Luận văn : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ part 4 pdf

22
Các bƣớc tiến hành ly trích RNA
1. Cân khoảng 80 mg mẫu lá, cắt ra từng miếng nhỏ (< 5 mm). Nghiền mịn trong
nitơ lỏng. Chú ý không để cho mẫu bị chảy nƣớc trong lúc nghiền.
2. Cho 60 mg mẫu đã nghiền vào tube 2 ml có nắp đậy (có sẵn trong kit). Cho 14
µl PVP 2% vào mỗi 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution).
3. Cho 700 µl dịch ly trích mẫu (lysis solution) đã bỗ sung PVP 2% vào tube
chứa mẫu và trộn đều bằng pipet từ 12 - 15 lần.
4. Ly tâm với tốc độ 12000 vòng trong 3 phút ở 4
o
C. Sau đó hút dịch nổi sang
tube 2 ml (có trong kit).
5. Cho 700 µl ethanol 70% vào tube chứa dịch nổi, trộn đều bằng pipet cho đến
khi dịch không còn phân lớp.
6. Cho dịch hòa tan RNA (elution solution) vào bể điều nhiệt ở 70
o
C. Cho RNA
binding column vào tube 2 ml không có nắp đậy.
7. Hút 700 µl dịch mẫu cho vào RNA binding column. Ly tâm ở tốc độ 12000
vòng trong 1 phút ở 4
o
C. Loại phần dịch bên dƣới ra khỏi tube (thực hiện nhiều lần
cho đến khi hết mẫu thì thôi).
8. Cho 80 µl ethanol 100% vào 20 ml dịch rửa nhẹ (low stringency).
9. Cho 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency) đã bổ sung ethanol 100% vào RNA
binding column. Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4
o
C. Loại phần dịch bên dƣới.
10. Pha DNase I với 250 µl Tris base pH = 7,5, trộn đều.

11. Pha 5 µl DNase I với 75 µl dịch pha loãng DNase (DNase delution solution)
cho một mẫu ly trích trong tube 1,5 ml.
Cho 80 µl dung dịch DNase vào RNA binding column. Ủ 15 phút ở nhiệt độ
phòng.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4
o
C.
Loại phần dịch bên dƣới.
12. Thêm 700 µl dịch rửa mạnh (high stringency wash solution) vào RNA
binding column.
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4
o
C
Loại phần dịch bên dƣới
13. Thêm 700 µl dịch rửa nhẹ (low stringency wash solution) vào RNA binding
column.


23
Ly tâm 12000 vòng trong 30 giây ở 4
o
C
Loại phần dịch bên dƣới.
Ly tâm tiếp 60 giây với tốc độ 12000 vòng ở 4
o
C để loại hoàn toàn dịch rửa.
14. Cho RNA binding column vào tube 1,5 ml (có trong kit) có nắp đậy.
Cho 80 µl dịch hòa tan RNA (elution solution) đã ủ ở 70
o
C vào RNA binding

column, giữ ở nhiệt độ phòng trong 60 giây.
Ly tâm 12000 vòng trong 2 phút ở 4
o
C để thu RNA tổng số.
RNA đem ủ ở 4
o
C để dùng sau.
*Những lƣu ý khi ly trích
- Phải có khu vực làm việc riêng
- Trong quá trình ly trích, phải thao tác càng nhanh càng tốt
- Thay bao tay thƣờng xuyên khi thấy cần thiết
Giai đoạn 2: Tổng hợp cDNA
Mẫu RNA đƣợc ly trích ở trên sẽ đƣợc dùng để chạy RT-PCR. Mục đích để
khuếch đại 1 đoạn gen mã hóa cho phân tử protein vỏ của virus PLRV. Quy trình này
gồm hai bƣớc (two steps).
Bƣớc 1: Tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA theo hƣớng dẫn của bộ kit tổng hợp cDNA (iScript cDNA kit).
Thành phần các loại hóa chất cho 1 phản ứng tổng hợp cDNA đƣợc cho theo
bảng dƣới đây. Đối với lƣợng RNA cho vào ta thay đổi thể tích từ 2 - 5 µl trong một
phản ứng.

Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA
Thành phần
Thể tích
5X iScript reaction Mix
Enzyme
RNA
Nƣớc
4 µl
1 µl

5 µl (1 - 5 µg)
Cho vào để đủ 20 µl

Tổng thể tích
20 µl





24
Chu kỳ nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA
25
o
C trong 5 phút
42
o
C trong 30 phút
85
o
C trong 5 phút
Giữ ở 4
o
C
cDNA đƣợc tổng hợp (20 µl) có thể đem sử dụng ngay trong phản ứng PCR hoặc
cất ở 4
o
C để chạy PCR sau.
Bƣớc 2: Thực hiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA
Bƣớc này ta không sử dụng kit mà thực hiện theo nghiên cứu của Fattouma

DJILANI và Hatem FAKHFAKH ở đại học Tuynidi vào năm 2002.
Thành phần hóa chất cho một phản ứng 25 µl đƣợc cho theo bảng dƣới đây
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA
Thành phần
Nồng độ cuối
Dung dịch đệm PCR 10X
MgCl
2

