nghiên cứu phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú



1
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***



HOÀNG HẢI YẾN




NGHIấN CỨU PHÁT HIỆN GEN SURVIVIN
TỪ CÁC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ



Chuyờn ngành : Húa sinh
Mó số :
60.72.04


LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC




Hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Phạm Thiện Ngọc

PGS.TS. Lờ Quang Huấn

HÀ NỘI - 2011


2
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
***



HOÀNG HẢI YẾN




NGHIấN CỨU PHÁT HIỆN GEN SURVIVIN
TỪ CÁC TẾ BÀO UNG THƯ VÚ



Chuyờn ngành : Hỳa sinh
Mú số :
60.72.04


LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC

Hướng dẫn khoa học:
PGS.TS. Phạm Thiện Ngọc
PGS.TS. Lê Quang Huấn





HÀ NỘI - 2011



3

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và làm luận văn, tôi đã nhận được sự quan tâm
giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, nhà trường, bệnh viện, gia đình và bè bạn.
Với tất cả sự kính trọng, tôi xin trân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc
tới PGS.TS. Phạm Thiện Ngọc - Chủ nhiệm bộ môn Hóa sinh - Trường Đại
học Y Hà Nội. Thầy là người đã truyền đạt cho tôi những kiến thức, phương
pháp và tác phong làm việc nghiêm túc, người đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ
và động viên tôi trong suốt quá trình học tập . Thầy đã xây dựng ý tưởng,
cung cấp kinh phí từ đề tài cấp Bộ y tế, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong
quá trình hoàn thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Lê Quang Huấn - Trưởng
phòng Công nghệ tế bào động vật - Viện Công nghệ sinh học thuộc Viện Khoa
học và Công ngh

ệ Việt Nam, là người hướng dẫn khoa học, người Thầy đã tận
tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và những kinh nghiệm quý báu, tạo mọi điều
thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này.
Tôi xin chân thành cảm ơn các Thầy cô trong Hội đồng đánh giá đề
cương và Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp đã góp ý cho tôi nhiều ý kiến quý
báu
để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:
Ban giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại học, Thầy Cô bộ môn hóa sinh -
trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi những kiến thức quý báu, tạo điều kiện
thuận lợi để tôi có thể hoàn thành luận văn này.
Ban giám đốc Bệnh viện Phụ Sản Hà Nội, khoa Xét nghiệm Bệnh viện
Phụ Sản Hà Nội đã t
ạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và
hoàn thành luận văn.


4
Ban giám đốc, khoa ngoại vú, khoa giải phẫu bệnh, phòng mổ bệnh
viện K trung ương đã tạo mọi điều kiện tốt nhất để tôi thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cám ơn tới tất cả các bạn phòng Công nghệ tế bào động
vật, Viện Công nghệ sinh học đã hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
trong quá trình thực hiện nghiên cứu.
Xin bày t
ỏ lòng biết ơn đối với bố mẹ và những người thân trong gia
đình, bạn bè đồng nghiệp là chỗ dựa vững chắc của tôi, luôn thương yêu,
khuyến khích, động viên và tạo điều kiện tốt nhất về tinh thần giúp tôi hoàn
thành tốt chương trình học tập và thực hiện thành công luận văn này.
Cuối cùng tôi xin gửi lời tri ân tới những bênh nhân đã tham gia vào
nhóm nghiên cứu, sự đóng góp của các chị đ

ã giúp tôi có thành công này.

Hà Nội, 24 tháng 12 năm 2011

Hoàng Hải Yến












5





LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số
liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là hoàn toàn trung thực và chưa từng
được ai công bố trong bất cứ một công trình nào khác.
Hà Nội, 24 tháng 12 năm 2011

Tác giả
Hoàng Hải Yến

















6





DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DNA : Dideoxyribonucleic acid
RNA : Ribonucleic ac

UTV : Ung thư vú
UT : Ung thư
UTBM : Ung thư biểu mô
PCR : Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng tổng hợp chuỗi)
RT- PCR : Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng tổng hợp chuỗi phiên mã ngược)
bp : Base pair
dNTP : Deoxynucleoside triphosphate
ddNTP : Dideoxynucleotide triphosphate
Kb : Kilobase
mRNA : messenger RNA (RNA thông tin)
TNM : Tumor Nude Metastasis
TLPT : Trọng lượng phân tử
TAE : Tris - acid acetic - EDTA
GAPDH : Glyceraldehyde - 3 Phosphat Dehydrogenase
MMLV-RT : Moloney Murine Leukemia Virus-Reverse
Trancriptase (Enzym phiên mã ngược)
CTC : Circulating Tumor Cell
IAP : Inhibitor of apoptosis
protein


7
(Chất ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào)
ATCC : American Type Culture Colection
FBS : Fetal Bovine Serum
P/S : Penicillin/Streptomycin
DMEM : Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO : Dimethyl Sulfoxide

