Ứng dụng kỹ thuật multiplex – pcr để phát hiện các gen độc lực của vi khuẩn escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò

1

Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Escherichia coli (E. coli) là vi khuẩn sống cộng sinh chiếm ưu thế trong hệ vi
sinh vật đường ruột của người và động vật. Tuy nhiên, khi có điều kiện thích hợp, một
số nhóm E. coli gây độc tăng sinh mạnh, trở thành nguyên nhân gây tiêu chảy nghiêm
trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non. E. coli được xem là vi khuẩn chỉ
danh ô nhiễm thực phẩm và nước dựa vào số lượng của chúng. E. coli thải qua phân ra
mơi trường bên ngồi. Nếu q trình vệ sinh kém thì E. coli dễ vấy nhiễm vào thịt
tươi, nhất là trong q trình giết mổ. Từ đó nếu việc bảo quản và chế biến thực phẩm
khơng thích hợp thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hồn tồn có thể xảy ra.
E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC...Trong
đó, nhóm STEC (Shiga Toxin Producing E. coli) mang nhiều gen độc lực như gen eae
chịu trách nhiệm sản sinh intimin giúp vi khuẩn bám dính vào niêm mạc ruột; gen hly
sản sinh độc tố gây dung giải hồng cầu; gen stx1, stx2 sản sinh các độc tố shiga gây hội
chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu
(HUS = hemolytic uraemic syndrome) ở người, gen stx2e sản sinh độc tố vero gây
bệnh phùng thủng và tiêu chảy ở heo cai sữa. Trong khi đó, nhóm ETEC
(Enterotoxigenic E. coli ) mang gen lt sản sinh độc tố ruột kém chịu nhiệt (heat labile
toxin = LT) và gen st sản sinh độc tố ruột chịu nhiệt (heat stable toxin = ST) gây tiêu
chảy trên người và vật ni. Nhóm EPEC (Enteropathogenic E. coli) mang gen eae
sản sinh protein intimin, …
Trước đây, để phát hiện E. coli, người ta sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền
thống. Phương pháp này gặp khó khăn là tốn thời gian, dịch bệnh đã lây lan rồi thì mới
có kết quả. Hơn nữa, E. coli là vi khuẩn bình thường ở đường ruột và cũng thường có
mặt trong thực phẩm nên việc phân lập được vi khuẩn E. coli trong phân để tìm
nguyên nhân gây bệnh hay xác định số lượng vi khuẩn trong thực phẩm hồn tồn
khơng phản ánh được khả năng gây độc của chúng. Do vậy, việc phát hiện các gen gây
độc của E. coli bằng kỹ thuật PCR là bước cần thiết góp phần đánh giá nguy cơ gây

bệnh trên vật nuôi và con người. PCR là phương pháp nhanh, đặc hiệu, cho kết quả


2
trong thời gian ngắn, kịp thời phát hiện mầm bệnh để góp phần ngăn chặn tác hại của
dịch bệnh.
Do đó, được sự đồng ý của Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, trường đại học Nông
Lâm TP HCM, dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị
Thu Trang, chúng tôi đã thực hiện đề tài:
“Ứng dụng kỹ thuật multiplex – PCR để phát hiện các gen độc lực của vi
khuẩn Escherichia coli phân lập từ phân bò, phân heo tiêu chảy và thịt bò”
1.2. Mục tiêu
- Phát hiện một số gen độc lực của E. coli bằng kỹ thuật multiplex – PCR từ
mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bò.
1.3. Mục đích
- Góp phần chẩn đốn và kiểm sốt bệnh do E. coli gây ra cho động vật và
người.


3

Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Vi khuẩn E. coli
2.1.1. Định nghĩa
- Vi khuẩn Escherichia coli là tên được đặt theo tên của nhà bác sĩ nhi khoa
người Đức Theodor Escherich (1857-1911), ông là người đầu tiên phân lập và mô tả vi
khuẩn này vào năm 1885.
- Vi khuẩn E. coli thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia (Theo hệ
thống phân loại của Bergey).

- E. coli là trực khuẩn Gram âm, hiếu khí tùy nghi, di động, kích thước khoảng
1,5  m x 0,5  m, khơng hình thành bào tử và có giáp mơ (Trần Thanh Phong, 1996).
E. coli có mặt thường xuyên và chiếm ưu thế trong ruột của người và động vật máu
nóng, ở phần cuối của ruột non và ruột già. Nó vừa là vi khuẩn cộng sinh thường trực
ở đường tiêu hóa, vừa là vi khuẩn gây ra rất nhiều bệnh đường ruột và ở các cơ quan
khác.
2.1.2. Ni cấy và đặc điểm sinh hóa
- Nhiệt độ ni cấy thích hợp là 35 -37 oC, pH thích hợp 6,4 – 7,5 (tối ưu là 7,2
– 7,4).
- E. coli có thể được phục hồi dễ dàng từ những mẫu có nguồn gốc khác nhau
trên mơi trường chọn lọc ở 37oC trong điều kiện hiếu khí. E. coli thường được phân lập
bằng môi trường Mac Conkey (MAC) hoặc eosin methylene blue agar (EMB). Trên
môi trường thạch EMB, E. coli cho khuẩn lạc tím ánh kim; trên mơi trường thạch Mac
Conkey, E. coli cho khuẩn lạc đỏ hồng. Ngoài ra, ta có thể sử dụng mơi trường SMAC
(Sorbitol Mac Conkey) để phân biệt nhóm STEC khơng lên men đường sorbitol. Trên
mơi trường SMAC, nhóm STEC cho khuẩn lạc điển hình màu trắng, hơi nhầy, cịn các
nhóm E. coli lên men sorbitol cho khuẩn lạc màu hồng (FDA, 2002).
- E. coli mọc tốt trên môi trường thạch dinh dưỡng (NA: nutrient agar), sau 24
giờ hình thành những khuẩn lạc dạng S (smooth) màu xám trắng, trịn, ướt, bề mặt
bóng, kích thước khoảng 2 – 3mm.
- Trong môi trường lỏng, sau 4 – 5 giờ, E. coli làm đục nhẹ môi trường, càng để
lâu càng đục, có mùi hơi thối; sau vài ngày có thể có ván mỏng trên mặt mơi trường.


