................................................................... 3
2.1.2.1. Định nghĩa ........................................................................................ 3
2.1.2.2. Khái niệm về epitop ........................................................................... 3
2.1.3. Kháng thể dịch thể ................................................................................... 4
2.1.3.1. Định nghĩa ......................................................................................... 4
2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin ....................................... 4
2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của động vật .... 5
2.1.4.1. Loài động vật ..................................................................................... 5
2.1.4.2. Yếu tố di truyền .................................................................................. 5
vi
2.1.4.3. Kháng nguyên ..................................................................................... 6
2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch ..................................................................... 7
2.1.4.5. Chất bổ trợ ......................................................................................... 8
2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể .......................................................... 9
2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể............................... 9
2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể ............................... 11

2.2. VI KHUẨN E. coli ........................................................................................ 14
2.2.1. Định nghĩa .............................................................................................. 14
2.2.2. Đặc tính sinh hóa .................................................................................... 14
2.2.3. Yếu tố kháng nguyên ............................................................................. 14
2.2.3.1. Kháng nguyên thân O ...................................................................... 14
2.2.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên vỏ K .............................. 15
2.2.3.3. Kháng nguyên lông roi H ............................................................... 15
2.3. TÁCH KHÁNG THỂ BẰNG AMMONIUM SULFATE ............................ 15
2.4. HỒI CHẾ KHÁNG THỂ BẰNG PHƢƠNG PHÁP THẨM TÍCH .............. 16
2.5. PHẢN ỨNG KHÁNG NGUYÊN – KHÁNG THỂ ...................................... 17
2.5.1. Các lực liên kết kháng nguyên – kháng thể (KN-KT) ........................... 17
2.5.2. Các đặc tính chung của sự liên kết KN-KT ........................................... 17
2.5.3. Phản ứng ngƣng kết KN-KT .................................................................. 18
2.5.3.1. Phản ứng ngƣng kết KN-KT xảy ra theo 2 pha ............................... 18
2.5.3.2. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng ngƣng kết KN-KT ................ 19
2.6. PROTEIN A .................................................................................................. 19
3. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM .......................................... 21
3.1. THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM ........................................................................ 21
3.1.1. Thời gian thực nghiệm ........................................................................... 21
3.1.2. Địa điểm ................................................................................................. 21
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ......................................................................... 21
3.3. VẬT LIỆU THÍ NGHIỆM ............................................................................ 21
3.4. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................. 22
3.4.1. Gây đáp ứng miễn dịch trên thỏ ............................................................. 22
3.4.1.1. Chuẩn bị dịch tiêm .......................................................................... 22
3.4.1.2. Tiêm thú thí nghiệm ....................................................................... 22
vii
3.4.1.3. Bố trí thí nghiệm ............................................................................. 23
3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh .................................................................. 25
3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà .............................. 26

3.4.2.2. Phục hồi kháng thể ......................................................................... 26
3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh ......................................................................... 27
3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu ................................................. 28
3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus ............... 29
3.4.4. Đánh giá ................................................................................................. 30
3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính) ......... 30
3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong
ống nghiệm) .................................................................................................... 31
3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI ................................................................................... 32
3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ .......................................................................................... 32
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................. 33
4.1. KẾT QUẢ ....................................................................................................... 33
4.1.1. Định tính ................................................................................................ 33
4.1.1.1. Qui trình ngắn ngày ........................................................................ 33
4.1.1.2. Qui trình dài ngày ............................................................................ 34
4.1.2. Định lƣợng ............................................................................................. 34
4.1.2.1. Qui trình ngắn ngày ......................................................................... 35
4.1.2.2. Qui trình dài ngày ............................................................................ 36
4.1.2.3. Hiệu quả gây đáp ứng miễn dịch ở 2 qui trình ................................ 37
4.1.3. Xử lí tăng độ nhạy của kháng huyết thanh............................................. 38
4.1.3.1. Xác định nồng độ S. aureus thích hợp gắn với kháng huyết thanh . 38
4.1.3.2. Kiểm tra phản ứng ngƣng kết với kháng huyết thanh xử lí gắn
S. aureus ........................................................................................................ 38
4.1.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh ....................................... 40
4.2. THẢO LUẬN ................................................................................................. 42
4.2.1. Định tính ................................................................................................ 42
4.2.2. Định lƣợng ............................................................................................. 43
4.2.2.1. Qui trình ngắn ngày ......................................................................... 43
4.2.2.2. Qui trình dài ngày ........................................................................... 43
viii

