Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ part 7 doc

55
22. Donnenberg M. S., Tzipori S., McKee M. L., O Brien A. D., Alroy J., and
Kaper J. B., 1993. The role of the eae gene of enterohemorrhagic Escherichia
coli in intimate attachment in vitro and in a porcine model. J Clin. Invest.
92:1418-1424.

23. FAO, 1992. Microbiological analysis in the food control laboratory.

24. FDA, 2002. “Diarrheagenic Escherichia coli”, Bacteriological Analytical
manual Online, CFSAN. September 2002.
<URL:

25. Gaastra W., and Svennerholm A. M., 1996. Colonization factors of human
enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Trends Microbiol. 4:444-452.

26. Gyles C. L., 1992. Escherichia coli cytotoxins and enterotoxins. Can. J.
Microbiol. 38:734-746.

27. Handl C. E., Olsson E., and Flock J. I., 1992. Evaluation of three different
STb assays and comparision of enterotoxin pattern over a five-year period in
Swedish porcine Escherichia coli. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 15:505-510.

28. Harel J., Lapointe H., Fallara A., Lorrtie A., Bigras-Poulin M., Lariviere S.,
and Faibrother J. M., 1991. Detection of genes for fimbrial antigens and
enterotoxins associated with Escherichia coli serogroups isolated from pig
with diarrhea. J. Clin. Microbiol. 29:745-752.

29. Hitotsubashi S., Fujii Y., Yamanaka H., and Okamoto K., 1992. Some
properties of purified Escherichia coli heat-stable enterotoxin II. Infect.
Immum. 60:4468-4474.

30. Karmali M. A.,1989. Infection by verocytotoxin – producing Escherichia
coli. J. Clin. Microbiol. Rev. 2:15-38.

31. Kenny B., DeVinney R., Stein M., Reinscheid D. J., Frey E. A., and Finlay B.
B., 1997. Enteropathogenic E. coli (EPEC) transfers its receptor for intimate
adherence into mammalian cells. Cell 91:511-520.

32. Keskimaki M., 2001, Shiga toxin-producing and other diarrhoeagenic
Escherichia coli in Finland: pheno-and genotypic epidemiology. Academic
dissertation. The Faculty of Ariculture and Forestry of the University of
Helsinky, Finland.

33. Koneman E. W., Allen S. D., Dowell V. R., and Sommers H. M., 1983. Color
Atlas and extbook of Diagnostic Microbiology. 2d ed., J.B. Lippincott Co.,
Philadelphia, PA, pp. 57-124.


56
34. Leung P. H. M., Peiris J. S. M., Ng W. W. S., Robin-Browne R. M.,
Bettelheim K. A., and Yam W., C., 2003. A newly discovered verotoxin
variant, VT2g, produced by bovine verocytotoxigenic Escherichia coli. Appl.
Environ. Microbiol. 69: 7549-7553.

35. Levine M. M., Xu J., Kapper J. B., Lior H., Prado V., Tall B., Nataro J. P.,
Karch H., and Wachsmuth K., 1987. A DNA probe to identify
enterohemorrhagic Escherichia coli of O157:H7 and other serotypes that
cause hemorrhagic colitis and hemolytic uremic syndrome. J. Infect. Dis.
156:175-182.

36. Makino S., Kobori H., Asakura H., Watarai M., Shirahata T., Ikeda T., et al,
2000. Detection and characterization of Shiga toxin-producing Escheichia
coli from seagulls. Epidemiol. Infect. 125:55-61.

37. Moon H. W., Schneider R. A., and Moseley S. L., 1986. Comparative
prevalence of four enterotoxin genes among Escherichia coli isolated from
swine. Am. J. Vet. Res. 47:210-212.

38. Nataro J. P. and Kaper J. B., 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin.
Microbiol. Rev. 11(1):142-201.

39. Neter E., Westphal O., Luderitz O., Gimo R. M., and Gorzynski E. A., 1995.
Demonstration of antibodies against enteropathogenic Escherichia coli in
sera of children of various ages. Pediatrics. 16:801-808.

40. Paton A. W. and Paton J. C., 1998
a
. Detection and characterization of Shiga
toxigenic Escherichia coli by using multiplex - PCR assay for stx1, stx2,
eaeA, enterohemorrhagic E. coli hlyA, rfb
0111
, and rfb
o157
. J. Clinical
Microbiol. 36(2):598-602.

41. Paton J. C. and Paton A. W., 1998
b
. Phathogenesis and diagnosis of Shiga
toxin-producing Escherichia coli infection. Clin. Microbiol. Rev. 11:450-479.

