Luận văn : ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ part 1 pptx

1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************







KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP




NG DNG K THUT MULTIPLEX - PCR  PHÁT HIN CÁC GEN C
LC CA VI KHUN
ESCHERICHIA COLI PHÂN LP T
PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHY
VÀ THT BÒ





Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện : ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

2
************







KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



NG DNG K THUT MULTIPLEX - PCR  PHÁT HIN CÁC GEN C
LC CA VI KHUN

ESCHERICHIA COLI PHÂN LP T
PHÂN BÒ, PHÂN HEO TIÊU CHY
VÀ THT BÒ




Giáo viên hng dn: Sinh viên
thc hin:
PGS. TS. NGUYN NGC TUÂN OÀN
TH TUYT LÊ
BSTY. BÙI THỊ THU TRANG








Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2005


3


LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành gởi lời cảm tạ với tấm lòng biết ơn sâu sắc đến:

* Gia đình đã tạo cho tôi chỗ dựa vững chắc về vật chất lẫn tinh thần. Ba mẹ đã
luôn sát cánh bên tôi, nuôi dưỡng chăm sóc tôi nên người, động viên tôi học tập.
* Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành phố Hố Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiết thức
cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
* PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân đã hết lòng giúp đỡ, hướng dẫn cùng những hỗ
trợ rất thiết thực cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài, giúp tôi hoàn thành tốt
khóa luận tốt nghiệp cũng như nâng cao kiến thức.
* BSTY. Bùi Thị Thu Trang đã nhiệt tình hướng dẫn, động viên và giúp đỡ tôi
hoàn thành tốt khóa luận này.
* Quý thầy cô, cán bộ công chức tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa
sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
* BSTY. Lê Hữu Ngọc, phòng thực hành Kiểm nghiệm Thú sản và Môi trường,
Khoa CNTY Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
* Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K27 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn
trong thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập.
Chân thành cảm ơn
Đoàn Thị Tuyết Lê








4

TÓM TẮT


ĐOÀN THỊ TUYẾT LÊ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, Tháng 8/2005. “ỨNG
DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX – PCR ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC GEN ĐỘC LỰC
CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ, PHÂN HEO
TIÊU CHẢY VÀ THỊT BÒ”.

Hội đồng hướng dẫn:
PGS. TS. Nguyễn Ngọc Tuân
BSTY. Bùi Thị Thu Trang

Đề tài được thực hiện nhằm xác định các gen độc lực stx1, stx2, eae, hly, lt-I,
sta, stb, vt2e của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy của bò, heo,
bê và 9 mẫu bề mặt thịt bò bằng kỹ thuật multiplex – PCR. Ghi nhận được khuẩn lạc
hồng trên môi trường MAC; trên SMAC có 2 loại: khuẩn lạc hồng và khuẩn lạc trắng;
khuẩn lạc trắng trên CT-SMAC. Mỗi nhóm chọn khoảng 6 – 10 khuẩn lạc riêng lẻ. Ly
trích DNA theo nhóm khuẩn lạc và từng khuẩn lạc riêng lẻ theo phương pháp nhiệt.
Kết quả multiplex - PCR được ghi nhận như sau:
(1) Nhóm khuẩn lạc có mang gen độc lực thì chưa chắc từng khuẩn lạc riêng lẻ có
mang gen độc lực đó.
(2) Tần số phát hiện các gen độc lực của E. coli từ những mẫu phân tiêu chảy lần
lượt là: 25% trên phân bò tiêu chảy (stx2, hly), 30% trên phân bê tiêu chảy
(stx1, stx2, hly, eae), 88,89% trên phân heo tiêu chảy (stb, lt, vt2e, hly, stx1,
eae). Điều này chứng tỏ rằng trên cả 3 nhóm đối tượng trên, E. coli mang các
gen độc lực có thể là nguyên nhân quan trọng gây tiêu chảy.
(3) 9 mẫu bề mặt thịt bò chưa phát hiện được gen độc lực của E. coli.
(4) Chưa phát hiện được gen sta trong E. coli phân lập từ 27 mẫu phân tiêu chảy
của bò, bê và heo.

5



SUMMARY

“Apply multiplex – PCR to detect some virulence genes of Escherichia coli
isolated from diarrhea cattle and swine faeces, beef”

The study was carried out to detect stx1, stx2, eae, hly, lt-I, sta, stb, vt2e genes
of isolated E. coli from 27 diarrhea stools samples of cattles, calves, piglets, and 9
swabs of the beef surface by multiplex – PCR. Observation had one group of pink
colony on MAC, white colony on SMAC, pink colony on SMAC, white colony on
CT-SMAC. Each colony group was chosen about 6 – 10 separate colonies. DNA of the
colony groups and each separate colony were extracted by heat method. The results of
multiplex – PCR were showed that:
(1) The colony group has virulence genes, the separate colony does or doesn’t have
the genes.
(2) Frequency of virulence genes of isolated E. coli from diarrhea stools samples was
25% from cattles (stx2, hly), 30% from calves (stx1, stx2, eae, hly), 88,89% from
piglets (stb, lt-I, vt2e, hly, stx1, eae).
(3) 9 swabs of the beef surface were detected that non virulence genes of E. coli.
(4) Sta gene of E. coli isolated from 27 diarrhea cattle, calf, piglet stools samples

weren’t detected.