Hỗn hợp dNTP (dNTP Mix)
Mồi xuôi (sens primer)
Mồi ngƣợc (antisens primer)
iTaq polymerase
cDNA
Nƣớc
1X
1 mM
0,2 mM
0,3 µM
0,3 µM
1 U/µl
2,5 - 5 µl
Cho vào để đủ 25 µl
Tổng thể tích
25 µl

Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
- 94
o
C trong 5 phút

-
94
o
C trong 1 phút
- 50
o
C trong 1 phút 35 chu kỳ
- 72
o
C trong 1 phút
- 72
o
C trong 10 phút
Lƣợng cDNA cho vào mỗi phản ứng thay đổi từ 2,5 – 5 µl. Sau khi thực hiện
phản ứng PCR, ta sẽ thu đƣợc 25 µl sản phẩm (cDNA sợi đôi). Ta có thể thực hiện
điện di ngay để xem kết quả hoặc cũng có thể trữ ở -20
o
C để chạy điện di sau.
*Điện di đọc kết quả


25
Để kiểm tra sản phẩm RT-PCR có phải là đoạn gen mong muốn không ta thực
hiện điện di trên gel agarose.
Nồng độ gel: 1,5%
Hiệu điện thế: 50 V
Cƣờng độ dòng điện: 250 mA
Thời gian điện di: 45 phút (có thể canh vạch loading dye)
Tỷ lệ mẫu : loading dye là 4 µl : 2 µl
Nhuộm ethidium bromide trong 20 phút

Đọc kết quả trên máy chiếu tia UV.
3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV
Sau khi kiểm tra kết quả bằng điện di nếu thấy có đoạn gen mong muốn (kích
thƣớc 336 bp), chúng tôi thực hiện tiếp bƣớc giải trình tự nhằm xác định chính xác
đoạn gen của PLRV và khẳng định có sản phẩm phụ hay không.
Việc giải trình tự tiến hành trực tiếp từ sản phẩm RT-PCR, theo nguyên tắc của
Sanger. Phƣơng pháp này sử dụng một primer (hoặc sense hoặc antisense) cho một lần
giải trình tự. Trong đề tài này, ta sẽ tiến hành giải trình tự bằng cả primer sense lẫn
antisense.
Bƣớc 1: Chạy cycle sequencing
- Thành phần hóa chất cho 1 phản ứng
Bigdye 2,5X 2 µl
Bigdye buffer 5X 1 µl
Sản phẩm PCR 3 - 10 ng
Primer 3,2 pmol
Nƣớc cho vào để đƣợc thể tích 10 µl
Bigdye 2,5X bao gồm: enzyme kéo dài mẫu, buffer, dNTP và ddNTP.
-Mỗi phản ứng chỉ sử dụng hoặc là primer xuôi hoặc là primer ngƣợc
Quy trình nhiệt
96
o
C trong 1 phút
96
o
C trong 10 giây
50
o
C trong 5giây 25 chu kỳ
60
o

C trong 4 phút



26
Bƣớc 2: Làm sạch sản phẩm cycle sequencing
- Cho 2,5 µl / tube EDTA 125 mM vào.
- Cho 30 µl / tube ethanol 100% vào, đảo nhẹ.
- Để ở nhiệt độ phòng 15 phút
- Ly tâm 12000 vòng trong 30 phút ở 4
o
C
- Loại dịch trong
- Cho 30 µl / tube ethanol 70% vào
- Ly tâm 12000 vòng trong 20 phút ở 4
o
C
- Hút bỏ dịch trong và để khô.
Bƣớc 3: Biến tính
- Cho vào mỗi tube 10 µl Hidi formamide.
- Biến tính ở 95
o
C trong 2 phút
- Đƣa nhanh vào đá
Sau đó cho 10 µl mẫu này vào máy giải trình tự.
Bƣớc 4: Đọc kết quả
Kết quả giải trình tự sẽ ở dạng peak (mỗi peak đại diện cho 1 nucleotide) và dạng
ký tự (A, T, G, C).
Sau khi có trình tự ta tiến hành kiểm tra bằng cách so sánh trình tự giải đƣợc với
trình tự có sẵn trên ngân hàng gen (NCBI). Qua đây ta sẽ biết đƣợc trình tự giải đƣợc

có phải là virus PLRV không và biết đƣợc mức độ tƣơng đồng giữa trình tự ta có với
trình tự trên ngân hàng gene.













