KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP: BƯỚC ĐẦU ĐỌC TRÌNH TỰ VÙNG rDNA-ITS CỦA NẤM Rhizoctonia solani KUHN (Phần đầu)

Lời Cảm Tạ
Thành kính ghi nhớ công ơn cha mẹ suốt đời dạy dỗ, tận tuỵ vì con cho con có được
ngày hôm nay.
Chân thành cám ơn:
Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm khoa Công Nghệ Sinh Học trường đại học Nông Lâm thành phố
Hồ Chí Minh.
Các thầy cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học đã truyền đạt cho tôi kiến thức quí
giá trong suốt quá trình học tập và hoàn thành khoá luận tốt nghiệp này.
Trân trọng biết ơn cô Từ Thị Mỹ Thuận đã hết lòng tận tuỵ và động viên tôi
trong suốt thời gian tôi thực hiện khoá luận này.
Chân thành cảm ơn thầy Bùi Minh Trí , và các anh chi thuộc trung tâm phân tích
đã tân tình giúp tôi trong quá trình hoàn thành khoá luận này.
Cảm ơn tấc cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
khoá luận này.
Thủ Đức, ngày 08 tháng 08 năm 2005
Người thực hiện
Lê Tuấn Kiệt
iii
TÓM TẮT
LÊ TUẤN KIỆT, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh , tháng 9/2005.
“BƯỚC ĐẦU ĐỌC TRÌNH TỰ VÙNG rDNA-ITS CỦA NẤM Rhizoctonia solani
KUHN”.
Giáo viên hướng dẫn
Th.S. TỪ THỊ MỸ THUẬN
Đề tài được thực hiện trên nấm Rhizoctonia solani. Đây là nấm có thể gây bệnh
trên nhiều loại cây trồng khác nhau., ảnh hưởng rất lớn đến năng suất của cây trồng.
Chúng tôi bước đầu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của nấm này để bổ sung them thong
tin về quần thể nấm này ở nước ta làm cơ sở cho việc phát triển các chương trình lai tạo
thích hợp cho các vùng sinh thái riêng biệt. Đề tài được thực hiện tại phòng Bệnh cây
khoa Nộng Học và Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm trường Đại học Nông Lâm, Tp.

Hồ Chí Minh, từ 01/03/2005 đến 30/08/2005.
Nội dung nghiên cứu
• Thu thập các mẫu thực vật bệnh ở nhiều tỉnh và phân lập nấm R. solani.
• Nuôi cấy sinh khối các dòng nấm đã phân lập được.
• Li trích DNA các dòng nấm trên.
• Tiến hành phản ứng PCR với DNA vừa li trích trên vùng ITS của rDNA
sử dụng hai mồi (primer) ITS4 và ITS5.
• Đọc trình tự vùng rDNA – ITS với hai primer ITS1 và ITS4.
Kết quả thu đư ợc
• Thu thập và phân lập được 20 dòng nấm Rhizoctonia solani từ nhiều mẫu
thực vật bệnh do nấm này gây ra.
• Cải thiện được qui trình li trích DNA của nấm R. solani bằng cách thêm
một khâu khử protein. DNA tổng số thu được có thể sử dụng cho phản
ứng PCR mà không cần xử lí Rnase cho 20 dòng nấm này.
• Chọn được thành phần phản ứng PCR để khuếch đại thành công vùng
rDNA-ITS của nấm R. solani.
• Bước đầu đã đọc được trình tự vùng rDNA-ITS của 2 dòng nấm R.
Solani là BV-62-03 và SR-650.
iv
Mục lục
Lời cảm tạ...................................................................................................................iii
Tóm tắt........................................................................................................................iv
Mục lục.........................................................................................................................v
Mục viết tắt...............................................................................................................viii
Danh sách các bảng.....................................................................................................ix
Phần I Mở đầu
1.1. Đặt vấn đề......................................................................................................1
1.2. Mục đích.......................................................................................................1
1.3. Yêu cầu..........................................................................................................2
1.4. Giới hạn đề tài................................................................................................2

Phần II Tổng quan tài liệu
2.1. Nấm Rhizoctonia solani.................................................................................3
2.1.1. Vị trí phân loại....................................................................................3
2.1.2. Đăc điểm hình thái của nấm Rhizoctonia solani................................3
2.1.3. Đặc điểm sinh lí..................................................................................3
2.1.4. Phổ kí chủ của nấm Rhizoctonia solani..............................................4
2.1.5. Sự xâm nhiễm và khả năng gây bệnh................................................5
2.2. Phản ứng PCR (polymerase chain reaction)..................................................5
2.2.1. Giới thiệu kĩ thuật PCR......................................................................5
2.2.2. Qui trình..............................................................................................5
2.2.2.1. Biến tính..........................................................................................5
2.2.2.2. Giai đoạn lai....................................................................................6
2.2.2.3 giai đoạn kéo dài..............................................................................6
2.2.3. Các thành phần ảnh hưởng đến phản ứng PCR..................................6
v
Trang
2.2.3.1. DNA khuôn (template)............................................................6
2.2.3.2. Enzyme....................................................................................7
2.2.3.3. Primer......................................................................................7
2.2.3.4. Ion magnesium........................................................................8
2.2.4. Ứng dụng của kĩ thuật PCR................................................................8
2.3. Đọc trình tự (sequencing)..............................................................................9
2.3.1. Nguyên tắc cơ bản của kĩ thuật sequecing.........................................9
2.3.2. Các phương pháp sequencing.............................................................9
2.3.2.1. Phương pháp Maxam và Gilbert (phương pháp hóa học).......9
2.3.2.2. Phương pháp đọc chuỗi mã Sanger.......................................11
2.4. Vùng ITS (internal transcribed spacer) của rDNA ......................................13
2.5. Các nghiên cứu trong và ngoài nước...........................................................14
2.5.1. Nghiên cứu trong nước.....................................................................14
2.5.2. Nghiên cứu ngoài nước....................................................................14

Phần III Nội dung và phương pháp nghiên cứu
3.1.Thời gian và địa điểm nghiên cứu..........................................................16
3.2.Phương pháp............................................................................................16
3.2.1. Lấy mẫu và phân lập...........................................................................16
3.2.2. môi trường phân lập nà nuôi cấy.........................................................16
3.2.3. Nuôi thu sinh khối...............................................................................17
3.2.4. Li trích DNA.......................................................................................17
3.2.5. Phản ứng PCR.....................................................................................18
3.2.6. Sequencing..........................................................................................19
Phần IV Kết quả vào thảo luận
4.1. Phân lập mẫu...............................................................................................21
4.2. Li trích DNA................................................................................................22
4.3. Phản ứng PCR.............................................................................................24
4.4. Đọc trìmh tự................................................................................................26
vi
Phần V Kết luận và đề nghị
1. Kết luận........................................................................................................34
2. Đề nghị.........................................................................................................34
Phần VI Tài liệu tham khảo
1. Tiếng Việt....................................................................................................35
2. Tiếng Anh....................................................................................................35
3. Internet.........................................................................................................37
Phần VII Phụ lục
Phụ lục 1..........................................................................................................38
Phụ lục 2..........................................................................................................39
Phụ lục 3..........................................................................................................40
Phụ lục 4..........................................................................................................41
vii