4.2.3. Xử lí để tăng độ nhạy kháng huyết thanh .............................................. 44
4.2.4. Xử lí tăng độ đặc hiệu của kháng huyết thanh ....................................... 44
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................................. 46
5.1. KẾT LUẬN .................................................................................................... 46
5.2. ĐỀ NGHỊ ........................................................................................................ 46
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 47
7. PHỤ LỤC ............................................................................................................. 49







ix

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

APC Antigen-presenting cell
(Tế bào trình diện kháng nguyên)
E. coli Escherichia coli
Ig Immunoglobulin
(Globulin miễn)
IL Interleukine
KHT Kháng huyết thanh
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
KN-KT Kháng nguyên – Kháng thể
MHC II Major histocompatibility complex class II antigens
(các kháng nguyên phù hợp tổ chức chính lớp II)

S. aureus Staphylococcus aureus.
SIg Surface immunoglobulin
(Globulin miễn màng tế bào)
TCR T cell receptor
(Thụ quan bề mặt tế bào T)
T
H
lympho T helper cell
(tế bào lympho T hỗ trợ)
x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân tử kháng thể ...................................................... 4
Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu lộ trên
bề mặt tế bào ......................................................................................... 10
Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4
+
trên tế
bào T
H
................................................................................................... 10
Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào tƣơng ...................................................... 11
Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng
này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh .................................. 12
Hình 2.6 Sự khác biệt giữa KN phụ thuộc tuyến ức và KN không phụ thuộc tuyến
ức trong kích hoạt đáp ứng ở tế bào B .................................................. 13
Hình 2.7 Đáp ứng tạo kháng thể khác nhau tùy vào KN phụ thuộc tuyến ức hay
không phụ thuộc tuyến ức. KN không phụ thuộc vào tuyến ức không

gây ra sự thay đổi từ sản xuất IgM sang IgG ........................................ 13
Hình 2.8 Trên bao thẩm tích có các lỗ nhỏ cho phép các phân tử muối đi ra ngoài
còn KT bị giữ lại .................................................................................. 17
H ình 2.9 Phản ứng ngƣng kết do kháng thể tạo nên ............................................. 19
Hình 2.10 Kháng thể IgG gắn với protein A của S. aureus .................................... 20
Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh ........................................................................... 26
Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate trƣớc và sau thẩm
tích ........................................................................................................ 27
Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết trên phiến kính ...................................................... 30
Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm ........................................ 32
Hình 7.1 Thỏ nuôi thí nghiệm ............................................................................... 50
Hình 7.2 Lấy máu tĩnh mạch tai ........................................................................... 50
Hình 7.3 Tiêm dƣới da .......................................................................................... 50
xi

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 3.1 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình ngắn ngày ........................ 23
Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện
Pasteur Tp. HCM) ................................................................................. 24
Bảng 4.1 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh của thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................ 33
Bảng 4.2 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh của thỏ 3, thỏ 4 và thỏ 5 ............................................................. 34
Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể ngƣng kết của kháng huyết thanh
thỏ 1 và thỏ 2 ........................................................................................ 35
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh thỏ 3 và
thỏ 4 ...................................................................................................... 36
Bảng 4.5 Trung bình hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh thỏ ở

qui trình ngắn ngày và dài ngày ............................................................ 37
Bảng 4.6 Kết quả phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với kháng huyết thanh gắn
S. aureus ở các nồng độ khác nhau ....................................................... 38
Bảng 4.7 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 1 và thỏ 2
............................................................................................................ 39
Bảng 4.8 Kết quả thử phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính với kháng huyết
thanh đƣợc xử lí và không đƣợc xử lí với S. aureus của thỏ 3, thỏ 4 và
thỏ 5 ...................................................................................................... 39
Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp
phụ của thỏ 1 và thỏ 2 (qui trình ngắn ngày) ........................................ 40
Bảng 4.10 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của kháng huyết thanh sau khi hấp
phụ của thỏ 3 và thỏ 4 (qui trình dài ngày) ........................................... 41
xii

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ

BIỂU ĐỒ TRANG
Biểu đồ 4.1 Biến đổi hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của
thỏ 1 và thỏ 2 theo thời điểm lấy mẫu ............................................. 35
Biểu đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã
thẩm tích của thỏ 2 ........................................................................... 36
Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong kháng huyết thanh của thỏ 3 và
thỏ 4 ở các thời điểm khác nhau ...................................................... 36
Biểu đồ 4.4 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh lúc đầu và KHT đã
thẩm tích của thỏ 4 ........................................................................... 37
Biểu đồ 4.5 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không
đƣợc hấp phụ của thỏ 1 và thỏ 2 ở qui trình ngắn ngày .................. 41
Biểu đồ 4.6 Hiệu giá kháng thể ngƣng kết trong huyết thanh đƣợc hoặc không
đƣợc hấp phụ của thỏ 3 và thỏ 4 ở qui trình dài ngày ..................... 42

xiii

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ

SƠ ĐỒ TRANG
Sơ đồ 3.1 Qui trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli ............................ 22
Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh ......................................... 25
Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu ................................. 28
Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus .... 29
Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết
chậm trong ống nghiệm ........................................................................ 31