PBS : Phosphate Buffer Saline


ĐẶT VẤN ĐỀ

Ung thư vú (UTV) là loại ung thư (UT) phổ biến ở phụ nữ nhiều nước
trên thế giới, đặc biệt là các nước đang phát triển. UTV chiếm gần 30% các
loại UT ở phụ nữ, là ung thư có tỉ lệ tử vong cao thứ 2 trong số các loại ung
thư. Theo hiệp hội nghiên cứu ung thư thế giới, năm 2008, trên toàn thế giới
có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mớ
i được chẩn đoán và
458.503 ca tử vong [49]. Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc UTV ở Hà Nội là khoảng
30/100.000 dân và ở TP Hồ Chí Minh là khoảng 20/100.000 dân, đứng đầu
trong các loại UT ở phụ nữ [13].
Mặc dù đã có nhiều tiến bộ trong tầm soát, phẫu thuật và các thuốc
điều trị ngày càng có hiệu quả nhưng vẫn còn nhiều trường hợp bệnh nhân
UTV nguyên phát ở giai đoạn sớm vẫn bị tái phát bệ
nh hoặc tử vong. Các
phương pháp cận lâm sàng được áp dụng trong chẩn đoán UT như các
phương pháp chẩn đoán hình ảnh, các phương pháp sinh thiết và các phương
pháp hóa sinh phát hiện các dấu ấn ung thư (tumor marker). Mỗi loại phương
pháp chẩn đoán trên đều có những ưu điểm và hạn chế, do vậy thường phải
kết hợp các phương pháp chẩn đoán khác nhau mới đem lại hiệu quả chẩn
đoán chính xác và sớ
m UTV. Trong những năm gần đây, cùng với sự phát
triển mạnh mẽ của sinh học phân tử, nhiều phương pháp mới giúp cho việc


8
chẩn đoán và phát hiện sớm một số loại UT nói chung và UTV nói riêng đã

được ứng dụng. Nguyên tắc chung của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật
phân tích DNA xác định các đột biến gen liên quan tới UT. Việc phát hiện các
đột biến gen UT lấy từ các mô UT, hạch bạch huyết hoặc tủy xương chỉ có thể
thực hiện khi sinh thiết hoặc sau phẫu thuật do vậy nhược điểm là phát hiện
muộn khi kh
ối u đã lớn. Vì vậy, việc chẩn đoán UT thường ít còn ý nghĩa và
không giúp cho việc điều trị có hiệu quả cũng như việc theo dõi điều trị. Do
vậy, các nghiên cứu phát hiện các chỉ thị UT trong máu nhằm phát hiện di căn
tiềm ẩn từ giai đoạn sớm của bệnh nhân ung thư là cần thiết. Các tế bào UT
có nguồn gốc từ các tế bào khối u nguyên phát hoặc các khối u đ
ã di căn,
thâm nhập và di chuyển trong máu ngoại vi gọi là các tế bào khối u di chuyển
(Circulating Tumor Cell - CTC). Các CTC là bằng chứng về sự di căn của các
tế bào UT trước khi có các biểu hiện lâm sàng [22]. Vì vậy, việc sử dụng chỉ
thị khối u để xác định các tế bào khối u trong máu đóng vai trò quan trọng, có
thể góp phần xác định sớm các trường hợp di căn, giúp cho việc chẩn đoán và
điều trị có hiệu quả. Một số
gen chỉ thị khối u đã được phát hiện và nghiên
cứu trong đó có gen mã hóa survivin. Gen survivin mã hóa một protein ức chế
quá trình chết theo chương trình của tế bào (apoptosis). Gen này được biểu
hiện mạnh trong các mô của bào thai đang phát triển và trong nhiều loại ung
thư, trong đó có UTV, nhưng điều đặc biệt có ý nghĩa là gen survivin không
biểu hiện ở các mô bình thường [11]. Do vậy, việc phát hiện gen survivin
trong máu có thể góp phần chẩn đoán, tiên l
ượng và theo dõi điều trị bệnh
nhân UTV [18], [38], [50]. Đặc biệt khi kết hợp với các gen khác như
survivin, hTERT và hMAM [41]. Vì vậy, để góp phần nghiên cứu xây dựng
các phương pháp mới xác định các tế bào UT trong máu chẩn đoán UTV ở
phụ nữ, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu phát hiện gen survivin
từ các tế bào ung thư vú” với 2 mục tiêu:



9
1. Xây dựng quy trình phát hiện gen survivin từ các tế bào ung thư vú.
2. Đánh giá khả năng ứng dụng xét nghiệm gen survivin trong chẩn
đoán ung thư vú.



Chương 1
TỔNG QUAN

Bnh ung th vú
1.1.1. Khái niệm bệnh
Ung thư là từ dùng để chỉ u bướu ác tính do sự phát triển và biệt hóa
của các tế bào ở các mô của cơ thể trong tình trạng không kiểm soát được.
Ung thư vú là u ác tính phát sinh từ các tế bào biểu mô nguồn gốc từ mô vú,
phần lớn từ các ống dẫn sữa hoặc các tiểu thuỳ. UT có nguồn gốc từ ống sữa
được gọi là ung thư biểu mô tuyến sữa và UT có nguồn gốc t
ừ tiểu thuỳ được
gọi là ung thư biểu mô tiểu thuỳ. Có nhiều dạng UTV khác nhau với trạng
thái khác nhau, sự ác tính khác nhau, bản chất di truyền khác nhau và tỷ lệ
sống sót khác nhau phụ thuộc vào các yếu tố này.
1.1.2. Dịch tễ học UTV
Tình hình ung thư vú trên thế giới
Ung thư vú không những là một bệnh ung thư hay gặp nhất ở phụ nữ
mà còn là nguyên nhân chính gây tử vong đối với phụ nữ tại nhiề
u nước.
Nguy cơ mắc bệnh UTV theo suốt cuộc đời người phụ nữ. Tỷ lệ mắc thay đổi



