Luận văn : Bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nấm Rhizoctonia solani Kuhn part 4 pptx

31
ctcggcgtga taagttatct atcgctgaga cactgtaaaa aggtggccat tgtatatgca
ag
Với primer ITS4, vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 đã đọc được là
566bp. Trình tự như sau:
gtttttcacg ggggagatcc tacctgattt gagatcagat cataaaaatg tattttgtc
caagtcaagt cgactattag aagcggttcg tcttgcattt accttggcca cctttttac
agtgtcctca gcgatagata acttatcacg ccgagtggaa ccaagcataa cacttagag
atccagctaa taaacaaaga ggcgcagggt gtgaaactgc aaagacctcc aaaaccaaa
gtaagagacc gattgaatta acaaaaggtt tactttgaag atttcatgat actcaaaca
ggcatgctcc aaggaatacc aaggagcgca aggtgcgttc aaagattcga tgattcact
Gaattctgca attcacatta cttatcgcat ttcgctgcgt tcttcatcga tgcgagagt
caagagatcc gttgttgaaa cttagtatta gatgcgttac atcaattaca ttcgtttta
aatttaatag agtttgtatg ttaattgagt agacagcaaa agccaagaaa ggaggattt
atttttttta atgaaactcc cccttg

Sau đó chúng tôi so trình tự của 2 chuỗi DNA đã đọc được thì thu được
trình tự của vùng rDNA-ITS là 468bp. Trình tự như sau:

caagtgtgga gcttcattgc aaaacttttc cctccttctc ttggcttttg ctgtctactc
aattaacata caaactctat taaatttaaa acgaatgtaa ttgatgtaac gcatctaata
ctaagtttca acaacggatc tcttggctct cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga
taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca ccttgcgctc
cttggtattc cttggagcat gcctgtttga gtatcatgaa atcttcaaag taaacctttt
gttaattcaa tcggtctctt actttggttt tggaggtctt tgcagtttca caccctgctc
ctctttgttt attagctgga tctctaagtg ttatgcttgg ttccactcgg cgtgataagt
tatctatcgc tgaggacact gtaaaaaggt ggccaaggta aatgcaag

Trên website ( chúng tôi so sánh trình tự vùng
rDNA-ITS của dòng SR-650 với trình tự vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R.
solani có mã số sau:
AB122134 AG-IA 670 bp
AB122126 AG1-ID 694 bp
AB122124 AG2-1 669 bp
AB122143 AG -4 672 bp
AB122142 AG1-IC 651 bp
Qua nhiều kết quả chúng tôi nhận thấy vùng rDNA-ITS của dòng nấm
mang số hiệu AB122126 thuộc nhóm tiếp hợp AG1-ID là phù hợp nhất với trình tự



32
vùng rDNA-ITS đọc được của dòng SR-650. Tỉ lệ tương đồng trình tự đoạn rDNA-
ITS đã đọc được 468bp của dòng SR650 và AB122126 là 100%.
Trình tự đoạn rDNA-ITS của dòng nấm mang mã số AB1221126 là:

1 aaggatcatt attgaattta ttaatgagga gtagagttgt agctggccat ttttctggca
61 atgtgcacac tcttctcttt catccacaca cccctgtgca cctgtgagac agttacaagg
121 tcattttgga gtttggg{caa gtgtggagct tcattgcaaa acttttccct ccttctcttg
181 gcttttgctg tctactcaat taacatacaa actctattaa atttaaaacg aatgtaattg
241 atgtaacgca tctaatacta agtttcaaca acggatctct tggctctcgc atcgatgaag
301 aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt
361 gaacgcacct tgcgctcctt ggtattcctt ggagcatgcc tgtttgagta tcatgaaatc
421 ttcaaagtaa accttttgtt aattcaatcg gtctcttact ttggttttgg aggtctttgc
481 agtttcacac cctgctcctc tttgtttatt agctggatct ctaagtgtta tgcttggttc
541 cactcggcgt gataagttat ctatcgctga ggacactgta aaaaggtggc caaggtaaat
601 gcaag}acgaa ccgcttctaa tagtccattg acttggacaa aatacatttt tatgatctga
661 tctcaaatca ggtaggacta cccgctgaac ttaa

Trong dấu {}là đoạn DNA tương đồng kết quả đọc được của dòng SR-650 với dòng
nấm mang mã số AB122126. Đoạn tương đồng này từ vị trí nucleotide 137 đến vị trí
605 dối với dòng nấm có mã số AB122126. Đoạn này có 468 nucleotide.