1

PHẦN 1
MỞ ĐẦU

1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong chăn nuôi việc chẩn đoán, phát hiện bệnh sớm để điều trị kịp thời sẽ làm
giảm đáng kể những thiệt hại gây ra về kinh tế cũng nhƣ sức khỏe của ngƣời tiêu dùng.
Tùy theo từng tác nhân gây bệnh mà có các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh khác nhau.
Thông thƣờng để chẩn đoán bệnh do vi sinh vật ngƣời ta dùng phƣơng pháp cổ điển là
nuôi cấy phân lập tế bào vi sinh vật, định danh chúng bằng các phản ứng huyết thanh
học. Kĩ thuật hiện đại nhƣ PCR (Polymerase Chain Reaction) có độ nhạy và độ đặc
hiệu cao hơn các phƣơng pháp kinh điển do đó giúp chẩn đoán nhanh và chính xác
hơn. Nhƣng kĩ thuật này đòi hỏi phải có trang thiết bị và nguyên liệu riêng, đắt tiền, kĩ
thuật thực hiện còn phức tạp, cán bộ kĩ thuật phải có trình độ kĩ thuật nhất định.
Các kĩ thuật chẩn đoán miễn dịch học mà điển hình là kĩ thuật ELISA (Enzyme-

linked immunosorbent assay) cũng tỏ ra rất hiệu quả trong việc chẩn đoán nhanh và
chính xác các vi sinh vật gây bệnh không thua kém phƣơng pháp PCR. Nguyên tắc của
kĩ thuật này dựa trên sự kết hợp giữa kháng nguyên với một kháng thể đặc hiệu. Dựa
vào nguyên tắc này các nhà sản xuất tạo ra các bộ kít chẩn đoán phát hiện vi sinh vật
gây bệnh để ngƣời chăn nuôi có thể tự mình kiểm tra xem vật nuôi có mang mầm bệnh
hay không nhƣ bộ kit chẩn đoán bệnh đốm trắng cho tôm...
Hiện nay ở Việt Nam việc sản xuất kháng huyết thanh và kháng thể phục vụ cho
việc chẩn đoán bệnh bằng miễn dịch học trong chăn nuôi còn ít, chỉ mới áp dụng cho
một số bệnh.
Xuất phát từ yêu cầu thực tế đó chúng tôi đi vào nghiên cứu đề tài “Thử nghiệm
sản xuất kháng huyết thanh kháng vi khuẩn E. coli” để phục vụ cho việc chẩn đoán
nhanh và điều trị bệnh kịp thời. Ngoài ra có thể ứng dụng vào sản xuất kháng huyết
thanh kháng các vi sinh vật gây bệnh quan trọng khác.





2

1.2. MỤC ĐÍCH, YÊU CẦU
1.2.1. Mục đích
Xây dựng và hoàn thiện quy trình sản xuất kháng huyết thanh phục vụ cho công
tác chẩn đoán bệnh.
1.2.2. Yêu cầu
 Xây dựng quy trình tiêm thỏ thí nghiệm.
 Thu nhận kháng huyết thanh từ thỏ thí nghiệm.
 Đánh giá chất lƣợng kháng huyết thanh thu đƣợc.

3
PHẦN 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH
2.1.1. Khái niệm miễn dịch
Miễn dịch là khả năng đề kháng của sinh vật chống lại một sinh vật khác và các