10
nhiều, từ 25-35/100.000 dân tại Anh, Đan Mạch, Hà Lan và Canada đến 1-
5/100.000 dân tại Nhật Bản, Mexico, Venezuela [2].
Bệnh có tỷ lệ mắc cao nhất ở Mỹ và Bắc Âu, tỷ lệ mắc trung bình ở
Nam Âu, Tây Âu và thấp nhất ở châu Á. Người ta nhận thấy tỷ lệ mắc UTV
tăng gấp 2 lần so với những năm 50 thế kỷ XX ở một số nước có nền công
nghiệp phát triển mạnh trong các năm qua nh
ư Nhật Bản, Singapore, một số
thành phố của Trung Quốc Sự gia tăng nhanh chóng tỷ lệ mắc ở các vùng
này phần nào được giải thích do sự thay đổi về lối sống, kinh tế phát triển,
ngày càng có nhiều phụ nữ làm việc trong lĩnh vực công nghiệp, tuổi thọ
trung bình tăng, thay đổi về sinh sản, chế độ ăn Theo hiệp hội nghiên cứu
ung thư thế giới, năm2008, trên toàn thế gi
ới có khoảng 1,3 triệu phụ nữ mắc
bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và 458.503 ca tử vong [49]. Ở Mỹ, năm
2010, hơn 207.000 phụ nữ mắc bệnh ung thư vú mới được chẩn đoán và ước
tính có tới 39.800 ca tử vong [16]. Tỷ lệ UTV tăng theo tuổi, hiếm gặp ở lứa
tuổi 30 (khoảng 0,8%), sau độ tuổi này, tỷ lệ mắc bệnh gia tăng một cách
nhanh chóng (khoảng 6,5%
ở tuổi 30-40). Theo thống kê của hiệp hội phòng
chống UT Mỹ, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi tăng từ 25/100.000 dân ở độ tuổi 30-
34 lên đến 200/100.000 dân ở độ tuổi từ 45-49. Tuy nhiên người ta nhận thấy
rằng nguy cơ mắc bệnh này tăng chậm ở độ tuổi từ 45-50. Điều này gợi ý
rằng UTV là loại UT có liên quan mật thiết với nội tiết. Tỷ lệ chế
t do UTV
tăng lên theo tỷ lệ mắc [2]. Tuy nhiên, ở một số nước phát triển mặc dù tỷ lệ
mắc UTV gia tăng nhanh chóng nhưng tỷ lệ chết vẫn giữ được ở mức ổn định
nhờ các tiến bộ trong sàng lọc phát hiện bệnh sớm và những thành tựu đạt
được trong điều trị.

Tình hình ung thư vú tại Việt Nam


11
Tại Việt Nam, theo ghi nhận tình hình UT ở Hà Nội, TP Hồ Chí Minh
và một số tỉnh trong nhiều năm, người ta ước tính tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo
tuổi năm 2000 là 17,4/100.000 dân. Khác với các nước phương tây, ở Việt
Nam UTV bắt đầu tăng nhanh ở độ tuổi 35 và đạt tỷ lệ cao nhất ở độ tuổi
trước và sau mãn kinh (45-54 tuổi) rồi sau đó có xu hướng giảm xuống rõ rệt.
Tại Việt Nam giai
đoạn 2001-2004, tỷ lệ mắc UTV chuẩn theo tuổi ở
Hà Nội là 29,7/100.000 dân, tại TP Hồ Chí Minh và Cần Thơ là 19,4/100.000
dân, ở Hải phòng là 10,5/100.000 dân, ở Thái Nguyên là 11,6/100.000 dân, ở Huế
là 12,2/100.000 dân. Đây là loại UT có tỷ lệ mắc đứng đầu ở phụ nữ Việt Nam.
Tóm lại, UTV là bệnh phổ biến nhất trong tất cả các loại ung thư ở phụ
nữ trên thế giới cũng như ở Việ
t Nam.
1.1.3.Tiến triển và các giai đoạn ung thư vú.
1.1.3.1. Tiến triển ung thư vú.
Biểu hiện lâm sàng của UTV có đặc trưng là kéo dài và rất khác nhau
giữa các bệnh nhân. Đa số các trường hợp UTV xâm lấn phát sinh từ tế bào
biểu mô của thùy hoặc của ống dẫn của tuyến vú. Các tế bào bị UT hóa nhân
lên với tốc độ khoảng 60 ngày một chu kỳ. Ước tính, từ khi tế bào chuyển
biến ác tính đầu tiên đến khi phát hiệ
n được khối u có kích thước 1cm thì phải
mất khoảng thời gian vài năm. Chỉ một số ít bệnh nhân (< 3%) ngay sau khi
xuất hiện các triệu chứng đầu tiên, UTV tiến triển nhanh và tử vong trong vài
tháng [1]. UTV có khả năng chữa khỏi ở nhiều bệnh nhân nếu bệnh được
chẩn đoán trong giai đoạn tiền lâm sàng (chưa có triệu chứng hay dấu hiệu
lâm sàng).

Green Wood, Bloom và cộng sự theo dõi những trường hợp UTV
không điề
u trị, thấy thời gian sống thêm trung bình kể từ khi chẩn đoán là 31


12
tháng, tỷ lệ sống thêm 3 năm là 40% và 5 năm là 18 - 20%, có 4% sống thêm 10
năm [2].
Giai đoạn tại chỗ:
Khối u nguyên phát xuất phát từ đơn vị tiểu thùy - ống tuyến tận cùng,
tức phần chế tiết của tuyến vú. Sau đó phát triển lan sang mô lân cận, xô đẩy
tổ chức tuyến vú bình thường. Xu hướng vượt khỏi mô tuyến vú xâm nhiễm
mô xung quanh đến các cấu trúc lân cận như da, làm co rút da, sần da cam,
phù nề da, đỏ và loét da. Khi chúng xâm nhi
ễm đến cân cơ ngực và thành
ngực tạo thành một khối cứng.