42. Pierard D., Muyldermans G., Moriau L., Stevens D., and Lauwers S., 1998.
Identification of new verocytotoxin type 2 variant B-subunit genes in human
and animal Echerichia coli isolates. J. Clin. Microbiol. 36:3317-3322.

43. Protocol online
<URL:
Multiplex- PCR/

44. Radu S., Mutalib S. A., Rusul G., Ahmad Z., Morigaki T., Asai N., Kim Y.
B., Okuda J., and Nishibuchi M., 1998. Detection of Escherichia coli
O157:H7 in beef marketed in Malaysia. Appl. Environ. Microbiol. 64:1153-
1156.


57
45. Schmidt H., Beutin L., and Karch H., 1995. Molecular Analysis of the
Plasmid-encoed Hemolysin of Escherichia coli O157:H7 strain EDL 933.
Infec. Immunity. 63:1055-1061.

46. Smith H. R., and Scotland S. M., 1998. Vero cytotoxin-producing strains of
Escherichia coli. J. Med. Microbiol. 26:77-85.

47. Timisjarvi A. T., Alatossava T., 2004. Rapid DNA preparation from milk and
dairy process samples for the detection of bacteria by PCR. Food Microbiol.
21:365-368.

48. Thomas A., Cheasty T., Chart H., and Rowe B., 1994. Isolation of vero
cytotoxin-producing Escherichia coli serotypes O9ab:H- and O101:H-
carrying VT2 variant gene sequences from a patient with haemolytic uraemic

syndrome. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 13:1074-1076.

49. Toma C., Lu Y., Higa N., Nakasone N., Chinen I., Baschkier A., Rivas M.,
and Iwanaga M., 2003. Multipex – PCR Assays for identification of human
diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 41:2669-2671.

50. Wang G., Clark C. G., and Rodgerst F. G., 2002. Detection in Escherichia
coli of the genes defining the O157:H7 serotype, and components of the type
2 shiga toxin family by multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 40:3613-3619.

51. Wieler L. H., Vieler E., Erpenstein C., Schlapp T., Steinruck H., Bauerfeind
R., Byomi A., and Baljer G., 1996. Shiga toxin-producing Escherichia coli
strains from bovines: Association of adhesion with carriage of eae and other
genes. J. Clin. Microbiol. 34:2980-2984.

58
PHỤ LỤC 1
MÔI TRƯỜNG VÀ THUỐC THỬ
Môi trường
CT-SMAC
SMAC
Peptone 20 g
Sodium chloride 5 g
Bile salts 1,5 g
Sorbitol 10 g
Crystal violet 0,001 g
Neutral red 0,03 g
Agar 15 g
Nước cất vừa đủ 1.000 ml
CT – SUPPLEMENT
Cefixime 0,05 mg/l
Potassium tellurite 2,5 mg/l

MAC
Bacto peptone 17 g
Bacto Proteose peptone 3 g
Bacto Lactose 10 g
Bacto Bile salts 1,5 g
Sodium Chloride 5 g
Bacto Agar 13,5 g

Neutral Red 0,03 g
Bacto Crystal Violet 0,001g
Nước cất vừa đủ 1000 ml

NA
Peptone 5 g

59
Sodium chloride 5 g
Beef Extract 1,5 g
Yeast Extract 1,5 g
Agar 15 g
Nước cất vừa đủ 15 g
pH = 7,4 ± 0,2 (25
0
C)

Nước peptone đệm
Peptone 10 g
Sodium chloride 5 g
Disodium hydrogen phosphate 9 g
Potassium dihydrogen phosphate 1,5 g
Nước cất vừa đủ 1000 ml
pH = 7

SIMMON CITRAE
Sodium citrate 2 g
NaCl 5 g
K
2

HPO
4
1 g
NH
4
H
2
PO
4
1 g
MgSO
4
0,2 g
Bromothymol blue 0,08 g
Agar 15 g
Nước cất vừa đủ 1000 ml

MR – VP
Peptone 7 g
Glucose 5 g
K
2
HPO
4
5 g
Nước cất vừa đủ 800 ml
pH = 6,9 ± 0,2


60

Thuốc thử
VP (Voges Proskauer)
Dung dịch A:
Alpha naphthol 5 g
Ethanol tuyệt đối 100 ml
Dung dịch B:
Potassium hydroxyde 40 g
Nước cất 100 ml
MR (Methyl red)
Methyl red 0,1 g
Alcohol 300 ml
Nước cất vừa đủ 500 ml