CLUSTAL X (1.83) multiple sequence alignment


SR650
AB122126 AAGGATCATTATTGAATTTATTAATGAGGAGTAGAGTTGTAGCTGGCCATTTTTCTGGCA


SR650
AB122126 ATGTGCACACTCTTCTCTTTCATCCACACACCCCTGTGCACCTGTGAGACAGTTACAAGG


SR650 CAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTG
AB122126 TCATTTTGGAGTTTGGGCAAGTGTGGAGCTTCATTGCAAAACTTTTCCCTCCTTCTCTTG
*******************************************

SR650 GCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTG
AB122126 GCTTTTGCTGTCTACTCAATTAACATACAAACTCTATTAAATTTAAAACGAATGTAATTG



33
************************************************************

SR650 ATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG
AB122126 ATGTAACGCATCTAATACTAAGTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGATGAAG
************************************************************

SR650 AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT
AB122126 AACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTT
************************************************************

SR650 GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATC
AB122126 GAACGCACCTTGCGCTCCTTGGTATTCCTTGGAGCATGCCTGTTTGAGTATCATGAAATC
************************************************************

SR650 TTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTGC
AB122126 TTCAAAGTAAACCTTTTGTTAATTCAATCGGTCTCTTACTTTGGTTTTGGAGGTCTTTGC
************************************************************

SR650 AGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTTC
AB122126 AGTTTCACACCCTGCTCCTCTTTGTTTATTAGCTGGATCTCTAAGTGTTATGCTTGGTTC
************************************************************

SR650 CACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAAT
AB122126 CACTCGGCGTGATAAGTTATCTATCGCTGAGGACACTGTAAAAAGGTGGCCAAGGTAAAT
************************************************************

SR650 GCAAG
AB122126 GCAAGACGAACCGCTTCTAATAGTCCATTGACTTGGACAAAATACATTTTTATGATCTGA
*****

SR650
AB122126 TCTCAAATCAGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAA

Dấu * biểu thị trình tự của dòng SR-650 với trình tự của AB122126 khớp với nhau.

Như vậy, kết quả đọc trình tự trực tiếp sản phẩm PCR được làm tinh sạch bằng
kit “GFX PCR DNA and Gel Band Purication” của công ty Amersham đã cho kết quả
tốt hơn so với sử dụng kit Quantum Prep Freeze “N Squeeze DNA gel Extraction Spin
Column” của BioRad. Tuy nhiên, với cùng 1 kit làm tinh sạch (của Amersham) và qui
trình đọc trình tự, vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 chi đọc được 1 đoạn ngắn. điều
này cho thấy qui trình đọc trình tự với máy đọc trình tự DNA ABI 3100 của hãng
Applied Biosystem có thể là chưa hoàn thiện nên kết quả không ổn định.



34
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1.Kết luận
 Cải thiện được qui trình li trích DNA của nấm R. solani bằng cách thêm một
khâu khử protein. DNA tổng số thu được có thể sử dụng cho phản ứng PCR
mà không cần xử lí RNase.
 Chọn được thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng
rDNA-ITS của nấm R. solani.
 Bước đầu đã đọc được trình tự vùng rDNA-ITS của nấm R. solani .
5.2.Đề nghị
 Hoàn thiện qui trình đọc trình tự để có kết quả đọc trình tự tốt hơn.
 Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nhiều dòng nấm để có thể đánh giá sự đa
dạng di truyền của quần thể nấm này.

35
PHẦN VI
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Tiếng Việt

1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử - Những nguyên tắc
cơ bản trong chọn giống cây trồng. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, thành phố Hồ
Chí Minh.
2. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của
một số mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây kí chủ khác
nhau. Luận văn tốt nghiệp kĩ sư Nông Học đại học Nông Lâm, thành phố Hồ
Chí Minh.
3. Nguyễn Đình Huyên, 1999. Những điều cơ bản của kĩ thuật di truyền. Nhà xuất
bản Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh.
4. Nguyễn Việt Long, 2001. Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa của hai
chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani trên ruộng lúa ở Đồng

Tháp. Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí
Minh.
5. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kĩ thuật gen. Nhà xuất bản
Khoa Học và Kĩ Thuật, Hà Nội.
6. Nguyễn Văn Uyển, 1995. Những phương pháp công nghệ sinh học thực vật.
Nhà xuất bản Nông Nghiệp, thành phố Hồ Chí Minh.

