Luận văn : Sử dụng kỹ thuật RFLP khảo sát sự đa dạng di truyền của nấm Rhizoctonia solani phân lập từ nhiều cây ký chủ khác nhau part 4 doc

28
Bảng 4.2. Điều kiện cho phản ứng PCR
Thành phần phản ứng
Nồng độ đầu
Nồng độ cuối
Thể tích
PCR Buffer
MgCl
2

dNTPs
Primer ITS4
Primer ITS5
Taq DNA polymerase
DNA khuôn mẫu
Nước cất vô trùng
10X
50 mM
2 mM
10 pmol/µl
10 pmol/µl
1UI
< 100 ng
1X
1,5 mM
0,2 mM
0,4 pmol/µl
0,4 pmol/µl
0,04 UI

2,5 µl
0,75 µl
2 µl
1 µl
1 µl
1 µl
1 µl
vừa đủ V 25 µl

Bảng 4.3. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Các bƣớc của phản ứng
Nhiệt độ
Thời gian
Giai đoạn khởi động
Chạy chu kỳ (30 chu kỳ)
Tách DNA khuôn
Ủ bắt cặp
Kéo dài
Giai đoạn kết thúc
94
0
C

94
0
C
56
0
C

72
0
C
72
0
C
3 phút

1 phút
45 giây
1 phút
7 phút

4.2.4. Kết quả khuếch đại vùng rDNA-ITS của nấm R. solani
Primer ITS 4 và ITS 5 là các universal primer được White và ctv. (1990) thiết kế
để khuếch đại vùng ITS nằm trong vùng rDNA của ti thể và nhân của nấm. Vùng
rDNA-ITS (gồm ITS1-5,8S-ITS2) có chiều dài khoảng 700 bp.
Sau khi chọn được quy trình thích hợp cho phản ứng PCR, chúng tôi đã tiến hành
khuếch đại đoạn rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani phục vụ cho mục đích tiếp
theo. Kết quả được thể hiện qua hình 4.5.
Kết quả điện di sản phẩm PCR của chúng tôi trên gel agarose cho thấy, chúng tôi
đã thu được một sản phẩm có kích thước khoảng 700 bp. Như vậy, chúng tôi đã
khuếch đại thành công vùng rDNA-ITS của nấm R. solani

29

Hình 4.5. Ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn rDNA-ITS
của các dòng nấm R. solani
1. XL-4; 2. RM-61; 3. BV-61-02; 4. CX-8-02;
5. CTĐ-77; 6. BV-62-03; 7. ĐHL-63; 8. KT-63

4.3. Phân tích RFLP vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani
Schneider và ctv (1997), khi sử dụng kỹ thuật RFLP trên vùng rDNA-ITS của
nấm R. solani đã xác định được 13 enzyme (Msp I, Hae III, Hinc II, EcoR I, Cla I,
Hinf I, Sau3A I, Dde I, Alu I, Hha I, Dra I, Sty I, và Taq I) có thể cho thấy sự đa hình
các đoạn cắt giới hạn giữa các nhóm liên hợp của nấm R. solani. Trong điều kiện giới
hạn của đề tài, chúng tôi chỉ chọn 3 enzyme Hae III, Alu I, và Taq I để cắt đoạn
rDNA-ITS đã được khuếch đại của 9 dòng nấm R. solani.
Ba enzyme cắt giới hạn Hae III, Alu I và Taq I đều cắt vùng rDNA-ITS của nấm
R. solani thành các phân đoạn DNA nhỏ hơn và cho các kiểu cắt khác nhau phụ thuộc
vào dòng nấm. Mỗi kiểu cắt khác nhau được tính là một kiểu gen. Các dòng nấm có
bao nhiêu kiểu cắt khác nhau được tính là bấy nhiêu kiểu gen.
Với enzyme Alu I, vùng rDNA-ITS của 9 dòng nấm R. solani được cắt thành một
trong 4 kiểu cắt sau: kiểu A
1
gồm có hai phân đoạn DNA có kích thước khoảng 500 bp
và 220 bp; kiểu A
2
gồm có ba phân đoạn DNA có kích thước khoảng 410 bp, 220 bp,
và 80 bp; kiểu A
3
gồm có ba phân đoạn DNA có kích thước khoảng 430 bp, 220 bp, và
70 bp; và kiểu A
4
gồm có 3 phân đoạn DNA có kích thước khoảng 480 bp, 200 bp và
50 bp (Hình 4.6 và Bảng 4.4).