Giai đoạn lan tràn:
+ Theo đường bạch huyết: Nhờ mạng lưới mạch bạch huyết dày đặc,
UTV lan tới các chặng hạch trong đó hạch nách là vị trí hay gặp do đây là vị
trí chính dẫn lưu dịch, bạch huyết của vú. Tiếp theo là hạch thượng đòn, rồi đi
vào hệ tuần hoàn tĩnh mạch c
ạnh sống, đám rối này được nối trực tiếp với vú
qua mạch máu liên sườn.
+ Theo đường máu: Các tế bào UTV có thể di căn đến khắp nơi trong
cơ thể, tuy nhiên UTV thường di căn tới xương, phổi, gan, não. Khoảng 20 -
30% các bệnh nhân hạch bạch huyết âm tính nhưng vẫn có di căn xa chứng tỏ
di căn theo đường máu là chủ yếu ở các bệnh nhân này [39]. Đôi khi sự lan
tràn xảy ra thêm từ hệ tĩnh m
ạch ở vú, tiêu biểu từ hệ hạch bạch huyết của da

dẫn đến lan rộng, xâm lấn thành ngực và sau đó đến màng phổi và phổi. Các
tế bào UTV thường di căn rất sớm và tại thời điểm chẩn đoán được bệnh
không thể phát hiện được các di căn này bằng các phương pháp chẩn đoán
hiện có, do vậy việc nghiên cứu phát hiện các tế bào UTV thực sự là cần thiế
t
có thể góp phần chẩn đoán sớm UTV.


13
1.1.3.2. Các giai đoạn của ung thư vú.
* Hệ thống xếp giai đoạn TNM
Dưới đây là hệ thống xếp giai đoạn (2004) của ủy ban Liên kết chống
Ung thư của Mỹ (AJCC) [42]. Hiện nay, hầu hết các nghiên cứu trong đó có
các nghiên cứu đa quốc gia áp dụng hệ thống xếp giai đoạn này.
T: U nguyên phát
T
0
Không có u nguyên phát
Tis (UTBM tại chỗ): UTBM nội ống, UTBM thùy tại
chỗ, bệnh Paget núm vú không có u.
T
1
U có đường kính lớn nhất ≤ 2cm
T
2
U có đường kính lớn nhất > 2cm và ≤ 5cm
T
3
U có đường kính lớn nhất > 5cm
T

4
U xâm lấn thành ngực hoặc da bất kể kích thước
(thành ngực gồm xương sườn, cơ gian sườn, cơ răng
cưa trước, không tính cơ ngực)
N: Hạch vùng
N
0
Không di căn hạch vùng
N
1
Di căn hạch nách cùng bên di động
N
2
Di căn hạch nách cùng bên cố định hoặc dính nhau
hoặc di căn hạch vú trong cùng bên nhưng không di
căn hạch nách.
N
3
Di căn hạch hạ đòn cùng bên có hoặc không kèm
hạch nách cùng bên, hoặc di căn hạch vú trong cùng
bên kèm di căn hạch nách cùng bên, hoặc di căn
hạch thượng đòn cùng bên có hoặc không kèm hạch
nách hoặc hạch vú trong cùng bên.


14
M: Di căn xa
M
0
Không di căn xa

M
1
Có di căn xa
Phân loại có những điểm mới: di căn hạch hạ đòn xếp vào N
3
(trước
không đề cập), di căn hạch thượng đòn không xếp M
1
nữa mà thành N
3
. Di
căn hạch vú trong trước đây xếp vào N
3
, nay phân ra không kèm di căn hạch
nách (N
2b
) và kèm di căn hạch nách (N
3b
)

* Xếp giai đoạn lâm sàng
Bảng 1.1. Phân chia giai đoạn UTV
Giai đoạn TNM tương ứng
0 Tis N
0
M
0
I T
1
N

0
M
0
IIA
T
0
N
1
M
0
T
1
N
1
M
0
T
2
N
0
M
0
IIB
T
2
N
1
M
0
T

3
N
0
M
0
IIIA
T
0
N
2
M
0
T
1
N
2
M
0
T
2
N
2
M
0
T
3
N
1
M
0

T
3
N
2
M
0
IIIB T
4
N
0
M
0


15
T
4
N
1
M
0
T
4
N
2
M
0
IIIC T bất kỳ, N
3
, M

0
IV T bất kỳ, N bất kỳ, M
1

1.1.4. Chẩn đoán ung thư vú
1.1.4.1. Chẩn đoán xác định
Chẩn đoán xác định UTV nhất thiết phải có sự khẳng định của giải
phẫu bệnh học. Giải phẫu bệnh được coi như “một tiêu chuẩn vàng” trong
chẩn đoán ung thư vú. Hiện tại Bệnh viện K, UTV được chẩn đoán xác định
dựa vào 3 phương pháp:
+ Lâm sàng: khối u và tính chất khối u.
+ Chụp tuyến vú.
+ Mô bệnh h
ọc: chọc hút bằng kim nhỏ.
Nếu một trong 3 yếu tố này còn nghi ngờ phải sinh thiết tức thì để chẩn
đoán xác định. Ngoài 3 phương pháp thông dụng trên còn một số phương
pháp khác như: sinh thiết kim, sinh thiết mở, sinh thiết 48 giờ, chụp vú kỹ
thuật số, siêu âm vú, chụp cộng hưởng từ hạt nhân được áp dụng cho từng
trường hợp. Hiện nay, do nhiều lý do mà chẩn đoán UTV bằng kỹ thuật sinh
h
ọc phân tử chưa được ứng dụng rộng rãi, mặc dù kỹ thuật này thường cho
kết quả chẩn đoán chính xác và độ tin cậy cao. Chính vì vậy, chúng tôi tiến
hành đề tài này nhằm nghiên cứu khả năng ứng dụng kỹ thuật sinh học phân
tử góp phần vào việc phát hiện, chẩn đoán UTV ở phụ nữ.
1.1.4.2. Chẩn đoán mô bệnh học
Carcinom chiểm khoảng 90% trong đó:
- Carcinom ống tuyế
n xâm nhập : 78%