chất mang trên bản thân chúng với những dấu hiệu thông tin di truyền ngoại lai.
Khả năng miễn dịch của một cơ thể phụ thuộc vào nhiều yếu tố di truyền của loài,
sức đề kháng của mỗi cá thể, điều kiện ngoại cảnh (dinh dƣỡng, vệ sinh, môi
trƣờng…).
2.1.2. Kháng nguyên [2]
2.1.2.1. Định nghĩa
Kháng nguyên (KN) là tất cả các chất, đôi khi kể cả thành phần cấu tạo của cơ
thể, khi xâm nhập vào cơ thể sinh vật sẽ gây nên một đáp ứng miễn dịch, tức một quá
trình sinh học phức tạp dẫn đến sự tổng hợp một phân tử đặc biệt gọi là kháng thể dịch
thể hoặc kháng thể tế bào và chúng có đặc tính liên kết đặc hiệu với KN đó.
2.1.2.2. Khái niệm về epitop (biểu vị)
Epitop là những cấu trúc trên bề mặt của phân tử KN, có khả năng tạo kháng thể
riêng biệt hoặc những thụ thể đặc hiệu trên bề mặt của một số tế bào lympho.
Epitop có 2 đặc tính:
Tính KN: là đặc tính của một epitop có cấu trúc ba chiều liên kết bổ sung với
phần cấu trúc ba chiều của phân tử kháng thể (KT). Phần cấu trúc này của
phân tử KT hoặc của thụ thể đƣợc gọi là paratop.
Tính miễn dịch: của một epitop là đặc tính gây ra một đáp ứng miễn dịch
trong một cơ thể.
Nếu KN là protein thì kích thƣớc của một epitop KN vào khoảng 5-10 gốc acid
amin. Một phân tử KN có thể có một hoặc nhiều epitop. Số lƣợng epitop phụ thuộc
vào kích thƣớc của phân tử KN và thƣờng có khoảng 1 epitop cho mỗi 5 kDa.





4
2.1.3. Kháng thể dịch thể [2]
2.1.3.1. Định nghĩa

Kháng thể dịch thể hay immunoglobulin (Ig) là protein “dạng cầu” đƣợc tổng hợp
bởi tế bào tƣơng (plasma cell) khi bị kích thích bởi KN. Nó đƣợc tạo ra để giúp sinh
vật chống đỡ các yếu tố KN có hại xâm nhập vào cơ thể.
2.1.3.2. Cấu trúc của một phân tử immunoglobulin
Phân tử Ig gồm một hay nhiều đơn
vị với cấu trúc tƣơng đối giống nhau.
Mỗi đơn vị là một phân tử protein có 4
chuỗi polypeptid giống nhau từng đôi
một: 2 chuỗi nhẹ và 2 chuỗi nặng,
chúng đƣợc nối với nhau bằng những
cầu nối disulfua (-S-S-) (hình 2.1).

Chuỗi nhẹ L (light chain)
Chuỗi nhẹ có trọng lƣợng phân tử
khoảng 23.000 Da. Có hai loại chuỗi
nhẹ chung cho tất cả các lớp Ig:
Chuỗi nhẹ Kappa (kí hiệu K
hay κ)
Chuỗi nhẹ Lambda (kí hiệu λ)
Tỉ lệ mang chuỗi nhẹ κ và λ của các Ig khác nhau giữa các loài.
Chuỗi nhẹ đƣợc chia thành hai phần dài bằng nhau:
 Phần hằng định: kí hiệu C
L
(constant) có tận cùng –COOH với trình tự acid
amin tƣơng đối không đổi.
 Phần thay đổi: kí hiệu V
L
(variable) có tận cùng là –NH
2
. Trật tự acid amin

trong vùng này thay đổi từng nhóm một, rất khác nhau từ cá thể này đến cá
thể khác và ngay trong một cá thể, phần này đƣợc kí hiệu V
κ
(cho type kappa)
và V
λ
(cho type lambda).
Chuỗi nặng H (heavy chain)
Chuỗi nặng có trọng lƣợng phân tử từ 50.000 Da đến 70.000 Da tùy theo lớp Ig
(IgM, IgG, IgA, IgE…). Chuỗi nặng cũng chia thành 2 vùng: vùng hằng định (C
H
) và
vùng thay đổi (V
H
).

Hình 2.1 Cấu trúc tổng quát phân
tử kháng thể
(
RC/VL/GG/antiBD_mol.html)


5
Ngƣời ta phân biệt 5 lớp Ig chủ yếu dựa vào sự khác nhau của các mạch
polypepptid trong chuỗi nặng. Nếu trong chuỗi nặng của Ig có các chuỗi:
Gamma (γ) thì Ig đó đƣợc gọi là IgG
Muy (μ) thì Ig đó đƣợc gọi là IgM
Alpha (α) thì Ig đó đƣợc gọi là IgA
Delta (δ) thì Ig đó đƣợc gọi là IgD
Epsilon (ε) thì Ig đó đƣợc gọi là IgE

