Luận văn : THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH KHÁNG VI KHUẨN E. coli part 5 ppsx

24

Bảng 3.2 Gây miễn dịch thu kháng thể theo qui trình dài ngày (qui trình viện Pasteur Tp. HCM)


L. máu = lấy máu
Lấy máu kiểm tra kháng thể vào các ngày: 0, 14, 42, 70, 98, 126, 154.

Mũi nhắc lại 5
154
L.máu
(ml)

Lấy hết
140
Tiêm
(ml)
1,5
1,5
1
0,75
Mũi nhắc lại 4
126
L.máu
(ml)

50
112
Tiêm
(ml)
1,5
1,5
1
0,75
Mũi nhắc lại 3
98
L.máu
(ml)

50
84
Tiêm
(ml)
1,5
1,5
1
0,75
Mũi nhắc lại 2
70
L.máu
(ml)

1
56
Tiêm
(ml)

2
2
1,5
1
Mũi nhắc lại 1
42
L.máu
(ml)

1
28
Tiêm
(ml)
2
2
1,5
1
Mũi mẫn cảm
14
L.máu
(ml)

1
1
Tiêm
(ml)
2
2
1,5
1

0
L.máu
(ml)

1
Ngày

Thỏ
6
5
4
3


25
3.4.2. Thu nhận kháng huyết thanh
Kháng huyết thanh thu vào các ngày 25, 30, 35 ở qui trình 1 (bảng 3.1) và ở các
ngày 98, 126, 154 ở qui trình 2 (bảng 3.2)
 Trƣớc khi lấy máu tráng ống bằng nƣớc muối sinh lí 0,85%
V
nƣớc muối sinh lí
= 0,1 % thể tích máu
 Lấy máu ở tĩnh mạch tai
 Sau khi lấy máu xong dùng que cấy khử trùng vét xung quanh ống
 Cho NaN
3
vào
V
NaN3

= 0,05% V
máu
 Để qua đêm ở 4
o
C
 Tách lấy huyết thanh, sau đó li tâm bỏ phần cặn. Kháng huyết thanh đƣợc chia
làm 2 phần:
Phần 1: để nguyên kháng huyết thanh, bổ sung glycerol (V
glycerol
= 10% V
KHT
).
Bảo quản ở 4
o
C.
Phần 2: kháng huyết thanh đƣợc tủa trong amonium sulfate bão hòa.
KHT nguyên đƣợc sử dụng trực tiếp trong phản ứng ngƣng kết hoặc cho gắn với
protein A của Staphylococcus aureus hoặc xử lí hấp phụ với kháng nguyên vi khuẩn
E. coli E68 và sau đó dùng cho phản ứng ngƣng kết đánh giá hiệu giá kháng thể. Việc
xử lí KHT đƣợc tiến hành theo sơ đồ 3.2

Sơ đồ 3.2 Qui trình chung về xử lí kháng huyết thanh
KHT
KHT nguyên
(bổ sung glycerol)
KHT kết tủa,
thẩm tích
Hấp phụ
Gắn protein A
Định tính
Định lƣợng


26
3.4.2.1. Tách kháng thể bằng amonium sulfate bão hoà
 Máu sau khi để ở 4
o
C qua đêm, đem li tâm tách kháng huyết thanh
 Cho vào mỗi chai đựng huyết thanh lƣợng PBS 1X (V
PBS
= 3V
huyết thanh
)


 Tủa huyết thanh thỏ bằng dung dịch amonium sulfate 100%S
V (NH
4
)

2
SO
4
= V
huyết thanh
+ V
PBS

Huyết thanh thỏ / PBS 1X đƣợc để trong nƣớc đá bào trên máy khuấy từ
Nhỏ từng giọt (NH
4
)
2
SO
4
100%S. Sau khi cho hết lƣợng (NH
4
)
2
SO
4
vào
tiếp tục khuấy 45 – 60 phút
 Để 4
o
C qua đêm
 Li tâm tách kết tủa
 Rửa tủa 3 lần bằng dung dịch (NH
4
)

2
SO
4
45%
 Cho vào ống 50 ml, giữ tủa / amonium sulfate 45% ở 4
o
C
Đối với trƣờng hợp lấy 1 ml máu: sau khi lấy máu cho 0,01 ml NaN
3
để ở 4
o
C qua
đêm. Sau đó đem li tâm tách huyết thanh và cho glycerol vào (V
glycerol
= 10 % V
h. thanh
).