700bp
1 2 3 4

30

Hình 4.6. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS
của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Alu I
1. RM-61; 2. BV-61-02; 3. CX-8-02; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03;
M. Ladder 100 bp; 6. KT-63-01; 7. XL-4; 8. L-73; 9. ĐHL-63.

Kết quả cho thấy, vùng rDNA-ITS của 3 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61-02,
và L-73) có một vị trí cắt của Alu I, và 6 dòng (CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63-
01, XL-4, và ĐHL-63) có hai vị trí cắt của Alu I, tạo ra các đoạn cắt có chiều dài khác
nhau.
Với enzyme Hae III, vùng rDNA-ITS của tất cả 9 dòng nấm R. solani nói trên đều
có hai vị trí cắt của enzyme này và cho ra ba phân đoạn DNA với chiều dài các đoạn
cắt khác nhau tùy theo dòng nấm. 9 dòng nấm này cho ra 5 kiểu cắt RFLP: kiểu H
1

(dòng RM-61, BV-61-02, CTĐ-77, BV-62-03, và L-73) với các băng có kích thước
khoảng 510 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H
2
(dòng CX-8-02) với các băng có kích thước
khoảng 500 bp, 120 bp, và 90 bp; kiểu H
3
(dòng KT-63-01) với các băng có kích thước
khoảng 580 bp, 490 bp, và 120 bp; kiểu H
4
(dòng XL-4) với các băng có kích thước
khoảng 510 bp, 120 bp, và 80 bp; và kiểu H
5
(dòng ĐHL-63) với các băng có kích

thước khoảng 530 bp, 120 bp, và 80 bp (Hình 4.7 và Bảng 4.4)

1 2 3 4 5 M 6 7 8 9
500bp
1 2 LD 3 4 5 6 7 LD 8 9
200bp

31

Hình 4.7. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng ITS rDNA
của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Hae III
1. RM-61; 2. BV-61-02; M: ladder 100 bp; 3. CX-8-02; 4. CTĐ-77; 5. BV-62-03;
6. KT-63-01; 7. XL-4; M. Ladder 100 bp; 8. L-73; 9. ĐHL-63.
.
s
Hình 4.8. Ảnh điện di sản phẩm cắt vùng rDNA-ITS
của nấm R. solani bằng enzyme hạn chế Taq I
1. RM-61; 2. BV-61-02; 3. CX-8-02; M: ladder 100 bp;
4. CTĐ-77; 5. BV-62-03; 6. KT-63-01; 7. XL-4.

Với enzyme Taq I, chúng tôi chỉ thực hiện trên 7 dòng (hai dòng L-73 và ĐHL-
63 chưa được thực hiện). Tất cả 7 dòng được cắt đều có hai vị trí cắt của Taq I và tạo
thành 3 phân đoạn DNA. Kết quả, 7 dòng cho ra 4 kiểu cắt RFLP: kiểu T
1
(dòng RM-
61, BV-61-02, BV-62-03, và KT-63) với các phân đoạn DNA có kích thước khoảng
350 bp, 310 bp, và 60 bp; kiểu T
2
(dòng CX-8-02) với các phân đoạn DNA có kích
thước khoảng 360 bp, 290 bp, và 60 bp; kiểu T