4
- Để phân biệt E. coli và các vi khuẩn đường ruột khác, người ta dùng phản ứng
IMViC (Indol, Methyl Red, Voges Proskauer, Citrate). E. coli cho kết quả là + + - (biotype 1) hoặc - + - - (biotype 2) (FAO, 1992).
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên
Phân loại huyết thanh học dựa vào kháng nguyên thân O (somatic), kháng
nguyên H (flagellar) và kháng nguyên bề mặt K (capsular). Có trên 700 loại serotype

của E. coli đã được công nhận dựa vào những kháng nguyên O, H, K. Theo Jay
(2000), E. coli có trên 200 type kháng nguyên đã được công nhận và tồn tại khoảng 30
type kháng nguyên H.
2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli
Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli:
- Sản xuất độc tố: Gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC
- Tấn cơng – xâm lấn: Gồm nhóm EIEC
- Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: Gồm các nhóm như EPEC, EHEC
Tuy nhiên, tác động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhầy ruột thì đặc hiệu
cho mỗi loại (Nataro và Kaper, 1998).
2.1.5. Phân loại E. coli
Dựa trên đặc điểm gây bệnh (đặc tính độc lực, sự tác động khác nhau lên màng
nhày của ruột, hội chứng lâm sàng của bệnh và sự khác nhau về mặt dịch tễ của bệnh),
E. coli được chia thành 5 nhóm sau:
 STEC (Shiga toxin – producing E. coli) hoặc VTEC (Vero toxingenic E.
coli) và EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli)
 EPEC (Enteropathogenic E. coli)
 EAEC (Enteroaggregative E. coli)
 ETEC (Enterotoxigenic E. coli)
 Những nhóm khác gây bệnh tiêu chảy:
- EIEC (Enteroinvasive E. coli)
- DAEC (Diffusely adherent E. coli)
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC
a. Danh pháp
Những hướng khác nhau trong nghiên cứu đã đưa ra những danh pháp khác
nhau để đặt tên cho nhóm E. coli này:


5
- Tên gọi Verotoxigenic E. coli hoặc Vero cytotoxin producing E. coli

(VTEC) được Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này khi phát hiện nhóm này sản
xuất độc tố gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997. Tên gọi VTEC được sử dụng
rộng rãi ở Anh và nhiều tổ chức khoa học ở Châu Âu.
- Tên gọi Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) được đặt là do dòng này gây
viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS:
haemolytic uraemic syndrome) (Nataro và Kaper, 1998).
- Tên Shiga toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like
toxin - producing E. coli - SLTEC) chỉ rõ khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống
như độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997). Tên gọi STEC được sử dụng nhiều trong
các tạp chí khoa học ở Mỹ.
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau và cả hai đều chỉ ra rằng
nhóm E. coli sản sinh ra một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Mặc dù vậy, khơng
phải có gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu khơng có các yếu tố độc lực khác.
Những dịng E. coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện trong ruột gia súc khỏe
mạnh với một số lượng rất ít, nhưng những dòng này thiếu một vài hay tất cả những
yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995). Do đó, khơng phải tất cả
STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và Kaper, 1998).
b. Shiga toxin và những yếu tố khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
* Shiga toxin
Những dòng STEC sản sinh độc tố Shiga toxin (Stx), hay còn được gọi là
Verotoxins (VT) hoặc Shiga – like toxins (Slt).
Họ độc tố Stx gồm hai nhóm chính khơng phản ứng chéo với nhau là Stx1 và
Stx2, được mã hóa bởi gen stx1 và stx2. Cả hai độc tố này được cấu tạo từ 5 tiểu đơn
vị B (được mã hóa bởi stxB) và 1 tiểu đơn vị A (được mã hóa bởi stxA). Cả hai gen
stxA và stxB được định vị trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc
thể (NST) của STEC. Một dòng STEC chỉ sản xuất độc tố Stx1, hoặc Stx2, hoặc cả
hai, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2. Ba dạng Stx2 được xác định: Stx2, Stx2c, và
Stx2e (Pierard và ctv, 1998). Subtype Stx2e gây bệnh phù thủng ở heo hơn là gây bệnh
ở người. Nhưng thỉnh thoảng những dịng này cũng có thể được phân lập từ bệnh nhân
HUS (Thomas và ctv, 1994). Nhiều khi người ta có thể thay thế giữa thuật ngữ Stx và