Ngoài các phần bất biến và siêu biến, chuỗi nặng còn một nhóm glucid đƣợc gọi
là oligosaccharide có nhiệm vụ cố định bổ thể giúp cho kháng thể dễ dàng bám vào bề
mặt của tế bào thực bào và quyết định tính KN của phân tử KT.
Theo quan điểm ngày nay thì vùng siêu biến của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ tham
gia vào sự hình thành cấu trúc bổ sung đặc hiệu trong sự kết hợp với KN (paratop).
Paratop không phải là một đoạn peptid liên tục, dài mà chỉ là một (hoặc một số)
acid amin nằm cách quãng. Đó là những “điểm” mà paratop tiếp xúc với epitop, thông
thƣờng mỗi paratop có từ 3-6 “điểm” nhƣ vậy.
2.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả năng đáp ứng miễn dịch của thú [2] [13]
2.1.4.1. Loài thú
Đáp ứng miễn dịch càng tăng khi có sự khác biệt di truyền giữa thú gây miễn dịch
(túc chủ) với loài đƣợc sử dụng làm kháng nguyên càng lớn vì kháng nguyên sẽ có
nhiều epitop lạ đối với túc chủ.
Đối với hầu hết các kháng nguyên protein, thỏ là thú thuận tiện để gây miễn dịch
thực nghiệm.
2.1.4.2. Yếu tố di truyền
Khả năng đáp ứng miễn dịch của thú còn phụ thuộc vào yếu tố di truyền vì với
cùng một loại kháng nguyên nếu đƣa vào các cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn
dịch khác nhau. Thông thƣờng các thú lai khác dòng có khả năng kích thích miễn dịch
cao hơn các thú lai cùng dòng.







6
2.1.4.3. Kháng nguyên
a. Tính lạ của kháng nguyên

Điều kiện quan trọng để một kháng nguyên có tính sinh miễn dịch cao là sự khác
biệt chủng loài giữa túc chủ và kháng nguyên.
Trong miễn dịch dịch thể, kháng nguyên càng lạ với túc chủ bao nhiêu, khả năng
sinh miễn dịch càng cao bấy nhiêu. Còn trong miễn dịch qua trung gian tế bào, chỉ cần
sự khác nhau giữa các cá thể cũng gây đáp ứng miễn dịch cao.
b. Cấu tạo hóa học của kháng nguyên
 Protein và polysaccharide
Là 2 nhóm kháng nguyên thông thƣờng nhất vì các vỏ vi khuẩn hoặc các độc tố là
các protein hoặc glycoprotein. Chúng đều cho tính miễn dịch cao khi ở dạng hòa tan
hay liên kết trong các cấu trúc phức tạp.
Đặc tính kháng nguyên của nhiều loại glycoprotein trƣớc hết đƣợc biểu hiện bởi
các phần gốc đƣờng của chúng.
Protein ở dạng kết tụ (aggregation) gây đáp ứng miễn dịch tốt hơn protein ở dạng
hòa tan.
 Lipid và acid nucleic
Là 2 nhóm kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch kém. Thông thƣờng, lipid chỉ
biểu hiện tính kháng nguyên khi ở dạng kết hợp với polysaccharide hoặc protein…
c. Kích thước của phân tử kháng nguyên
Kháng nguyên có kích thƣớc lớn và cấu trúc càng phức tạp thì chúng càng dễ bị
đại thực bào phát hiện và xử lí nên có tính sinh miễn dịch cao, những kháng nguyên có
cấu trúc phân tử nhỏ dễ bị đại thực bào bỏ qua nên có tính sinh miễn dịch thấp.
Ngoài ra, các KN có kích thƣớc nhỏ có thể gắn với các protein mang để tạo đáp
ứng miễn dịch.
d. Khả năng bị chuyển hóa của phân tử kháng nguyên
Sự chuyển hóa kháng nguyên trong cơ thể vật chủ là yếu tố quan trọng cho tính
sinh miễn dịch, vì khi đƣợc chuyển hóa các kháng nguyên dễ bộc lộ các quyết định
KN ra ngoài.
Các phân tử không bị phân hủy bởi tế bào (không đƣợc tế bào nhận biết và cải
biến) thì không gây ra đáp ứng miễn dịch.