3.4.2.2. Phục hồi kháng thể
Kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% đƣợc phục hồi bằng phƣơng pháp thẩm
tích.

 Chuẩn bị bao thẩm tích
Bao thẩm tích đƣợc cắt ra và rửa qua nƣớc cất, sau đó cho vào cốc nƣớc cất chứa
2 mM EDTA. Đun 3 giờ rồi rửa lại bằng nƣớc cất cho sạch EDTA. Cho vào bình chứa
cồn 30
o
, bảo quản ở 4
o
C.

Hình 3.1 Tủa kháng huyết thanh


27
 Thực hiện thẩm tích
Cho kháng thể tủa trong amonium sulfate 45% vào bao thẩm tích  dùng kẹp kẹp
2 đầu bao thẩm tích lại  đặt bao thẩm tích vào dung dịch buffer PBS  để 5-6 giờ ở
4
o
C. Thực hiện 3 lần thẩm tích nhƣ trên sau đó thu kháng thể để xác định hiệu giá.

Hình 3.2 Dịch kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate
trƣớc và sau thẩm tích

3.4.3. Xử lí kháng huyết thanh
Kháng huyết thanh nguyên và kháng huyết thanh tủa trong amonium sulfate, thẩm
tích đƣợc xử lí để loại bỏ các kháng thể không đặc hiệu hoặc gắn với protein A của
S. aureus.










trƣớc thẩm tích sau thẩm tích


28
3.4.3.1. Hấp phụ kháng thể không đặc hiệu
Kháng thể không đặc hiệu trong kháng huyết thanh đƣợc xử lí hấp phụ theo qui
trình minh họa qua sơ đồ 3.3

Sơ đồ 3.3 Qui trình hấp phụ các kháng thể không đặc hiệu














Lấy 0,5 ml canh khuẩn cấy trên đĩa thạch TSA đƣờng kính 15 cm
Ủ 37
o
C qua đêm
Rửa vi khuẩn bằng 3 ml nƣớc muối sinh lí 0,85%
thu dịch huyền phù vi khuẩn
Pha với 1 ml kháng huyết thanh (hoặc kháng thể đã thẩm tích)

+ 6 ml dung dịch phenol 0,25%
Ủ 50
o
C trong 2h
Li tâm 4000 vòng/phút trong 1h

Thu dịch kháng thể trong
Nuôi E. coli chủng gốc (K88
+
) trong môi trƣờng canh TSB
5-6h ở 37
o
C


29
3.4.3.2. Gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus
Kháng thể có trong kháng huyết thanh đƣợc xử lí gắn với protein A của
Staphylococcus aureus theo qui trình minh họa qua sơ đồ 3.4