16
- Carcinom tiểu thùy : 9%
- Carcinomdạng tủy : 1,5%
- Carcinom dạng kéo : 1,5%
- Sarcom, paget không xếp loại, nhưng bệnh paget có khối u được
phân loại theo kích thước của u.
1.1.5. Các yếu tố tiên lượng bệnh UTV
Các quyết định trong điều trị bổ trợ UTV được dựa vào các yếu tố tiên
lượng. Bên cạnh việc đánh giá các yếu tố tiên lượng kinh điển như kích thước
u, loại mô học, độ
mô học, tình trạng hạch nách, các nhà nghiên cứu đang có
xu hướng đi sâu về bệnh học phân tử và gen để tìm ra bản chất phát triển của
khối u nhằm đưa ra một phương thức điều trị tối ưu nhất cho bệnh nhân.
1.1.5.1. Hạch vùng
Hạch nách: Tình trạng hạch nách được coi là yếu tố tiên lượng quan
trọng nhất liên quan đến tỷ lệ tái phát và sống thêm của bệnh nhân UTV. Tỷ
l
ệ sống thêm, tái phát, thời gian tái phát, thất bại trong điều trị đều liên quan
chặt chẽ với số lượng hạch di căn [6].
1.1.5.2. Khối u nguyên phát
Kích thước u nguyên phát: Kích thước u nguyên phát có mối liên quan với
thời gian sống thêm của bệnh nhân và tình trạng di căn hạch vùng. Kích thước u
tăng làm tăng hệ thống huyết quản và bạch mạch làm tăng nguy cơ di căn.
1.1.5.3. Vị trí u
Vị trí u là một trong những yếu tố liên quan đế
n tiên lượng của UTV và
mức độ di căn hạch nách.
1.1.5.4. Giai đoạn bệnh
Giai đoạn bệnh có thể đánh giá trước và sau mổ. Giai đoạn trước mổ
còn gọi là giai đoạn lâm sàng được đánh giá dựa trên kích thước u, sự di



17
động, thâm nhiễm da, tình trạng hạch và những bằng chứng về di căn. Giai
đoạn lâm sàng giúp lập kế hoạch điều trị bước đầu. Giai đoạn sau phẫu thuật
còn gọi là giai đoạn giải phẫu bệnh. Giai đoạn bệnh càng cao thì tiên lượng
bệnh càng xấu [3], [6], [13].
1.1.5.5. Loại mô học
Hai thể mô học chính của UTBM tuyến vú là loại xâm lấn và loại
không xâm lấn. Trong hai loại này UTBM thể không xâm l
ấn có tiên lượng
tốt hơn.
Ung thư biểu mô tại chỗ bao gồm cả ung thư ống và tiểu thuỳ tại chỗ là
loại có thể chữa khỏi hoàn toàn, và chỉ có 1% là di căn căn hạch nách. Theo
báo cáo của Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ, loại này chiếm khoảng 6,3%
tổng số bệnh nhân UTV.
Ung thư biểu mô thể ống xâm nhập chiếm tỷ lệ cao nhất là 67,9%, tỷ lệ
sống thêm chung sau 5 n
ăm ở nhóm này là 79%. Ung thư biểu mô thể tiểu thuỳ
xâm nhập chiếm khoảng 6,3%, tỷ lệ sống thêm chung sau 5 năm là 82% [6], [7].
1.1.5.6. Độ mô học (ĐMH)
Độ mô học là một yếu tố tiên lượng quan trọng mặc dù nó không sử
dụng để đánh giá giai đoạn bệnh. Độ mô học dựa vào sự hình thành ống nhỏ,
sự đa hình thái của nhân và hoạt động nhân chia.
1.1.5.7. Tỷ lệ sống theo giai đo
ạn
Bảng 1.2. Tỷ lệ sống thêm theo giai đoạn
Giai đoạn Tỷ lệ sống 5 năm (%) Tỷ lệ sống 10 năm (%)
0 100 100
I 87 78

II 68 52
III 41 28


18
IV 10 0

1.1.6. Điều trị ung thư vú
Cho tới nay, việc nghiên cứu điều trị UTV vẫn đang được tiếp tục và
ngày càng hoàn thiện. Điều trị UTV là sự phối hợp điển hình giữa phương
pháp điều trị tại chỗ (phẫu thuật, tia xạ) và điều trị toàn thân (hoá chất, nội tiết
miễn dịch).
Trên thực tế lâm sàng, trước khi quyết đị
nh áp dụng phương pháp điều
trị các thầy thuốc căn cứ vào nhiều yếu tố bao gồm giai đoạn bệnh, thể mô
học, độ mô học, tuổi và một số yếu tố khác. Giai đoạn bệnh là yếu tố chính
quyết định việc lựa chọn phương pháp điều trị [13].
1.1.7. Các dấu ấn sinh học trong chẩn đoán và theo dõi điều trị UTV.
D
ấu ấn sinh học là một nhóm các chất (enzym, hormon, receptor,
protein,…v.v) được các tế bào khối u trực tiếp sản xuất hoặc do các tế bào
bình thường sản xuất do tác động kích ứng của các tế bào ung thư đi vào vòng
tuần hoàn và có thể được sử dụng để chẩn đoán và theo dõi điều trị ung thư.
Các dấu ấn huyết thanh gồm CEA, CA15-3 và CK-BB. Các mô có thể được
phân tích đối với các receptor estrogen và progesteron, receptor của yếu tố
sinh trưởng bi
ểu mô (Epidermal Growth Factor- EGF). Sự lựa chọn cách điều
trị phụ thuộc vào các định lượng trên.
1.1.7.1. Dấu ấn là protein.
Nhiều protein huyết thanh do tế bào UT sản xuất ra lưu thông trong