7
Ví dụ: D-amino acid là một kháng nguyên yếu vì enzyme của động vật hữu nhũ
không phân hủy amino acid dạng này.
e. Liều lượng kháng nguyên
Nếu lƣợng kháng nguyên quá ít thì không đủ gây đáp ứng miễn dịch. Ngƣợc lại
nếu lƣợng kháng nguyên nhiều quá sẽ gây ức chế miễn dịch.
Ở các mũi nhắc nên giảm lƣợng kháng nguyên 2 – 3 lần so với gây mẫn cảm để
tăng ái lực của kháng thể cần tạo nên.
f. Đường xâm nhập của kháng nguyên vào cơ thể
Kháng nguyên gây đáp ứng miễn dịch mạnh nhất khi chúng đƣợc tiêm trực tiếp
vào hạch bạch huyết vùng kheo của thú. Tuy nhiên cách này đòi hỏi trình độ tay nghề
cao.
Tiêm kháng nguyên nhiều mũi dƣới da, trong da hoặc tiêm một mũi trong bắp thịt
đƣợc áp dụng rộng rãi hơn vì đơn giản dễ thực hiện và cho kết quả mong muốn.
Ngoài ra với các kháng nguyên mạnh (vi khuẩn, virus, tế bào…) khi đƣa vào
đƣờng mạch máu có thể dễ dàng gây ra đáp ứng miễn dịch. Nhƣng với kháng nguyên
hòa tan thì phải có qui trình gây đáp ứng miễn dịch thích hợp, tốt nhất là tiêm trong da,
dƣới da và phải tiêm nhắc lại nhiều lần.
g. Hiệu ứng cộng lực kháng nguyên
Nếu cùng một lúc gây mẫn cảm nhiều loại kháng nguyên cho con thú thì kháng
thể đặc hiệu đƣợc sinh ra tƣơng ứng với mỗi loại kháng nguyên sẽ ít nhất ngang bằng
hoặc nhiều hơn khi kháng nguyên đó kích thích một mình. Hiện tƣợng này gọi là sự
cộng lực kháng nguyên hay cộng kích thích kháng nguyên.
Tuy nhiên cũng có trƣờng hợp cùng một lúc gây mẫn cảm cho thú với hai loại
kháng nguyên: một liều mạnh, một liều nhẹ thì con thú có thể chỉ phản ứng với kháng
nguyên liều mạnh. Hiện tƣợng này gọi là sự cạnh tranh kháng nguyên, chỉ xảy ra ở hai
kháng nguyên có cấu trúc hóa học gần giống nhau.
2.1.4.4. Qui trình gây miễn dịch
Qui trình gây miễn dịch có ảnh hƣởng lớn đến đáp ứng miễn dịch đối với phân tử

kháng nguyên. Cùng một loại kháng nguyên, gây miễn dịch trên hai lô thí nghiệm qua
hai qui trình chủng ngừa khác nhau thì đáp ứng miễn dịch cũng khác nhau. Mỗi loại
kháng nguyên thích hợp với một loại qui trình gây miễn dịch riêng. Với những kháng
nguyên yếu thƣờng phải chủng ngừa bằng qui trình hết sức nghiêm ngặt và chủng


8
nhiều lần mới có đáp ứng miễn dịch mạnh. Trong khi đó, những kháng nguyên mạnh
có khi chỉ cần chủng ngừa một lần cũng gây đáp ứng miễn dịch.
Nếu cho mẫn cảm kháng nguyên với một con vật đã đƣợc mẫn cảm với kháng
nguyên đó một lần, thì hàm lƣợng kháng thể sẽ tăng sớm và nhiều hơn lần đầu (có
những trƣờng hợp gấp hàng trăm lần). Ngoài ra khi tiêm nhắc lại nhiều lần thì sẽ có sự
chọn lọc các dòng tế bào lympho B sản xuất kháng thể và chỉ tăng sinh những dòng
sản xuất kháng thể có ái lực cao với kháng nguyên nếu giới hạn tối đa kháng nguyên
đƣa vào.
Thƣờng tiêm mũi nhắc lại lần một sau khi đáp ứng miễn dịch ở mũi gây mẫn cảm
giảm xuống (đối với thỏ khoảng 4-6 tuần). Các mũi tiêm nhắc lại tiếp theo nên cách
nhau một khoảng thời gian nhất định để thú có khả năng đáp ứng miễn dịch cao nhất
với kháng nguyên.
Khoảng 10-15 ngày sau mỗi lần tiêm nhắc lại ta có thể lấy máu (20-40 ml), kháng
huyết thanh nên đƣợc kiểm tra sự hiện diện của kháng thể. Nếu thú đáp ứng miễn dịch
yếu sau mũi nhắc lại lần hai thì nên loại bỏ.
2.1.4.5. Chất bổ trợ
Các tá chất đƣợc sử dụng rộng rãi để tăng hiệu quả của các loại vaccine, tăng khả
năng thực bào của đại thực bào đối với kháng nguyên. Ngoài ra, tá chất còn gây một
phản ứng viêm không đặc hiệu làm tăng tính sinh miễn dịch.
Các nghiên cứu gần đây đã kết luận tá chất có tác dụng làm tăng lympho hỗ trợ
(lympho T helper - T
H
). Khi bổ sung tá chất vào kháng nguyên sẽ làm kháng nguyên

tồn tại lâu hơn trong cơ thể túc chủ. Kháng nguyên đƣợc giải phóng dần dần có tác
dụng giống nhƣ kích thích miễn dịch nhiều lần.
Một số loại tá chất: Freund’s Complete Adjuvant (FCA) và Freund’s Incomplete
Adjuvant (FIA), Aluminum hydroxide (ALUM), Rabi Adjuvant System (RAS),
Syntex Adjuvant Formulation (SAF)…