3
(dòng CTĐ-77) với các phân đoạn
100bp
500bp
100bp
500bp
1 2 3 M 4 5 6 7
1 2 M 3 4 5 6 7 M 8 9

32
DNA có kích thước 340 bp, 320 bp, và 60 bp; và kiểu T
4
(dòng XL-4) với các phân
đoạn DNA có kích thước khoảng 340 bp, 310 bp, và 60 bp (Hình 4.8 và Bảng 4.4)
Kết hợp các kiểu cắt enzyme giới hạn bởi 3 enzyme (Hae III, Alu I và Taq I), 7
dòng nấm R. solani (trừ 2 dòng L-73 và ĐHL-63) có 6 dạng (rDNA-ITS): Dạng 1 (A
1
,
H
1
, T
1
), dạng 2 (A
2
, H
2
, T
2
), dạng 3 (A
3

, H
1
, T
3
), dạng 4 (A
3
, H
1
, T
1
), dạng 5 (A
3
, H
3
,
T
1
), và dạng 6 (A
2
, H
4
, T
4
). Dạng 1 có hai dòng RM-61 và BV-61-02; dạng 2 chỉ có
một dòng là dòng CX-8-02, dạng 3 – dòng XL-4; dạng 4 – dòng CTĐ-77; dạng 5 –
dòng BV-62-03; và dạng 6 – dòng XL-4 (Bảng 4.4). Riêng 2 dòng L-73 và ĐHL-63 vì
chỉ mới cắt với 2 enzyme Alu I và Hae III, nên chưa xác định được dạng rDNA-ITS
của chúng.
Tóm lại khi cắt bằng 3 enzyme Hae III, Alu I và Taq I, chúng tôi đã nhận thấy có
sự đa hình các đoạn cắt giới hạn trong vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani

phân lập từ các cây ký chủ khác nhau.

Bảng 4.4. Chiều dài các đoạn cắt giới hạn vùng rDNA-ITS đƣợc ƣớc tính (bp)
của 9 dòng nấm R. solani khi cắt với 3 enzyme Alu I, Hae III, và Taq I


Enzyme
Dạng 1
(RM-61 và
BV-61-02)
Dạng 2
(CX-8-
02)
Dạng 3
(CTĐ-
77)
Dạng 4
(BV-
62-03)
Dạng 5
(KT-
63-01)
Dạng 6
(XL-4)

Dạng ?
L-73

Dạng ?
ĐHL-

63
Alu I
A
1
*
A
2

A
3

A
3

A
3

A
2

A
1

A
4

500
220
410
220

(80)**
430
220
(70)
430
220
(70)
430
220
(70)
410
220
(80)
500
220
480
200
(50)
Hae III
H
1
H
2

H
1

H
1

H
3

H
4

H
1

H
5

510
120
(90)
500
120
(90)
510
120
(90)
510
120
(90)
580
490
120
510
120
(80)

510
120
(90)
530
120
(80)
Taq I
T
1
T
2

T
3

T
1

T
1

T
4



350
310
(60)
360

290
(60)
340
320
(60)
350
310
(60)
350
310
(60)
340
310
(60)
Chưa
thực
hiện
Chưa
thực
hiện
* : A
1
– T
4
chỉ tên các kiểu RFLP với các enzyme Alu I, Hae III, hoặc Taq I.
** : Những băng (band) không nhìn thấy rõ trên ảnh điện di.