Tiếng Anh

7. Banniza. S., Sy. A. A., Bridbe. P. D., Simons .S. A. and Holderness. M., 1999.
Characterization of populations of Rhizoctonia solani in Paddy Rice Fields in
Cote d’Ivoire. Phytopathology 89: 414 – 420.




36
8. Boysen. M., Borjia. M., Moral. C., Salazar. O., and Rubio. V., 1996.
Identification at strain level of Rhizoctonia solani AG4 isolates by direct
sequence or asymmetric PCR products of the ITS region. Curr. Genet. 29: 174 –
1811.
9. Butler, E. E., and Bracker, C. E, 1970. Morphology and cytology of
Rhizoctonia solani. Pages 32 – 51 in J. R. Pameter, Jr.,ed. Rhizotonia solani,
Biology and Pathology. University of California Press, Berkeley. 255pp.
10. Carling. D. E. and Sumner. D. R., 1992. Rhizoctonia. Pages 157 – 165 in:
Method for reseach on soilborne phytopathogenic fungi. L. L. Songton, J. D.
Mihail and Rush (eds). APS, St. Paul, Minnesota.
11. Hsiang. T., and Dean .J. D., 2001. DNA sequencing for anastomosis grouping
of Rhizotonia solani isolates from Poa annua. International turgrass society
research journal 9: 674 – 678.

12. Kuninaga. S., Natsuaki. T., Takeuchi. T., and Yokosawa. R., 1997. Sequence
variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in
Rhizotonia solani. Curr. Genet. 32: 237 – 243.
13. Lee. S. B., and Taylor. J. W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and
single spore. In: Weising. K., Nybom. H., Wolff. K., and Meyer. W., 1995,
DNA fingerfrinting in plants and fungi. CRC Rress, Coca Raton, Ann Arbor,
London, Tokyo, pages 70-71.
14. Liu. Z. L., and Sinclair, J. B, 1992. Genetic diversity of Rhizotonia solani
anastomosis group 2. Phytopathology. 82: 778 – 787.
15. Matsumoto. M., Furuya. N., Takanami. Y. and Matsuyama. N., (1996). RFLP
analysis of PCR – amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani. Mycoscience 37:
351 – 326.
16. O’brain P. A., 1998. Molecular markers in Australian isolates of Rhizoctonia
solani. Mycol. Res. 98: 665 – 671.
17. Papavizas, G. C., 1957. Colonization and Growth of Rhizoctonia solani in Soil.
Crops Research Divesion. Pages 108 – 122.




37
18. Schneider. J. H. M, Ssalazar. O., Rubio. V. and Keijer. J., 1997. Identification
of Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS r DNA
polymorphism and pectic Zymograms. European Journal of Plant Pathology.
103: 607 – 622.
19. Sneh. B., Burpee. L., Ogoshi. A . Identification of Rhizoctonia solani Species.
The American Phytopathological society. Pages 67 – 75.
20. Vilgalys, S. and Gonzales, D., 1989. Ribosomal DNA restriction Fragment
length polymorphisms in Rhizoctonia solani. Phyopathology 80; 151 – 158.
21. Weising. K., Nybom. H., Wolff. K., and Meyer. W,. DNA Fingerprinting in

Plants and Fungi. Methology. Pages 192 – 200.
22. White, T. J., Burns. T., Lee. S., and Taylor. L., 1991. Amplification and direct
sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetic. Pages 315 – 322
in . M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky and T. J. White (ed.) PCR
Protocol. A guide to method and appliffiaction. Academic Press, New York.

3. Internet

23.
24.
25.
26.

27.

38
PHẦN VII
PHỤ LỤC

Phụ lục.1. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng SR-650 với ITS4






39

Phụ lục.2. Đọc trình tựvùng rDNA-ITScủa dòng SR-650 với ITS1

40

Phụ lục.3. Đọc trình tự vùng rDNA-ITS của dòng BV-62-03 với ITS1