9
2.1.5. Cơ chế đáp ứng miễn dịch dịch thể [3] [6] [8] [13]
2.1.5.1. Các tế bào tham gia đáp ứng miễn dịch dịch thể
a. Tế bào trình diện kháng nguyên (APC: antigen-presenting cell)
Tế bào trình diện kháng nguyên có 2 đặc tính: có các kháng nguyên phù hợp tổ
chức chính lớp II (Major histocompatibility complex class II antigens – MHC class II
antigens) trên bề mặt tế bào và tiết interleukine 1 (IL-1) (ngoài ra nó còn tiết nhiều
cytokine khác.
Có 2 nhóm tế bào trình diện kháng nguyên:
 Tế bào trình diện kháng nguyên “chuyên nghiệp” (“professional” APC): chủ
động bắt và trình diện KN. Bao gồm các tế bào: đại thực bào, tế bào tua
(dendritic cell), tế bào B.
 Các tế bào khác, chỉ trình diện kháng nguyên khi tế bào bị nhiễm.
Khi xâm nhập vào cơ thể các KN đƣợc các APC “chuyên nghiệp” tóm bắt bằng
cách thực bào (đại thực bào) hay gắn với các thụ quan đặc hiệu (specific receptor) Ig
trên bề mặt tế bào (tế bào B).
Đối với KN protein ngoại bào

Sau khi các APC bắt giữ KN, KN sẽ đƣợc đƣa vào các nang endosome bên trong
tế bào. Các APC cũng có thể ẩm bào để hút các protein hòa tan (kích thƣớc ≤ 1 µm)
vào các endosome này. Ở đây, các KN sẽ đƣợc xử lí trong khu vực acid nội bào nhờ
các protease phân cắt protein thành các peptid ngắn. Các peptid thẳng này gắn với
phân tử MHC lớp II tạo thành phức hợp kháng nguyên – MHC (KN – MHC) và đƣợc
biểu lộ trên bề mặt tế bào (hình 2.2).
Đối với KN có bản chất là lipid hoặc polysaccharide (KN không phụ thuộc
tuyến ức)
Các KN này chỉ trình diện đƣợc với tế bào B và không thể xử lí đến dạng kết hợp
đƣợc với các phân tử MHC nên không đƣợc các tế bào T nhận biết, không gây đƣợc
các đáp ứng miễn dịch tế bào.
Ngoài ra khi KN bị bắt giữ vào trong tế bào APC nó sẽ kích thích tế bào tiết ra
interleukin 1 hay còn gọi là yếu tố hoạt hóa tế bào lympho LAF (lymphocyte
activating factor) là một trong hai yếu tố cần thiết để hoạt hóa tế bào lympho T
H
(yếu
tố kia là sự nhận biết phức hợp KN-MHC của thụ thể tế bào T).



10
b. Tế bào lympho T
H

Quần thể tế bào lympho T đƣợc kháng nguyên trình diện gọi là tế bào lympho T
hỗ trợ (helper T cell – T
H
)
Tế bào lympho T đƣợc hoạt hóa khi có khoảng 200 – 300 phức hợp KN – MHC
gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4

+
trên bề mặt tế bào lympho T (T cell receptor –
TCR) và sự hiện diện của yếu tố đồng kích thích interleukin 1 (tùy loại tế bào lympho
T
H
). Khi đƣợc kích thích, tế bào T
H
tiết ra hỗn hợp các cytokine cần thiết cho sự tăng
sinh và biệt hóa tế bào B thành tế bào plasma sản xuất kháng thể.

c. Tế bào lympho B
Tế bào lympho B là tế bào sinh kháng thể, quá trình biệt hóa tế bào B thành tế bào
tƣơng (plasma cell) sản xuất kháng thể có thể chia thành 2 giai đoạn:
 Giai đoạn 1: các tế bào nguồn trong tủy xƣơng đƣợc biệt hóa thành tiền
lympho B, sau đó thành các lympho B chƣa chín và cuối cùng phát triển thành lympho
B chín với các immunoglobulin bề mặt SIg (Surface immunoglobulin). Giai đoạn này
không cần sự kích thích của kháng nguyên và sự có mặt của tế bào lympho T
H
.