33
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

5.1 Kết luận
1. Có thể sử dụng quy trình ly trích DNA của Lee và Taylor (1990) có cải tiến để
ly trích DNA tương đối tinh sạch sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn rDNA-
ITS của nấm R. solani.
2. Đã cải tiến được chu trình nhiệt và các thành phần phản ứng PCR để khuếch
đại thành công vùng rDNA-ITS của các dòng nấm R. solani với cặp primer ITS 4 và
ITS 5.
3. Tính đa hình các đoạn cắt giới hạn giữa 9 dòng nấm R. solani (RM-61, BV-61-
02, CX-8-02, CTĐ-77, BV-62-03, KT-63-01, XL-4, L-73, và ĐHL-63) đã được nhận
thấy khi cắt vùng rDNA-ITS với enzyme Alu I, Hae III, và Taq I. Phân tích ITS-RFLP
cho thấy, 7 dòng nấm R. solani nói trên (trừ 2 dòng L-73, và ĐHL-63) thuộc 6 nhóm
khác nhau.

5.2. Đề nghị
1. Hoàn thiện quy trình điện di để đọc được kết quả phản ứng cắt một cách chính
xác hơn.
2. Tiếp tục phân tích ITS-RFLP với nhiều enzyme cắt hạn chế hơn và trên nhiều
dòng nấm hơn để có thể đánh giá được chính xác hơn sự đa dạng di truyền của các
dòng nấm R. solani ở nước ta.
3. Nghiên cứu đọc trình tự vùng rDNA-ITS của 9 dòng nấm R. solani đã được sử
dụng trong đề tài để xác định chính xác kiểu gen có thể có của các dòng nấm này.

34
Phần VI
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
1. Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999. Di truyền phân tử: Những nguyên
tắc cơ bản trong chọn giống cây trồng. NXB Nông Nghiệp, Tp. Hồ Chí Minh,
Việt Nam.

2. Đƣờng Hồng Dật, 1976. Sổ tay bệnh hại cây trồng tập 1. NXB Nông Thôn,
Việt Nam.

3. Nguyễn Thị Huệ, 2003. Khảo sát một số đặc tính và đánh giá sự đa dạng của
các mẫu phân lập Rhizoctonia solani thu thập từ một số cây kí chủ khác nhau.
Luận văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp.Hồ Chí Minh,
Việt nam.

4. Nguyễn Thị Hƣơng, 2005. Một số đặc tính của các dòng nấm Rhizoctonia
solani phân lập từ nhiều cây kí chủ khác nhau. Luận văn tốt nghiệp ngành
Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp.Hồ Chí Minh, Việt Nam.

5. Nguyễn Việt Long, 2001.Hiệu quả phòng trừ bệnh đốm vằn trên lúa của hai
chủng vi khuẩn đối kháng với nấm Rhizoctonia solani trên ruộng lúa nước ở
Đồng Tháp. Luận văn thạc sĩ ngành Nông Học, Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ
Chí Minh, Việt Nam.

6. Nguyễn Đức Lƣợng, 2001, Công nghệ sinh học, NXB Đại học Quốc Gia, Tp.
Hồ Chí Minh, Việt Nam.

7. Nguyễn Đức Lƣợng và ctv., 2002. Công nghệ gen. NXB Đại học Quốc Gia,
Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.

8. Vũ Triệu Mân và Lê Lƣơng Tề, 1998. Giáo trình bệnh cây nông nghiệp,
NXB Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam.

9. Nguyễn Minh Nguyệt, 2003. Khảo sát một số đặc tính của nấm Rhizoctonia
solani phân lập từ cây bông (Gossypium sp.) và cây bắp (Zea may L.). Luận
văn tốt nghiệp ngành Nông Học. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ Chí Minh, Việt

Nam.

10. Ou S. H., 1983. Bệnh hại lúa (Viện Bảo Vệ Thực Vật dịch). Nhà xuất bản
Nông Nghiệp, Hà Nội, Việt Nam.

11. Phạm Minh Sang, 2003. Hiệu lực của chế phẩm vi khuẩn đối kháng và kích
thích sinh trưởng trong phòng trừ bệnh khô vằn (Rhizoctonia solani Kuhn)

35
trên lúa. Luận văn thạc sỹ khoa học nông nghiệp. Đại học Nông Lâm, Tp. Hồ
Chí Minh, Việt Nam.