Sơ đồ 3.4 Qui trình gắn kháng thể với protein A của Staphylococcus aureus



Nuôi Staphylococcus aureus trong môi trƣờng canh TSB

ủ 5-6h ở 37
o
C

Lấy 0,5 ml canh khuẩn cấy trên đĩa petri môi trƣờng TSA

ủ 37
o
C qua đêm

Rửa vi khuẩn bằng 10 ml nƣớc muối sinh lí 0,85%
thu dịch huyền phù vi khuẩn

Li tâm (4000 vòng/phút trong 30 phút) bỏ dịch nổi

Rửa trong 10 ml nƣớc muối sinh lí

Li tâm bỏ dịch nổi

Hòa tan trong nƣớc muối chứa 0,3 % (v/v) formalin

Pha loãng trong nƣớc muối sinh lí để đạt nồng độ thử nghiệm

Li tâm bỏ dịch nổi

ủ 4
o
C qua đêm

Ủ 50
o
C trong 2h

Cho kháng huyết thanh vào với tỉ lệ

KHT : dịch VK là 1:4 hoặc 1:9

Dịch kháng thể gắn với protein A của S. aureus



30
3.4.4. Đánh giá
3.4.4.1. Định tính (bằng phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính)
Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính là phản ứng có tính chất định tính,
thƣờng sử dụng KN đã biết và đƣợc nhuộm màu để phát hiện KT tƣơng ứng trong
huyết thanh, thƣờng dùng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm.
a. Cách thực hiện
Nhỏ tách riêng trên phiến kính 1 giọt kháng huyết thanh (nguyên hoặc gắn
S. aureus) thu đƣợc sau khi tiêm kháng nguyên gây miễn dịch và 1 giọt kháng huyết
thanh thu đƣợc trƣớc khi tiêm kháng nguyên để làm đối chứng âm. Sau đó nhỏ thêm 1
giọt dịch vi khuẩn (vi khuẩn O139:K82 đƣợc cấy trên môi trƣờng canh TSB và ủ 37
o
C
qua đêm) và lắc nhẹ để trộn đều vi khuẩn với KHT, kết quả đƣợc đọc sau đó khoảng
30 giây đến 1 phút .
b. Đọc kết quả
 Nếu trong huyết thanh có kháng thể đặc hiệu với vi khuẩn thì trong huyễn
dịch vi khuẩn và kháng huyết thanh sẽ hình thành nên rất nhiều hạt ngƣng kết lớn màu
trắng đục và đều khắp giọt huyễn dịch, nhìn thấy rõ bằng mắt thƣờng, phản ứng đƣợc
đọc là dƣơng tính (+). Tùy theo kích thƣớc hạt ngƣng kết lớn hay nhỏ mà ta đánh giá
phản ứng dƣơng tính là:
+ nếu hạt ngƣng kết nhỏ, ít nhƣng vẫn thấy đƣợc bằng mắt thƣờng
+++ nếu hạt ngƣng kết rất lớn, nhiều màu trắng đục và thấy rất rõ bằng
mắt thƣờng

++ nếu hạt ngƣng kết ở dạng trung gian giữa + và +++
 Nếu huyễn dịch vi khuẩn vẫn đồng nhất, không thấy có sự xuất hiện các hạt
ngƣng kết, phản ứng đƣợc đọc là âm tính (-).

Hình 3.3 Phản ứng ngƣng kết nhanh trên phiến kính
(-)
(+++)


31
3.4.4.2. Định lƣợng (định hiệu giá bằng phản ứng ngƣng kết chậm trong ống
nghiệm)
Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm là phản ứng vừa có tính định tính,
vừa có tính định lƣợng hàm lƣợng kháng thể (bán định lƣợng).
Phản ứng này thƣờng đƣợc sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán y học, thú y học nhƣ
chẩn đoán giang mai, thƣơng hàn, bạch lị gà, sẩy thai truyền nhiễm gia súc…
a. Chuẩn bị dịch kháng nguyên












Sơ đồ 3.5 Qui trình chuẩn bị dịch kháng nguyên thực hiện phản ứng ngƣng kết

chậm trong ống nghiệm
b. Cách thực hiện
Dùng một loạt ống nghiệm, cho vào mỗi ống 0,3 ml dịch KHT (nguyên, kết tủa và
thẩm tích có hoặc không có hấp phụ E68) pha loãng trong PBS 1X theo cơ số 2. Sau
đó cho vào mỗi ống 0,3 ml dịch kháng nguyên  ủ 37
o
C trong 2 giờ và để 4
o
C qua
đêm.
Ngoài ra cần phải có ống đối chứng chứa 0,3 ml dịch kháng nguyên và 0,3 ml
PBS 1X.
Cấy E. coli chủng gốc O139:K82 vào môi trƣờng canh TSB
ủ 37
o
C qua đêm
Cho formalin vào (V
formalin
= 0,3% V
dịch VK
)
Để 4
o
C qua đêm
Li tâm bỏ dịch nổi
(4000 vòng / phút trong 30 phút)

Hòa tan phần rắn trong PBS 1X
(V
PBS

= V
dịch VK
)
Dịch kháng nguyên


32

Hình 3.4 Phản ứng ngƣng kết chậm trong ống nghiệm

c. Đọc kết quả
Phản ứng ngƣng kết trong ống nghiệm đƣợc đọc là:
(+) khi các hạt ngƣng kết tạo thành mạng lƣới lắng đều khắp đáy ống nghiệm.
(-) khi vi khuẩn lắng tập trung giữa đáy ống nghiệm.
Kháng thể đƣợc định hiệu giá ở nồng độ kháng huyết thanh pha loãng cao nhất có
xảy ra phản ứng ngƣng kết và ống đối chứng thì không ngƣng kết.
3.5. CHỈ TIÊU THEO DÕI
 Thời điểm xuất hiện kháng thể.
 Hiệu giá kháng thể.
3.6. XỬ LÍ KẾT QUẢ
So sánh hiệu giá kháng thể thu đƣợc từ 2 qui trình trên.