máu đã được sử dụng như dấu ấn UT. Dấu ấn là protein thường đặc hiệu hơn
dấu ấn là enzym, hormon và dễ phát hiện hơn so với các dấu ấn khác vì vậy
được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên để chẩ
n đoán xác định cần phải phối
hợp với lâm sàng và các xét nghiệm khác nữa.


19
- CEA (Carcino Embryonic Antigen) được Gold và Freedman mô tả lần
đầu tiên vào năm 1965, là kháng nguyên ung thư bào thai có bản chất là
glycoprotein. CEA được sản xuất trong thời kỳ bào thai đặc biệt ở dạ dày, tụy
và gan. Sau khi sinh chỉ tồn tại với hàm lượng rất trong huyết thanh của người
bình thường và tăng cao trong một số loại ung thư. CEA được coi là dấu ấn
đặc hiệu cho ung thư đại tràng, tuy nhiên CEA còn thấy tăng trong ung thư
vú, đường tiêu hoá, phổi, buồng trứ
ng, tụy và tuyến tiền liệt. Hơn nữa, nó
cũng tăng lên ở người nghiện rượu, viêm ruột, xơ hoá bàng quang (cystic
fibrosis) và ở những người hút thuốc lá nặng. Mặc dù CEA không đặc hiệu
cho chẩn đoán, nhưng có giá trị tiên lượng và theo dõi điều trị. Nồng độ CEA
cao sau điều trị là cơ sở nghĩ đến sự tiến triển của khối u hay di căn.
- CA15-3 (Carbohydrat Antigen) bản chấ
t là một glycoprotein không
đặc hiệu nhưng nhạy cảm đối với UTV. Bình thường có trong huyết thanh
người với nồng độ < 25 U/ml, CA15-3 tăng trong 10% phụ nữ mắc bệnh UTV
và tăng trong 70% những người mắc UTV di căn. Do vậy CA 15-3 thường
được sử dụng để sàng lọc, theo dõi điều trị và phát hiện tái phát UTV sau giai
đoạn điều trị.
1.1.7.2. Dấu ấn là các enzym.
Các xét nghiệm về enzym huyết thanh để chẩn đoán UT th
ường có độ

đặc hiệu kém do vậy hiện nay rất ít được sử dụng trong chẩn đoán. Enzym
CK-BB là enzym được sử dụng trong chẩn đoán UTV. Tuy nhiên để chẩn
đoán xác định cần phải phối hợp với lâm sàng và các xét nghiệm khác nữa.
- Creatine kinase: Isoenzym creatine kinase BB (CK1, CK-BB) có
trong huyết thanh có nguồn gốc từ não và liên quan đến nhiều bệnh ung thư
ác tính. CK-BB trong huyết thanh tăng ở một số bệnh UT ác tính như: UTV,


20
UT buồng trứng, UT não, UT phổi, Isoenzym CK-BB được phát hiện và
định lượng nhờ điện di. Tuy nhiên CK-BB trong huyết thanh không đặc hiệu.
1.1.7.3. Dấu ấn là các receptor.
Rất nhiều khối u ác tính gây những biến đổi về chức năng và số lượng
receptor nên các receptor có thể được sử dụng như dấu ấn UT. Các dấu ấn là
receptor thường được sử dụng trong chẩn đoán và theo dõi điều trị như các
receptor estrogen và progesteron, receptor của yếu t
ố sinh trưởng biểu mô
(Epidermal Growth Factor- EGF). Có hai phương pháp cơ bản để định lượng
receptor của tế bào: Định lượng trên mẫu mô sinh thiết hoặc tổ chức u sau khi
phẫu thuật cắt bỏ.
- Thụ thể estrogen và progesteron (ER và PR): ER và PR đã được
nghiên cứu rộng rãi khoảng 10 năm trở lại đây. Các ER và PR được định
lượng trong lâm sàng để xác định các bệnh nhân bị UTV có thể đáp ứng với
phương pháp đ
iều trị bằng hormon. Có khoảng 50 - 85% các khối u nguyên
phát và 45 - 55% các u di căn có ER dương tính. Có nhiều nghiên cứu cho
thấy giảm tỷ lệ tử vong và tái phát từ 20% - 30% ở những BN có ER (+) được
điều trị nội tiết bổ trợ. Khi cả ER và PR (+) khoảng 80% trường hợp u sẽ đáp ứng
với phương pháp điều trị nội tiết. Những u càng biệt hoá cao thì tỷ lệ dương tính
với ER và PR cao. Những ung thư biểu mô d