HÓA CHẤT ĐIỆN DI
TBE (0,5 X)
Tris HCl 3,94 mg
Acid Boric 1,39 g
Na
2
EDTA 93,06 mg
Nước cất vừa đủ 500ml
pH = 8,3
Agarose (1,4%)
Loading dye
Bromophenol blue 0,25%
Sucrose 40%
TE 1X vừa đủ 100%

HÓA CHẤT NHUỘM GEL
TBE 1X

Ẹthidium bromide 10 mg/ml




61
PHỤ LỤC 2

CÁC VẤN ĐỀ THƯỜNG GẶP TRONG MULTIPLEX – PCR VÀ
HƯỚNG GIẢI QUYẾT

Vấn đềà Hướng giải quyết
Sản phẩm
không chuyên
biệt

* Nếu dài
- Tăng nồng độ KCl (buffer) đến 1,2 – 2 X nhưng giữ nguyên
nồng độ MgCl
2
ở 1,5 – 2 mM.
* Nếu ngắn
- Giảm nồng độ buffer còn 0,7 – 0,9 X nhưng giữ nồng độ
MgCl
2
ở 1,5 – 2 mM.
- Tăng dần nhiệt độ ủ bắt cặp.
- Giảm lượng DNA xét nghiệm.
- Giảm lượng primer.
- Giảm lượng Taq – polymerase.

- Tăng nồng độ MgCl
2
đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng
độ dNTP.
- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng
độ cuối cùng). Có thể dùng 5% glycerol (v/v nồng độ cuối).
* Nếu không có sản phẩm
- Chạy PCR cho mỗi cặp primer được sử dụng trong multiplex
với nhiệt độ ủ bắt cặp thấp hơn bình thường.
- So sánh các sản phẩm không chuyên biệt cho mỗi cặp primer
kiểm tra với sản phẩm không chuyên biệt nhìn thấy khi chạy
multiplex – PCR. Điều này có thể chỉ ra mỗi cặp primer mang lại
những sản phẩm không chuyên biệt trong phản ứng multiplex.
- Kết hợp một vài hoặc tất cả những phương pháp trên.
Sản phẩm yếu
(mờ)
- Giảm thời gian ủ bắt cặp.
- Giảm nhiệt độ kéo dài xuống 62 – 68
0
C.
- Tăng thời gian kéo dài.
- Tăng nồng độ DNA xét nghiệm.
- Tăng tất cả lượng primer sử dụng.
- Điều chỉnh nồng độ Taq – polymerase.
- Thay đổi nồng độ buffer nhưng giữ nồng độ MgCl2 ở 1,5 – 2
mM.
- Tăng nồng độ MgCl
2
đến 3 – 4,5 mM nhưng giữ nguyên nồng
độ dNTP.

- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l: nồng
độ cuối cùng). Có thể dùng 5% glycerol (v/v nồng độ cuối).

62
Sản phẩm dài
và yếu (mờ)
- Giảm nồng độ buffer còn 0,7 – 0,8 X nhưng giữ nồng độ
MgCl2 ở 1,5 – 2 mM.
- Tăng nồng độ MgCl2 lên 3 – 4,4 mM nhưng giữ ngun nồng
độ dNTPs.
- Tăng thời gian biến tính.
- Tăng thời gian ủ bắt cặp.
- Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp.
- Tăng thời gian và nhiệt độ kéo dài.
- Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR có băng mờ đồng
thời giảm lượng primer cho băng đậm.
- Thêm chất phụ gia, tốt nhất là dùng BSA (0,1 – 0,8 g/l). Nên
thử 5% glycerol (v/v nồng độ cuối cùng).
- Kết hợp một vài hoặc tất cả các phương pháp trên.
Sản phẩm
ngắn và yếu
(mờ)
-

T
ă
ng n
ồ
n
g

độ buffer đến 1,2 – 2 X nhưng giữ nồng độ MgCl
2
ở
1,5 – 2 mM.
- Giảm thời gian biến tính.
- Giảm thời gian ủ bắt cặp.
- Giảm nhiệt độ ủ bắt cặp.
- Giảm thời gian và nhiệt độ kéo dài.
- Tăng lượng primer đối với sản phẩm PCR có băng mờ và giảm
lượng primer có băng đậm.
- Thêm chất phụ gia BSA (0,1 – 0,8 g/l), có thể thử 5%
glycerol (v/v nồng độ cuối cùng).
- Kết hợp một vài hoặc tất cả các phương pháp trên.