VT (ví dụ: Stx1 = VT1 = Slt1, Stx2e = VT2e = Slt2e v.v…) (Caldervood và ctv,


6
1997). Hầu hết những phương pháp chẩn đoán phân tử đều có mục tiêu phát hiện gen
mã hóa Stx của nhóm STEC (Cocolin và ctv, 2000).
* Những yếu tố độc lực khác ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
Những yếu tố độc lực khác của STEC là enterohaemolysin (Ehly) và có thể là
heat – stable enterotoxin (EAST1). Gen mã hóa Ehly nằm trên plasmid 60 – MDa mà
plasmid này được tìm thấy ở nhiều dịng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dịng STEC
khơng phải O157. Ở Đức, gần 90% dòng STEC được phân lập từ bệnh nhân có gen mã
hóa Ehly (Beutin và ctv, 1994). Tuy nhiên, việc sản sinh Ehly như là một yếu tố độc
lực thì khó đánh giá, vì trong các nghiên cứu của tác giả này, E. coli có Stx âm tính và
Ehly dương tính là nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela in vitro
(Beutin và ctv, 1989). EAST1 đầu tiên được mơ tả trong EAEC cũng được tìm thấy
trong nhiều dòng STEC. EAST1 trong mầm bệnh của STEC thì khơng được biết,
nhưng nó có thể liên quan đến một số bệnh tiêu chảy khơng có máu thường xun
được tìm thấy ở những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).
Yếu tố bám dính của STEC đóng vai trị quan trọng cho vi khuẩn định vị ở tế
bào ruột. Đó là intimin - một loại protein có trọng lượng phân tử 94 – 97 kDa. Protein
intimin được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching và effacing). Intimin gây tổn
thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and – effacing, A/E) ở ruột già do vi
khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv, 1993). Gen eae này cũng
được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae là một trong số các gen nằm trong vùng gây
bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of enterocyte effacement,
LEE). Vùng LEE của STEC chứa những gen mã hóa intimin, gen mã hóa thụ thể để
vận chuyển intimin là Tir (translocated intimin receptor) và một số gen khác. Vùng
LEE không chỉ là điều kiện cần mà là điều kiện đủ cho việc hình thành tổn thương
A/E. Tuy nhiên, không phải tất cả STEC đều có gen eae, nhưng tất cả EHEC đều có
gen eae (Nataro và Kaper, 1998). Bệnh tích A/E phụ thuộc vào tương tác giữa protein

màng ngoài vi khuẩn (protein intimin) và protein Tir. Protein Tir được tiết ra khỏi vi
khuẩn, chuyển vị vào màng của tế bào vật chủ (Kenny và ctv, 1997).
Hầu hết các ổ dịch do STEC gây ra bởi những dịng O157:H7, nên người ta cho
rằng có thể serotype này độc hơn và dễ lây truyền hơn những serotype khác. Dấu hiệu
sinh hóa duy nhất cho những dịng STEC O157:H7 là không thể lên men sorbitol hoặc
không tạo ra  - glucuronidase. Vì thế, ở nhiều quốc gia, chẩn đoán STEC chỉ dựa vào


7
việc phát hiện E. coli không lên men sorbitol. O157:H7 và các serotype không phải
O157 liên quan đến việc gây bệnh ở người gồm O26:H11, O103:H2, O111:H NM và
O113:H21 (WHO, 1994).
c. Nguồn lây nhiễm
STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều lồi động vật như trâu, bị, cừu,
dê, heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và
ctv, 1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000). Loài động vật quan trọng
nhất trong việc lây nhiễm cho người là bò. Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào
chuỗi thực phẩm là việc vấy nhiễm những thành phần trong ruột và phân trong quá
trình giết mổ (Butler, 1996).
STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ người này sang
người khác. Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị nhiễm, đặc biệt là
thực phẩm có nguồn gốc động vật. Trong đó thịt bị là ngun nhân chủ yếu
(Keskimaki, 2001).
2.1.5.2. Nhóm EPEC
Thuật ngữ enteropathogenic E. coli được gọi tên đầu tiên bởi Neter và ctv
(1955) để chỉ những dòng E. coli gây tiêu chảy ở trẻ em.
a. Đặc điểm
Cũng như STEC, EPEC có mang gen eae mã hóa protein intimin giúp vi khuẩn
bám dính vào niêm mạc ruột và gây hư hại (A/E); nhưng EPEC không sản xuất độc tố
Shiga.

b. Sự bám dính và phá hủy (AE) của những dòng EPEC
Dấu hiệu của sự nhiễm bệnh do EPEC là hình thành bệnh tích kiểu A/E, có thể
quan sát được trên mẫu sinh thiết ruột từ những bệnh nhân hay thú bị nhiễm và trong
nuôi cấy tế bào (Nataro và Kaper, 1998). Dạng tổn thương này được đặc trưng bởi sự
hư hại của các vi nhung mao và sự kết dính chặt giữa vi khuẩn và màng tế bào biểu
mô. Tổn thương này khác với dạng tổn thương do ETEC và Vibrio cholerae (ETEC và
V. cholerae bám theo kiểu khơng chặt, khơng gây bào mịn vi nhung mao). Gen cần
thiết cho việc tạo tổn thương A/E là gen eae mã hóa intimin. Protein này là yếu tố độc
lực cần thiết của EPEC (Donnerberg và ctv,1993). Theo Nataro và Kaper (1998), gen
eae hiện diện ở tất cả các chủng EPEC, EHEC, Clostridium rodentium và Hafnia


8
alvei, nhưng khơng hiện diện ở những dịng E. coli thuộc hệ vi khuẩn đường ruột
thông thường.
c. Dịch tễ của sự nhiễm EPEC
Cũng như những E. coli gây bệnh khác, sự truyền lây của EPEC qua đường
miệng, với sự vấy nhiễm qua tay, qua thực phẩm.
Điểm đáng chú ý nhất về mặt dịch tễ của bệnh do EPEC là sự phân bố lứa tuổi.
Bệnh thường biểu hiện cấp tính với tiêu chảy nghiêm trọng ở trẻ em. Người trưởng
thành và trẻ em lớn có phần đề kháng hơn với bệnh mà nguyên nhân có thể là do mất
các thụ thể đặc hiệu. Tuy nhiên, EPEC cũng có thể gây tiêu chảy ở người lớn nếu số
lượng vi khuẩn đủ cao.
2.1.5.3. Nhóm ETEC
a. Các yếu tố độc lực: ETEC có hai nhóm quyết định độc lực là độc tố ruột
(enterotoxin) và yếu tố định vị (colonization factor – CF)
 Độc tố ruột enterotoxin
Nhóm ETEC sản sinh độc tố ruột. Có hai loại: độc tố ruột chịu nhiệt (ST) và
độc tố ruột kém chịu nhiệt (LT).
(1)