ương tính với ER và PR có tiên
lượng tốt hơn so với những u âm tính với hai thụ thể này [3], [6], [24].
- Thụ thể yếu tố sinh trưởng biểu mô (Epidermal Growth Factor
receptor- EGFR): là thụ thể của các yếu tố sinh trưởng biểu mô (EFG) và yếu
tố biến đổi sinh trưởng tế bào α (Transforming Growth Factor α TGF-α). Họ
thụ thể của các yếu tố sinh trưởng gồm các thụ thể: EGFR (ErbB-1), HER2/c-
neu (ErbB-2), HER3/c-neu (ErbB-3), HER4/c-neu (ErbB-4). Nồng độ cao của
thụ
thể có liên quan đến sự tái phát khối u và sự sống sót của bệnh nhân UTV


21
1.1.7.4. Gen đặc hiệu trong UTV
Các gen liên quan tới ung thư (sau đây gọi tắt là gen gây ung thư) là các
gen bình thường có liên quan tới sự sinh trưởng, tăng sinh, biệt hóa và hoạt
hóa phiên mã. Các gen gây UT có thể biểu hiện một cách bất thường bởi sự
đột biến gen hoặc do sự sắp xếp lại/sự chuyển vị, khuếch đại biểu hiện gen
hoặc thông qua việc mất các yếu tố điều hoà kiểm soát sự biểu hiệ
n. Với các
khiếm khuyết đó thì chúng được gọi là gen gây UT. Sự biểu hiện quá mức sẽ
gây hậu quả như sự tăng sinh tế bào và gây ác tính. Tới nay, rất nhiều gen gây
UT đã được xác định có liên quan với nhiều loại ung thư, trong đó có UTV.
Đầu thập kỷ 90, bắt đầu có các chương trình nghiên cứu về gen được tiến
hành, trong đó có 3 gen được tập trung nghiên cứu và có khả năng liên quan
nhiều đến UTV là BRCA1 (breast cancer 1), BRCA2
và p53. Gen BRCA1
nằm trên nhánh dài của NST 17 là gen ức chế tạo u, có chức năng ngăn ngừa
sự phát triển và phân chia nhanh chóng hoặc không kiểm soát được của các tế
bào. Mặt khác, gen BRCA1 còn sản sinh ra một loại protein tham gia trực tiếp
vào việc sửa chữa trong quá trình tái bản DNA, một số nghiên cứu cho rằng

có khoảng 80- 90% gặp đột biến gen này và gặp ở những gia đình có UTV và
UT buồng trứng. Gen BRCA2 nằm trên nhánh dài của NST 13, có vai trò
giố
ng gen BRCA1, có chức năng kìm hãm sự phát triển khối u, sửa chữa DNA
trong quá trình tái bản. Nhưng khác với gen BRCA1, gen BRCA2 không có
liên quan đến UT buồng trứng. Gen BRCA2 chiếm khoảng 35-40% UTV
mang tính di truyền và đã tìm thấy trong những gia đình bị UTV. Gen p53 là
gen ức chế khối u nằm trên nhánh ngắn NST 17 (17p13.1) tham gia vào quá
trình điều hòa chu kỳ tế bào và ức chế sự chết theo chương trình của tế bào
(apoptosis). Đột biến gen p53 gây hậu quả
ác tính ở rất nhiều ung thư. Đột
biến gen p53 được tìm thấy khoảng gần 30% trong UTV hay gặp ở người trẻ,
độ mô học cao, thụ thể nội tiết âm tính, nhìn chung có tiên lượng xấu [2].
HER2 là một loại thụ thể thuộc họ các yếu tố phát triển biểu mô (Human


22
Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR), có hoạt tính tyrosine kinase,
đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và biệt hoá tế bào, nằm ở
nhiễm sắc thể số 17, gần với tâm động, ở vị trí q11.2 q12.0.
Sự khuếch đại
gen HER2 trên nhiễm sắc thể 17 dẫn đến sự tăng biểu hiện thụ thể HER2 trên
bề mặt tế bào ung thư vú (UTV). Biểu hiện quá mức HER2 có thể biến đổi tế
bào thành dạng ác tính và làm tăng quá trình hình thành khối u. Theo nhiều
nghiên cứu gần đây, khoảng 25-30% bệnh nhân ung thư vú có sự khuếch đại
gen HER2 hoặc biểu hiện quá mức gen này trong các tế bào ung thư.
Hiện nay bằng kỹ
thuật sinh học phân tử với độ nhạy cao, các nhà khoa
học đã chứng minh được các tế bào ung thư có nguồn gốc từ các khối u, sau
đó xâm nhập và di chuyển trong máu ngoại vi từ giai đoạn rất sớm trước khi

có biểu hiện lâm sàng. Các tế bào này gọi là các tế bào khối u di chuyển
(Circulating Tumor Cell - CTC) mang gen đặc trưng khối u mà ở người bình
thường không có. Sự xuất hiện và di chuyển của các khối u vào máu ngoại vi
bao gồm nhiề
u giai đoạn. Ban đầu các tế bào ung thư với nhiều bất thường về
di truyền bắt đầu phát triển nhanh, cần nhiều oxy nên phát triển xâm lấn. Các
tế bào này có mật độ thụ thể trên bề mặt thấp dẫn tới sự giảm liên kết với
nhau và chống lại quá trình chết theo chương trình. Kết quả là các tế bào này
có khả năng sống sót cao hơn và dễ dàng xâm nhập vào máu. Các tế bào UT
lưu hành trong cơ
thể cho đến khi bám vào biểu mô mạch máu và cuối cùng
rời khỏi vòng tuần hoàn để hình thành di căn. Ước tính rằng chỉ có một tế bào
trong số 10000 tế bào CTC có thể tạo ra di căn xa [30]. Theo những giả thuyết
trước đây, sự di căn của các tế bào ung thư chỉ xảy ra ở giai đoạn muộn, các tế
bào ung thư vú có thể di căn tới hạch bạch huyết trước khi tới máu ngoại vi và
tổ
chức khác. Nhưng ngày nay người ta đã chứng minh được rằng di căn xảy
ra chỉ khoảng 50% bệnh nhân UTV tại chỗ, và thậm chí 20 - 30% bệnh nhân
UTV với hạch bạch huyết âm tính sẽ vẫn có di căn xa trong vòng 5 năm [10],