12. Khuất Hữu Thanh, 2003. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen. NXB Khoa
Học và Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam.

13. Lê Duy Thành, 2000. Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa Học và
Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam.
Tiếng Anh:
14. Carling D.E. and Sumner D.R., 1992. Rhizoctonia pp 157-165. In: Singlton
L., Mihail J.D. and Rush C.M. (eds), Methods for research on soilborne
phyto-pathologenic fungi. APS Press, St. Paul, Minnesota.

15. Fenille R. C., Ciampi M. B., Kuramae E. E., and Souza N. L., 2003.
Identification of Rhizoctonia solani associated with soybean in Brazil by
rDNA-ITS sequences. Fitopatol. bras. vol 28.

16. Hsiang T. and Dean J. D., 2001. DNA sequencing for anastomosis grouping
of Rhizoctonia solani isolates from Poa annua. International turfgrass society
9: 674-678.

17. Kunigana S., Natsuaki T., Takeuchi T., and Yokosawa R., 1997. Sequence
variation of the rDNA ITS regions within and between anastomosis groups in
Rhizoctonia solani. Curr Genet 32: 237 – 243.

18. Lee S.B., and Taylor J.W., 1990. Isolation of DNA from fungal mycelia and
single spores, In: Weising K., Nybom H., Wolff K., and Meyer W., 1995,
DNA fingerprinting in plants and fungi. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor,
London, Tokyo.p. 70-71.

19. Liu, Z. L. và Sinclair, J. B., 1992. Genetic Diversity of Rhizoctonia solani
anastomosis group 2. Phytopathology 82: 778 – 787.

20. Liu, Z. L. và Sinclair, J. B., 1993.Differentiation of intraspecific groups within
anastomosis group 1 of Rhizoctonia solani using ribosomal DNA internal
transcribed spacer and isozymecomparisions. Can. J. Plant Phathol 15: 272 –
280.

21. Matsumoto M., Furuya N., Takanami Y. and Matsuyama N., 1996. RFLP
analysis of the PCR-amplified 28S rDNA in Rhizoctonia solani. Mycoscience
37: 351 – 356.

22. Meinhardt L. W., Wulff N. A., Bellato C. M., and Tsai S. M., 2002. Genetic
analyses of Rhizoctonia solani isolates from Phaseolus vulgaris grown in the
Atlantic Rainforest of Sao Paulo, Brazil. Fitopalogia Brasileira 27: 259 – 267.


36

23. Priyatmojo A., Escopalao V. E., Tangonan N. G., Pascual C. B., Suga H.,
Kageyama K. and Hyakumachi M., 2001. Characterization of a new

subgroup of Rhizoctonia solani Anastomosis Group 1 (AG-1-ID), Causal
agent of a necrotic leaf spot on coffee. Phytopathology 91:1054-1061.

24. Reader U., and Broda, 1985. Rapid preparation of DNA from filamentous
fungi. Letter in Applied Microbiology 1: 17-20.

25. Schneider J. H. M., Salazar O., Rubio V., and Keijer, 1997. Identification of
Rhizoctonia solani associated with field-grown tulips using ITS rDNA
polymormphism and pectic zymograms. Plant Pathology 103: 607 – 622.

26. Sharma S., Rustgi S., Balyan H. S., and Gupta P. K., (unknown year).
Internal transcribed spacer (ITS) sequences of ribosomal DNA of wild barley
and their comparsion with ITS sequences in common wheat. Molecular
Biology Laboratory, Department of Agricultural Botany Ch. Sharan
University, Meerut-250 004, India.

27. White, T.J., Bruns, T., Lee, S., and Taylor, J., 1999. Amplification anhd
direct sequencing of fungal ribosome ARN genes for phylogenetics. P 315 -
322. In: Innis M. A., Gelfanhd D. H., White J. J. (eds) PCR protocols, a guide
to methods and applications. Academic Press, New York.

Web