Độc tố kém chịu nhiệt (heat – labile toxin – LT):

Độc tố LT của E. coli là oligopeptide có liên hệ gần gũi về mặt cấu trúc và chức
năng với độc tố gây bệnh tả trên người (cholera toxin – CT) do Vibrio cholerae tiết ra.
LT và CT giống nhau nhiều đặc tính như cấu trúc, trình tự acid amin (giống nhau
khoảng 80%), tương đồng về thụ thể, hoạt tính enzyme, và kiểu tác động của nó trên
động vật hay trong ni cấy tế bào. LT có hai serogroup chính là LT-I và LT-II. LT-I
và LT-II khơng có phản ứng chéo về mặt miễn dịch.
- LT-I: Được tiết bởi những dòng E. coli gây bệnh trên người và thú. LT-I là
một oligopeptide khoảng 86 kDa, được cấu tạo bởi 1 tiểu đơn vị A 28 kDa và 5 tiểu
đơn vị B 11,5 kDa. Tiểu đơn vị A chịu trách nhiệm như một enzym, gồm peptide A1
và peptide A2 liên kết nhau bởi cầu nối disulfur. Những tiểu đơn vị B sắp xếp thành
vòng nhẫn, liên kết chắc chắn với ganglioside GM 1 và liên kết lỏng lẻo với GD1b và
vài glycoprotein ruột (các thụ thể của LT). Hai loại LT-I có liên hệ gần nhau và phản
ứng chéo một phần với nhau là LTp (LTp-I) đầu tiên được phân lập từ heo và LTh
(LTh- I) được phân lập từ người. Gen mã hóa cho LT là elt hay lt-I nằm trên plasmid


9
mà plasmid này có thể chứa cả gen mã hóa ST và / hoặc gen mã hóa những kháng
nguyên của yếu tố định vị (colonization factor antigen – CFA).
Sau khi bám vào màng tế bào niêm mạc ruột của vật chủ, độc tố LT-I thâm
nhập qua màng trong tế bào, kích thích adenylate cyclase hoạt động dẫn đến làm tăng
mức AMP vịng (cAMP) trong tế bào. cAMP hoạt hóa protein kinase (A kinase) từ
dạng không hoạt động thành dạng hoạt động. Điều này dẫn đến sự phosphoryl những
kênh chloride hoạt động trên mức bình thường ở màng tế bào biểu mơ. Kết quả là kích
thích những tế bào mào ruột tiết ra Cl - một cách tích cực, đồng thời ức chế sự hấp thu
NaCl bởi những tế bào nhung mao (villus). Đây chính là nguyên nhân dẫn đến tiêu
chảy dữ dội (Nataro và Kaper, 1998).

- LT – II: LT-II có cấu trúc giống với LT – I và CT khoảng 55 – 57% ở tiểu đơn
vị A, nhưng không giống với LT-I và CT ở tiểu đơn vị B. LT-II cũng làm gia tăng
cAMP trong tế bào qua cơ chế tương tự như LT-I, nhưng LT-II không liên quan đến
bệnh trên người và thú.
(2) Độc tố chịu nhiệt (heat – stable toxin – ST)
Ngược với LT, ST có trọng lượng phân tử nhỏ và những cầu nối disulfur của nó
giải thích cho khả năng chịu nhiệt của độc tố này. ST được chia thành hai nhóm là STa
và STb. Hai nhóm này khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động. Gen mã hóa cho cả
hai nhóm được tìm thấy chủ yếu trên plasmid và vài gen mã hóa ST cũng được tìm
thấy trên transposon. Độc tố STa (hay còn gọi là ST-I) do ETEC sản sinh và một vài vi
khuẩn Gram âm khác gồm Yersinia enterocolitica và V. cholerae khơng phải O1. ST
giống 50% trình tự acid amin với độc tố chịu nhiệt EAST1 của EAEC. Một số báo cáo
gần đây cho rằng một vài dòng thuộc nhóm ETEC ngồi việc sản sinh ra STa, cịn có
thể sản sinh độc tố EAST1. Trong khi đó, STb chỉ được tìm thấy ở ETEC.
- STa: STa là một peptide gồm 18 – 19 acid amin với trọng lượng phân tử
khoảng 2 kDa. STa được chia thành hai loại là STp (ST porcine hoặc STIa) từ E. coli
phân lập được trên heo và STh (ST human hoặc STIb) của E. coli phân lập trên người.
Cả hai độc tố có thể được tìm thấy ở các dịng ETEC trên người.
Thụ thể chính của STa là enzyme xuyên màng guanylate cyclase C (GC-C).
STa kết hợp với thụ thể GC-C gây hoạt hóa GC, dẫn đến việc gia tăng lượng cGMP
nội bào. Hoạt động này cuối cùng dẫn đến sự gia tăng tiết Cl - và / hoặc ngăn cản sự
hấp thu NaCl, dẫn đến tăng lượng tiết chất lỏng trong ruột, gây tiêu chảy.