6


MỤC LỤC

CHƯƠNG TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Summary v
Mục lục vi
Danh sách các chữ viết tắt viii
Danh sách các hình x
Danh sách các bảng xi

1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1
2. TỔNG QUAN 3
2.1. Vi khuẩn E. coli 3

2.1.1. Định nghĩa 3
2.1.2. Nuôi cấy và đặc điểm sinh hóa 3
2.1.3. Yếu tố kháng nguyên 4
2.1.4. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli 4
2.1.5. Phân loại E. coli 4
2.1.5.1. Nhóm STEC/ VTEC/ EHEC 4
2.1.5.2. Nhóm EPEC 7
2.1.53. Nhóm ETEC 8
2.2. Kỹ thuật PCR 11
2.2.1. Nguyên tắc 11
2.2.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR 12
2.2.3. Các thành phần của phản ứng PCR 14
2.2.4. Phân tích kết quả PCR 15
2.2.5. Những ứng dụng của PCR 15

7
2.2.5.1. PCR được sử dụng để nghiên cứu lượng DNA nhỏ 15
2.2.5.2. PCR được sử dụng trong chẩn đoán lâm sàng 16
2.2.5.3. PCR được dùng để khuếch đại RNA 16
2.2.5.4. PCR được sử dụng để so sánh các genome khác nhau 17
2.2.6. Các hạn chế của PCR 17
3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 19
3.2. Nội dung 19
3.3. Phương pháp nghiên cứu 19
3.3.1. Lấy mẫu 19
3.3.2. Nuôi cấy, phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli 20
3.3.3. Xác định các gen stx1, stx2, eae, hly, stx2e, sta, stb, lt-I của
E. coli phân lập được 23
3.3.4. Điện di trên gel aragose và đọc kết quả điện di 25

4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27
4.1. Kết quả phân nhóm khuẩn lạc và xác định E. coli từ các khuẩn lạc
phân lập được 27
4.1.1. Các loại khuẩn lạc trên môi trường
thạch MAC, SMAC, và CT-SMAC 27
4.1.2. Xác định E. coli cho các khuẩn lạc được chọn. 27
4.2. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân bò tiêu chảy 28
4.3. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân heo tiêu chảy 32
4.4. Kết quả phát hiện gen độc lực của E. coli
phân lập được từ phân bê tiêu chảy 36
4.5. Kết quả phát hiện các gen độc lực của E. coli
phân lập từ mẫu bề mặt thịt bò 38
4.6. Tổng kết kết quả phát hiện các gen độc lực
của E. coli trên các mẫu khảo sát 39
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 41
5.1. Kết luận 41

8
5.2. Đề nghị 41
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
7. PHỤ LỤC 46
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A/A : Aggregative adhesion
A/E : Attaching and effacing
CF : Colonization factor
CFA : Colonization factor antigen
CT : Cholera toxin

CT-SMAC :Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey agar
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
eae : E. coli attaching and effacing
EaggEC = EAEC : Enteroaggregative E. coli
EHEC : Enterohaemorrhagic E. coli
EIEC : Enteroinvasive E. coli
EMB : Eosin methylen blue agar
EPEC : Enterophathogenic E. coli
ETEC : Enterotoxigenic E. coli
FAO : Food and Agriculture Organization
HC : Haemorrhagic colitis
Hly : Haemolysin
HM : Khuẩn lạc hồng trên môi trường MAC
HS : Khuẩn lạc hồng trên môi trường SMAC
HUS : Haemolytic uraemic syndrome
IMViC : Indol, Methyl Red, Voges - Proskauer, Simmon Citrate
LEE : Locus of enterocyte effacement
LT : Heat labile toxin
MAC : MacConkey agar
NA : Nutrient agar

9
PCR : Polymerase chain reaction
SMAC : Sorbitol MacConkey agar
ST : Heat stable toxin
STEC : Shiga toxin-producing E. coli
Stx : Shiga toxin
TBE : Tris borate EDTA
TC : Khuẩn lạc trắng trên môi trường CT-SMAC

TCVN : Tiêu chuẩn Việt Nam
Tir : Translocated intimin receptor
Tm : Melting temperature
TS : Khuẩn lạc trắng trên môi trường SMAC
UV : Ultra violet
VT : Verotoxin
VTEC : Verotoxigenic E. coli