Hình 2.2 KN đƣợc tế bào B tóm
bắt, phân cắt, gắn với MHC lớp II
và biểu lộ trên bề mặt tế bào.
(trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13]

Hình 2-1 KN đƣợc tế bào B tóm bắt,
phân cắt, gắn với MHC lớp II và biểu

Hình 2.3 Phức hợp KN- MHC lớp II
gắn với phức hợp thụ thể TCR/CD4
+

trên tế bào T
H
.
(trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13]

Hình 2-1 KN đƣợc tế bào B tóm bắt,


11
 Giai đoạn 2: các tế bào lympho B chín biệt hóa thành tế bào tƣơng sản xuất
kháng thể. Quá trình này cần sự kích thích của kháng nguyên, một số interleukin và sự
kết hợp của tế bào T
H
với lympho B.
Tế bào plasma là những tế bào hình trứng, đƣờng kính 8-9 µm, có nhân tròn lập dị
với các chromatin không đồng dạng. Chúng có tế bào chất lớn với mạng lƣới nội chất
hạt dày đặc (hình 2.4).

Hình 2.4 Cấu trúc đặc trƣng của tế bào plasma

(trích dẫn liệu của Tizard, 1992) [13]

2.1.5.2. Cơ chế hình thành đáp ứng miễn dịch dịch thể
a. Đối với kháng nguyên phụ thuộc vào tuyến ức (KN có bản chất protein)
Khi KN xâm nhập vào cơ thể, chúng bị các tế bào trình diện KN bắt giữ, phân cắt
chúng thành những đoạn nhỏ và gắn vào các phân tử MHC lớp II tạo thành phức hợp
kháng nguyên – phân tử MHC (KN-MHC) biểu lộ trên bề mặt tế bào APC. Đồng thời
KN cũng kích thích APC tiết IL-1.
Phức hợp KN-MHC và IL-1 đƣợc nhận biết bởi phức hợp thụ thể TCR/CD4
+
và
thụ thể IL-1 trên bề mặt tế bào T
H
. Khi đó tế bào lympho T đƣợc hoạt hóa sẽ tăng sinh
và tiết IL-2, IL-4, IL-5 để kích thích sự phát triển của tế bào B thành tế bào plasma sản
xuất immunoglobulin.
Khi kháng nguyên gắn với SIg thích hợp trên tế bào B chín với sự hiện diện của tế
bào T
H
, IL-2, IL-4 thì tín hiệu đƣợc truyền vào trong tế bào. Lúc này tế bào B sẽ trải
qua quá trình tăng sinh và biệt hóa thành dòng tế bào plasma tổng hợp kháng thể dịch
thể hay immunoglobulin, chúng có cấu trúc giống nhƣ SIg mà KN đã chọn lọc để gắn


12
nhƣng với ái tính cao hơn khi kết hợp với KN đặc hiệu. Tế bào plasma có khả năng
tổng hợp 300 phân tử Ig mỗi giây. IgM là loại KT xuất hiện đầu tiên khi cơ thể bị kích
thích bởi KN, sau đó một vài ngày thì IgG, IgA và IgE xuất hiện (trong đó IgG là chủ
yếu) và dần thay thế IgM. Thông thƣờng khi IgG xuất hiện thì IgM sẽ tiêu biến, nhƣng
cũng có trƣờng hợp IgM tồn tại rất lâu (ví dụ KT IgM chống lại KN O của vi khuẩn

Samonella).
Trong khi một số biệt hóa thành tế bào plasma thì một số tế bào B khác chuyển
thành tế bào nhớ giúp cho đáp ứng lần sau với chính KN đó nhanh hơn và mạnh hơn.
Đáp ứng thứ phát: khi có sự tiếp xúc với kháng nguyên lần đầu và nếu cho tiếp
xúc lần sau với chính kháng nguyên đó thì KN gắn với các thụ thể tƣơng ứng là các
phân tử KT trên bề mặt của tế bào B nhớ làm tế bào nhớ tăng sinh và biệt hoá thành tế
bào plasma sản xuất KT do đó chúng ta sẽ thấy rõ hàm lƣợng kháng thể tăng nhanh và
cao hơn nhiều lần so với lần đầu.

Hình 2.5 Đáp ứng của tế bào B với kháng nguyên và mối liên hệ giữa sự đáp ứng
này với hàm lƣợng kháng thể trong huyết thanh.
( />20Course.jpg)