10
- STb: STb chủ yếu được tạo ra bởi những dòng ETEC được phân lập từ heo,
vài chủng ETEC được phân lập từ người cũng sản sinh STb. Không như STa, STb gây
ra những tổn thương về mặt mô học trên lớp biểu mô ruột như mất tế bào nhung mao
của lớp biểu mô ruột và teo nhung mao một phần. Thụ thể của STb chưa được biết rõ
mặc dù gần đây người ta cho rằng độc tố kết hợp không đặc hiệu với màng tế bào chất

trước khi vào bên trong tế bào. Không gây ra sự tiết Cl - nhưng STb kích thích tế bào
ruột tiết bicarbonat (HCO3-). STb không làm tăng cAMP hay cGMP nội bào mặc dù nó
kích thích tăng lượng calci nội bào từ ngoại bào. STb cịn kích thích phóng thích PGE 2
và serotonin, từ đó người ta cho rằng hệ thần kinh ruột cũng có thể liên quan đến đáp
ứng tiết dịch gây ra bởi độc tố này (Hitotsubashi và ctv, 1992).
 Yếu tố định vị (colonization factor – CF)
Cơ chế mà ETEC kết dính và cư trú trên lớp màng nhầy ruột đã được nghiên
cứu kỹ. Để gây tiêu chảy, ETEC đầu tiên phải kết dính vào tế bào ruột non nhờ vào
lông trên bề mặt của vi khuẩn, gọi là yếu tố định vị (CF hay CFA - Colonization factor
antigens).
CFA có thể được phân loại dựa trên đặc tính hình thái. Có 3 loại chính gồm loại
lơng hình que cứng, lơng hình que mềm dạng bó, lơng có cấu trúc mảnh mềm. Có ít
nhất 20 loại CF trong ETEC ở người. Hầu hết, chúng được mã hóa bởi gen nằm trên
plasmid, cũng là nơi mã hóa độc tố ST và/hoặc LT (Gaastra và Svennerholm, 1996).
Tiểu đơn vị cấu trúc lông thường tạo miễn dịch vượt trội do đó tiểu đơn vị có tính
kháng ngun rất mạnh.
b. Dịch tễ
Dịng ETEC liên quan đến hai hội chứng lâm sàng chủ yếu: tiêu chảy trên trẻ
em thôi bú ở những nước đang phát triển và tiêu chảy ở khách du lịch. Dịch tễ của
bệnh do ETEC được quyết định bởi nhiều yếu tố: (1) miễn dịch tại màng nhầy khác
nhau của từng cá thể đối với sự nhiễm ETEC, (2) những người nhiễm không có biểu
hiện triệu chứng vẫn bài thải một lượng lớn vi khuẩn qua phân, (3) việc nhiễm chỉ đạt
được khi liều gây nhiễm khá cao. Ba đặc tính này tạo nên tình trạng ơ nhiễm ETEC
trong mơi trường ở những vùng có dịch và hầu hết trẻ em trong vùng này sẽ đương đầu
với ETEC trong thời kì thơi bú. Trẻ em đã ở tuổi đến trường và người lớn có nguy cơ
tiêu chảy do ETEC rất thấp. Dịng ETEC sản sinh ST là nguyên nhân của hầu hết các
trường hợp bệnh.


11

Các nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng, thức ăn và nước bị ô nhiễm là những
phương tiện chủ yếu gây nhiễm ETEC (Black và ctv, 1981). Sự nhiễm ETEC, ở những
vùng dịch thường tập trung chủ yếu vào những tháng nóng và ẩm; khi đó, sự nhân lên
mạnh mẽ của ETEC trong thực phẩm và nước.
Mặc dù sự nhiễm ETEC xảy ra chủ yếu trên trẻ em, nhưng những người trưởng
thành chưa có miễn dịch cũng dễ bị nhiễm. Thật vậy, ETEC là nguyên nhân chính gây
tiêu chảy trên du khách trưởng thành từ những nước đã phát triển đến thăm những
vùng có dịch ETEC. Nhiều nghiên cứu cho rằng 20 - 60% số du khách này có triệu
chứng tiêu chảy và 20 - 40% các trường hợp là do ETEC. Tiêu chảy trên du khách
thường xảy ra ở những du khách lần đầu tiên đến thăm những nước đang phát triển.
Tiêu chảy trên du khách thường là do thức ăn và nước uống bị ơ nhiễm.
c. Khía cạnh lâm sàng
Triệu chứng bệnh thường xảy ra đột ngột với thời gian nung bệnh ngắn (14 – 50
giờ). Bệnh nhân tiêu chảy tồn nước, thường khơng có máu; một vài bệnh nhân có
hiện tượng sốt và ói mửa. Tiêu chảy do ETEC có thể nhẹ, ngắn và tự bớt dần nhưng
cũng có thể gây ra tiêu chảy nghiêm trọng giống như nhiễm Vibrio cholerae.
Hầu hết các trường hợp nhiễm ETEC nguy hiểm đến tính mạng xảy ra trên trẻ
em thôi bú ở những nước đang phát triển. Mặc dù việc sử dụng kháng sinh nhạy cảm
cũng làm giảm mức độ tiêu chảy, nhưng những thuốc trị có hiệu quả thì khơng sẵn có
ở những vùng nguy cơ cao; ngồi ra sự đề kháng kháng sinh của dòng ETEC cũng là
vấn đề đáng quan tâm. Do đó cần phải lưu ý rằng cơ sở của việc chăm sóc bệnh nhân
nhiễm ETEC là duy trì đủ lượng nước trong cơ thể nếu có triệu chứng tiêu chảy.
d. Phát hiện và chẩn đốn
Việc phát hiện nhóm ETEC dựa vào sự phát hiện độc tố LT và/hoặc ST. Có
nhiều phương pháp phát hiện ETEC như: radioimmunoassay, enzyme linked
immunosorbent assay (ELISA), DNA-probe, PCR…
2.2. Kỹ thuật PCR
2.2.1. Nguyên tắc
PCR (polymerase chain reaction - phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. PCR là kỹ thuật in vitro

cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong một thời gian ngắn
(tạo dòng in vitro, không cần sự hiện diện của tế bào).