23
[25], [36]. Kết quả này mở ra triển vọng có thể phát hiện sớm khối u dựa vào
việc phát hiện các CTC mang những gen chỉ thị đặc trưng cho khối u lưu
hành trong máu. Kỹ thuật PCR và hiện đại hơn là RT-PCR, real-time PCR,
các nhà khoa học đã tìm ra sự hiện diện của các tế bào UTV trong máu như
cytokeratin 19 (CK19), cytokeratin 20 (CK 20), mammaglobin (hMAM),
maspin, β-hCG, thụ thể yếu tố phát triển biểu mô (EGFR), Her-2/neu, MUC1
và CEA với độ nhạy và độ
đặc hiệu khác nhau [25]. Sự tiến bộ của xét nghiệm

chẩn đoán để phát hiện các tế bào ung thư lưu hành trong máu đã được thực
hiện trên rất nhiều nghiên cứu [15], [28], [32], [47]. Tuy nhiên, các nghiên
cứu cũng bộc lộ một vấn đề khó khăn đó là một số gen gây UT cũng biểu hiện
trong tế bào máu cũng như trong tế bào biểu mô bình thường. Điều này dẫn
đến kết quả dương tính giả
, làm giảm đáng kể sự tương quan giữa sự biểu
hiện của các gen UT và các yếu tố tiên lượng bệnh cảnh lâm sàng. Do vậy, để
tránh hiện tượng dương tính giả, cần phải lựa chọn cẩn thận được một gen chỉ
biểu hiện ở bệnh UT mà không biểu hiện ở các tế bào bình thường. Gen
survivin mã hóa một protein ức chế quá trình chết theo chương trình của tế
bào (apoptosis). Gen survivin
được biểu hiện mạnh trong các mô của bào thai
đang phát triển và trong nhiều loại ung thư, trong đó có UTV [45], nhưng điều
đặc biệt có ý nghĩa là gen survivin không biểu hiện ở các mô bình thường
[11]. Do vậy, việc phát hiện gen survivin trong máu có thể giúp ích cho chẩn
đoán sớm, tiên lượng và theo dõi điều trị bệnh UTV [19], [38], [50].
1.2. Gen survivin trong ung th vú
1.2.1. Khái quát về sự chết theo chương trình của tế bào (apoptosis)
Sự chết tế bào bao gồm chết bệnh và chết tự nhiên. Trường hợp bệnh
l ý, những tế bào không được cung cấp máu có thể bị trương lên, màng tế bào
bị nứt, rách và dẫn đến tế bào vỡ tung ra. Sự chết tế bào như vậy cuối cùng
cũng sẽ đưa đến chết mô, đó là sự chết hoại. Tuy nhiên trong một số tr
ường


24
hợp khác, những tế bào không bị trương lên mà teo lại. Màng tế bào vẫn còn
nhưng sần sùi và nhân thường kết đặc lại, tế bào ở dạng này gọi là apoptosis.
Apoptosis xẩy ra một cách bình thường như là một phần trong chương trình
hoạt động sống của tế bào. Trong cơ thể bình thường, hai quá trình trái ngược

nhau, đó là sự phân chia tế bào và sự chết tế bào nhằm điều chỉnh tế bào của
cơ th
ể. Phân chia tế bào làm tăng số lượng tế bào. Apoptosis làm giảm số
lượng tế bào, đảm bảo duy trì hình thái bình thường của cơ thể, của cơ quan.
Apoptosis là một quá trình sinh lý đảm bảo sự sinh trưởng và phát triển hài
hòa trong thời gian phát triển phôi và bảo vệ cơ thể, thay thế mô ở những cơ
thể trưởng thành.

Hình 1.1. Apoptosis
Khi quá trình apoptosis không xảy ra hoặc bị ức chế, tế bào sẽ không bị
phá hủy bởi sự chết theo chương trình và tế bào sẽ phân chia, tạo thành các tế
bào con với DNA bị tổn thương. Điều này có thể là một cơ chế dẫn đến sự
phát sinh ung thư.
1.2.2. Survivin
1.2.2.1. Cấu trúc survivin


25

Hình 1.2. Survivin
Survivin là thành viên thuộc nhóm các protein ức chế sự chết theo
chương trình của tế bào (IAP) và điều hòa phân chia tế bào. Gen survivin
được phát hiện vào năm 1997 từ thư viện bộ gen của người [11]. Gen survivin
có chiều dài 15 kb, nằm ở vị trí NST 17q25. Sợi mã hóa của survivin có cấu
trúc mở gồm 426 nucleotid mã hóa cho protein gồm 142 aa với TLPT vào
khoảng 16,3 kDa.

Hình 1.3. Sơ đồ NST 17 và vị trí của gen survivin
Ngoài ra gen survivin còn có thêm 4 loại biến thể ghép nối [12], [33], [37]
Bảng 1.2. Cấu trúc cDNA của các loại biến thể ghép nối của survivin

STT Các dạng biến thể ghép nối Các exon
1
Survivin
1, 2, 3, 4