12
Sự khuếch đại những primer oligonucleotide. Primer là những phân tử DNA
đơn, ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khn (trình tự DNA
mẫu xét nghiệm) nhờ DNA polymerase, và dNTP (deoxyribonucleotide triphosphate)
trong điều kiện phản ứng thích hợp. Các primer này gồm có primer “xuôi” (forward
primer) và primer “ngược” (reverse primer). Kết quả là sẽ có những chuỗi DNA mới
bổ sung với sợi DNA mẫu. Những chuỗi này sẽ tồn tại dưới dạng DNA chuỗi đôi. Sự
tổng hợp này sẽ được lặp lại theo một số chu kỳ nhất định đã được thiết lập.
Multiplex – PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên
đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng nhiều cặp primer trong một
phản ứng. Multiplex – PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1988 và kể từ
đó multiplex – PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA
(Protocol online).
2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn:
 Giai đoạn 1: Giai đoạn biến tính (denaturation)
Hai mạch của phân tử DNA tách rời nhau thành hai mạch đơn. Phân tử DNA
được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử, thường là ở
94 -950C trong vòng 30 giây đến 1 phút.
 Giai đoạn 2: Giai đoạn ủ bắt cặp (anealing)
Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của các primer) cho phép các primer bắt cặp
với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động khoảng 40 – 60 0C tuỳ thuộc Tm
của các primer sử dụng và kéo dài từ 30 giây dến 1 phút.
 Giai đoạn 3: Giai đoạn kéo dài (elongation hay extension)
Nhiệt độ giai đoạn này được tăng lên 720C giúp DNA polymerase hoạt động tổng

hợp DNA tốt nhất với sự hiện diện của 4 deoxyribonucleotide triphosphate. Đoạn
DNA nằm giữa hai primer được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA.
* Mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn trên sẽ được lặp lại nhiều lần và mỗi lần làm tăng
đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính theo cơng thức:
Tổng DNA khuếch đại = m*2n
Với n: Số chu kỳ; m: Số bản sao của chuỗi mã hóa


13
* Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ đầu tiên có chiều dài khơng xác định vì DNA
polymerase sẽ tiếp tục tổng hợp DNA mới đến khi nó dừng lại hoặc bị phá hủy bởi chu
kỳ tiếp theo.Sản phẩm kéo dài ở chu kỳ thứ hai cũng không xác định. Tuy nhiên, ở chu
kỳ thứ 3, đoạn DNA mong muốn (DNA đích) được tổng hợp có chiều dài xác định. Từ
chu kỳ thứ 4 trở đi, trình tự đoạn DNA đích được khuếch đại. Vì thế số copy cuối cùng
của trình tự đích được tính theo cơng thức:
Số copy cuối cùng của trình tự đích = (2n – 2n) * x
n : Số chu kỳ
2n: Sản phẩm có chiều dài không xác định sau chu kỳ 1 và 2
x : Số bản sao của chuỗi mã hóa
* Số chu kỳ của phản ứng PCR
- Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong 1 phản ứng, vì phản ứng
PCR diễn ra qua hai giai đoạn:
+ Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu
ban đầu.
+ Giai đoạn sau đó, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
 Phân hủy và cạn kiệt các thành phần của phản ứng.
 Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng.
 Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với primer mà lại bắt
cặp với nhau.
Số chu kỳ của phản ứng tùy thuộc số lượng mẫu ban đầu. DNA mẫu ban đầu là

105 thì cần khoảng 25 – 30 chu kỳ, cịn DNA mẫu là 10 2 – 103 thì số chu kỳ phải là 35
– 40.
Giai đoạn biến tính
(denaturation)
Giai đoạn ủ bắt cặp
(anealing)
Giai đoạn kéo dài
(elongation hay
extension)
Hình 2.1 Nguyên lý của phản ứng PCR


Nhiệt độ (0C)

14

Biến tính

Lặp lại n lần

94-950C

Kéo dài

Ủ bắt cặp

720C

40-700C

Thời gian (phút)

Hình 2.2 Chu kỳ nhiệt độ của phản ứng PCR
2.2.3. Các thành phần của một phản ứng PCR
- DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
- Primer: Primer là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung
với trình thự base của hai đầu mạch khn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA. Việc
chọn primer là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR. Các primer được chọn phải
đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, khơng trùng với các trình tự lặp lại trên
gen, khơng có sự bắt cặp bổ sung giữa primer xi và primer ngược và cũng khơng có
những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một primer. Chiều dài các
primer tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide (thường là 18 – 24
nucleotide). Trình tự nằm giữa hai primer xi và ngược khơng quá lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
- Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được
chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA polymerase
khơng bị phá hủy ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối quá trình phản
ứng dưới sự hiện diện của Mg2+. Taq DNA polymerase tổng hợp DNA theo hướng
5’3’ và hoạt động tốt nhất ở 70-720C.


15
- Các nucleotide (dNTP – deoxyribonucleotide triphosphate): là hỗn hợp 4 loại:
dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
- Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tùy loại enzyme
được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg 2+. Nó hình thành một phức hợp hòa tan với
dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme polymerase, làm
tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ Mg 2+ (thường được sử
dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc hiệu của
phản ứng PCR. Ngồi ra nồng độ MgCl 2 có thể ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của

primer, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây đơn, hoạt động của enzyme và sự trung
thực của kết quả. Nồng độ Mg 2+ phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử
nghiệm. Nồng độ MgCl2 trong hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 –
5mM (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998).
2.2.4. Phân tích kết quả PCR
Sản phẩm của phản ứng PCR (đoạn DNA được khuếch đại) sẽ được phát hiện
bằng phương pháp điện di.
Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các
DNA. DNA là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác
động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về điện cực dương của điện trường. Sự
di chuyển của phân tử trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuộc vào
khối lượng của các phân tử (tức là số nucleotide), nồng độ các thành phần của gel và
điện thế.
Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc đứng. Các DNA trong gel
agarose được hiện ra dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide. Chất này có khả
năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác dụng của
tia UV (bước sóng  =300 nm) thành vạch màu đỏ da cam.
Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố
đánh dấu “trọng lượng phân tử” (molecular weight make – MWM) là một tập hợp
nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder).
2.2.5. Những ứng dụng của PCR
2.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ


16
PCR có khả năng sử dụng một phân tử DNA đơn như là khuôn mẫu cho phản
ứng khuếch đại. Việc khuếch đại thành cơng DNA được ly trích từ tế bào gốc chỉ chứa
một copy đơn của bộ gen ở người đã chứng minh được điều này.
Khía cạnh này của PCR đã được chứng minh là rất quan trọng trong các phân
tích pháp lý, cho phép kỹ thuật genetic fingeprinting được sử dụng chỉ với một sợi tóc

và thậm chí với những vết máu, khiến cho những tên tội phạm khó có thể lọt lưới pháp
luật. PCR cũng được sử dụng để khuếch đại DNA từ xương của những nạn nhân bị
giết (trong một vài trường hợp xác định danh tánh của họ) trong khi các phần thân xác
còn lại đã bị phân rã, do đó khơng thể sử dụng các phương pháp phân tích thơng
thường.
Tính nhạy cảm của PCR mở ra những khả năng mới trong khảo cổ và cổ sinh
vật học, bằng cách làm cho các trình tự nucleotide được thu nhận từ các dấu vết DNA
hiện diện trong các nguyên liệu được bảo tồn hay nguyên liệu hóa thạch. Phương pháp
PCR cũng được sử dụng để nghiên cứu mối quan hệ di truyền của người cổ xưa thơng
qua khuếch đại và phân tích các trình tự di truyền từ các dấu vết DNA được giữ trong
xương hay được bảo tồn trong các xác ướp.
2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng
Phương pháp PCR cho phép các thơng tin giải trình tự được thu nhận một cách
nhanh chóng, thơng qua việc khuếch đại vùng liên quan trên genome dựa trên các kết
quả phân tích trực tiếp từ các sản phẩm của PCR. Khả năng nhận biết đột biến một
cách nhanh chóng khơng chỉ quan trọng trong chẩn đốn lâm sàng mà nó cũng làm gia
tăng các nghiên cứu các bệnh di truyền.
PCR cũng được ứng dụng trong chẩn đốn các tác nhân gây bệnh. Ví dụ:
Khuếch đại DNA của các vi khuẩn, virus trong các mẫu bệnh phẩm trước khi các triệu
chứng bệnh bắt đầu xuất hiện nhiều ngày, nhiều tuần, thậm chí nhiều tháng. Từ đó ta
có thể đề ra cách chữa trị thích hợp và ngăn chặn được thiệt hại.
2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA
PCR không chỉ khuếch đại các khuôn mẫu DNA, các khuôn mẫu RNA cũng
được khuếch đại nếu ban đầu chúng được biến đổi thành DNA tái tổ hợp (cDNA) nhờ
enzyme reverse transcriptase.
Một ứng dụng có ích của RT – PCR là xác định số lượng tương đối của một
mRNA trong các mô khác nhau hay trong cùng một mô nhưng tại các thời điểm khác


17

nhau. Số lượng của một mRNA trong tế bào chính là sự phản ảnh về khả năng hoạt
động của gen cha mẹ. Vì thế, sự xác định số lượng của mRNA tạo ra những thay đổi
trong sự biểu hiện gen để chúng có thể được kiểm sốt.
2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau
Sự khuếch đại ngẫu nhiên (random amplification) với các primer ngắn là kỹ
thuật hữu dụng trong phát sinh chủng loại, khu vùng nghiên cứu liên quan đến sự tiến
hóa và suy vong của các lồi hay các nhóm sinh vật khác. Hai sinh vật có quan hệ thân
tộc sẽ có nhiều band giống nhau hơn hai sinh vật có quan hệ thân tộc kém (Brown,
1994).
2.2.6. Các hạn chế của phương pháp PCR
Do độ nhạy rất cao của PCR đồng thời với thao tác đơn giản, người ta có
khuynh hướng sử dụng phương pháp này để giải quyết nhiều vấn đề. Tuy nhiên, ta
không thể quên rằng phương pháp có nhiều hạn chế và địi hỏi sự thận trọng đặc biệt
khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả. Có thể kể ba vấn đề lớn khi
sử dụng phương pháp PCR:
2.2.6.1. Trong thực nghiệm, kích thước các đoạn cần khuếch đại là giới hạn đầu
tiên
Trừ vài trường hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với
những đoạn DNA lớn hơn 3 kb. Việc sử dụng PCR đối với các DNA có độ dài dưới
1,5 kb cho kết quả tốt. Với những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải
được xác định qua thực nghiệm.
2.2.6.2. Sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR, gắn liền với khả
năng khuếch đại bản sao đối với phương pháp này
Vấn đề đặc biệt cấp thiết trong những ứng dụng về chẩn đốn vì hậu quả rất
nghiêm trọng. Nguồn ngoại nhiễm lớn nhất thường là các sản phẩm khuếch đại của
những lần thao tác trước. Người ta đã chứng minh được rằng việc mở nắp các ống
nghiệm sau những lần khuếch đại trong một khoảng khơng gian kín trong phịng thí
nghiệm sẽ khiến cho các phân tử đã được khuếch đại thoát ra khỏi ống nghiệm bay lơ
lửng trong khơng khí và bám vào tường, cửa, thiết bị dung cụ…rồi nhiễm vào các
phản ứng tiến hành sau đó. Có thể khắc phục một phần vấn đề này bằng một số biện

pháp sau:


18
- Các công đoạn thao tác khác nhau như thiết lập phản ứng PCR và phân
tích các sản phẩm khuếch đại phải được tiến hành ở những địa điểm cách xa nhau.
- Dụng cụ dùng để thiết lập phản ứng (micropipette) không sử dụng cho
các thao tác khác. Đầu tip sử dụng với micropipette phải có lớp lọc tránh sự nhiễm vào
đầu micropipette bởi các phân tử khuếch đại khi hút dung dịch phản ứng.
- Dùng tia tử ngoại để loại bỏ các phân tử còn lại từ các lần khuếch đại
trước.
- Tất cả các thành phần phản ứng đều được chia thành những lượng nhỏ,
tính tốn sao cho 1, 2 lần thao tác.
2.2.6.3. Các sai sót gây ra do Taq polymerase
Sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỉ lệ sai khá cao (10-4, nghĩa là cứ
10000 nucleotide thì enzyme gắn sai 1 nucleotide). Đặc tính này khơng nghiêm trọng
nếu ta chỉ cần xem xét kích thước hay sự có mặt của một sản phẩm khuếch đại, nhưng
có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide của DNA. Ta khơng thể
loại bỏ hồn tồn các sai khác này mà chỉ có thể giảm bớt; ví dụ như đảm bảo sự cân
bằng nồng độ các nucleotide trong phản ứng, xác định trình tự của nhiều sản phẩm
khuếch đại từ nhiều thao tác riêng biệt, so sánh trước khi đi đến trình tự chính thức,…


19

Phần 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1. Thời gian: Từ tháng: 2/2005 - 7/2005
3.1.2. Địa điểm

- Mẫu phân bò khảo sát được lấy từ hộ hoặc trại chăn nuôi ở Đồng Nai; mẫu
phân heo được lấy ở Tiền Giang; mẫu bề mặt thịt bò được lấy ở lò mổ Dĩ An – Bình
Dương.
- Ni cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phịng thực hành Kiểm nghiệm
Thú sản và Mơi trường, khoa Chăn nuôi – Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành
Phố Hồ Chí Minh.
- Xác định các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí
Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nơng Lâm TP. HCM.
3.2. Nội dung
- Thu thập mẫu phân tiêu chảy của bò, bê, heo và mẫu bề mặt thịt bị.
- Ni cấy, phân lập E. coli trên môi trường MAC, SMAC, CT-SMAC.
- Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli / nhóm E. coli.
- Giữ gốc khuẩn lạc riêng lẻ trên ống thạch NA
- Ly trích DNA của E. coli phân lập được.
- Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen gây độc của E. coli.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Lấy mẫu
- Mẫu phân tiêu chảy
Được lấy từ trực tràng bằng tăm bông rồi cho vào môi trường vận chuyển
Carry Blair. Bảo quản ở 4 – 80C cho đến khi tiến hành xét nghiệm (mẫu được giữ tối
đa 24 giờ).
- Mẫu bề mặt thịt
Dùng gạc y tế tẩm nước muối sinh lý quét đều lên bề mặt thịt, cho vào chai có
sẵn 50 ml nước peptone đệm. Sau đó đậy chặt chai, cho vào túi ny lông buộc kỹ. Bảo
quản 4 - 80C, chuyển về phịng thí nghiệm.


20
- Số lượng mẫu: Số lượng mẫu khảo sát được tính là số mẫu đã phân lập được
vi khuẩn E. coli từ các mẫu đã lấy.

Bảng 3.1 Số lượng mẫu
STT
1
2
3
4

Đối tượng mẫu
Phân bị
Phân tiêu
Phân bê
chảy
Phân heo
Thịt
Bị
Tổng cộng

Số lượng
8
10
9
9
36

3.3.2. Ni cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli
3.3.2.1. Môi trường nuôi cấy
- Môi trường nuôi cấy, phân lập vi khuẩn: Mac Conkey (MAC), SorbitolSMAC, thạch dinh dưỡng (NA), peptone đệm, Cefixime-Tellurite-SMAC (CTSMAC), hóa chất thử IMViC…
3.3.2.2. Ni cấy và phân lập
(1) Mẫu phân tiêu chảy được cấy trực tiếp trên đĩa thạch MAC và SMAC để có
những khuẩn lạc rời rạc sau 24 giờ ở 37oC. Mẫu bề mặt thịt được làm đồng đều trong

125 ml peptone đệm phosphate có bổ sung kháng sinh cefixime với nồng độ 0,0125
mg/l, vancomycin với nồng độ 8 mg/l (FDA, 2002). Ủ 24 giờ ở 37 oC, cấy sang môi
trường CT-SMAC. Vi khuẩn E. coli nhóm STEC phát triển tạo khuẩn lạc không màu
hoặc xám với tâm đục, E. coli khác cho khuẩn lạc hồng giống như trên môi trường
MAC.
(2) Chọn khuẩn lạc điển hình của E. coli
- Quan sát các loại khuẩn lạc hiện diện trên bề mặt thạch MAC, SMAC, CTSMAC.
- Mỗi nhóm khuẩn lạc chọn 6 – 10 khuẩn lạc rời rạc đại diện E. coli của mẫu
khảo sát. Các nhóm khuẩn lạc như sau:
 6 – 10 khuẩn lạc hồng MAC (Ký hiệu HM).
 6 – 10 khuẩn lạc trắng SMAC (Ký hiệu TS).
 6 – 10 khuẩn lạc đỏ hồng SMAC (Ký hiệu HS).