27
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN



4.1 Tình hình canh tác khoai tây tại Thành phố Đà Lạt
Thời gian điều tra từ ngày 21 tháng 3 đến ngày 23 tháng 3 năm 2005. Tại thời
điểm điều tra đang là mùa nắng - mùa chính để trồng khoai tây. Địa điểm điều tra gồm
các phƣờng 5, 8, 9, 11 và 12. Diện tích điều tra tại phƣờng 5 là 1 hecta, phƣờng 8 là 1
hecta, phƣờng 9 là 1,6 hecta, phƣờng 11 là 0,6 hecta và phƣờng 12 là 1 hecta. Hai
giống khoai tây đƣợc trồng chủ yếu tại các phƣờng trên là 06 và 07 nuôi cấy mô, giống
07 đƣợc trồng trên nền đất thịt còn giống 06 đƣợc trồng ít hơn trên nền đất xốp. Vào
khoảng thời gian này, khoai tây đang ở các độ tuổi từ 1 đến 3 tháng tuổi, phần lớn các
ruộng khoai tây đang ở giai đoạn sắp thu hoạch (tháng thứ 3). Điều kiện khí hậu lúc
này là nắng nóng và khô hạn kéo dài. 100% ruộng khảo sát đều hiện diện ruồi đục lá

và các loại rệp. 100% các ruộng đều canh tác theo cách lên luống và trồng hàng một,
không trồng xen với các loại cây trồng khác. Đa số các ruộng khoai tây ở giai đoạn
chuẩn bị thu hoạch nên việc quan sát triệu chứng của các bệnh là rất khó khăn. Tuy
nhiên các bệnh thƣờng gặp là héo xanh, bã trầu, cuốn lá. Sự quan tâm cũng nhƣ nhận
thức về bệnh virus và sự nguy hại do bệnh virus của nông dân là rất hạn chế. Do điều
kiện thời tiết bất lợi nên năng suất dự kiến sẽ bị giảm và ƣớc tính khoảng 1,5 – 2,5 tấn
/ hecta.
4.2 Kết quả phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kỹ thuật ELISA
4.2.1 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV tại các phƣờng
Với khí hậu mát lạnh, khu vực Đà Lạt có điều kiện đặc biệt thuận lợi trồng khoai
tây hầu nhƣ quanh năm. Theo thống kê của phòng nông nghiệp, tổng diện tích trồng
khoai tây tại Đà Lạt là 856 ha với năng suất 98 tạ / ha đạt sản lƣợng 8425 tấn (năm
2004). Đà Lạt đƣợc xem là địa phƣơng có kỹ thuật canh tác rất cao, ngƣời dân đã biết
áp dụng các kỹ thuật hiện đại, các loại chế phẩm sinh học, công nghệ nuôi cấy mô, sử
dụng nhà kính từ nhiều năm nay. Trong đó các phƣờng 8, phƣờng 9 và phƣờng 12
đƣợc xem là những khu vực có kỹ thuật canh tác tƣơng đối vƣợt trội. Tuy nhiên kết
quả thực tế về tình hình nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV rất bất ngờ và đáng
lo ngại. Dƣới đây là kết quả kiểm tra tỷ lệ nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV
tại các phƣờng đƣợc điều tra.


28
Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm PVX ,PVY, PLRV tại các phƣờng

-Từ số liệu trên ta có biểu đồ dƣới đây

- Qua kết quả này ta thấy tất cả các phƣờng đƣợc điều tra tại thành phố Đà Lạt đã
bị nhiễm PVX, PVY, PLRV. Trong đó, mức độ nhiễm trung bình PVX (41,75%) là
thấp nhất còn PVY (97,58%) và PLRV (98,79%) là rất cao.
- Tại Việt Nam virus PVY đƣợc xem là loại virus gây hại nghiêm trọng nhất tiếp
đến là PVX (Lê Lƣơng Tề - Vũ Triệu Mân, 1999). Trong kết quả này tỷ lệ nhiễm PVY
là rất cao, nhiễm PVX cũng khá cao. Chính vì vậy ta cần phải đƣa ra các biện pháp
phòng trừ thích hợp nhằm ngăn chặn sự lây lan và tác hại của các loại virus trên.
- Tại phƣờng 12, đa số các mẫu lấy tại đây đều chỉ ở F1 hoặc F2 nhƣng lại có tỷ
lệ nhiễm các loại virus là cao nhất. Nguyên nhân có thể là nguồn gốc giống không đảm
bảo (giống không sạch bệnh).
- Các mẫu không biểu hiện triệu chứng của bệnh cũng cho kết quả dƣơng tính.
Điều này chứng tỏ một điều là ta không thể dựa hoàn toàn vào triệu chứng mà định
bệnh.

Địa
phƣơng
lấy mẫu
PVX
PVY
PLRV
Tổn
g số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ lệ
(%)

Tổng
số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ lệ
(%)
Tổng
số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ lệ
(%)
P5
32
18
56,25
33
30
90,91
33
32
96,97
P8
23
4
17,39

23
23
100
23
23
100
P9
33
7
21,21
33
32
96,97
33
32
96,97
P11
17
7
41,18
18
18
100
17
17
100
P12
22
16
72,73

21
21
100
22
22
100
Trung
bình


41,75


97,58


98,79

Biểu đồ 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng phƣờng
0
20
40
60
80
100
PVX PVY PLRV
Virus
Tỷ lệ (%)
P5
P8

P9
P11
P12



29
4.2.2 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo từng giống
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo giống
Giốn
g
PVX
PVY
PLRV
Tổn
g số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ lệ
(%)
Tổn
g số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ lệ
(%)

Tổn
g số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ lệ
(%)
07
06
104
22
39
12
37,50
54,54
103
23
103
20
100
86,96
104
23
102
16
98,08
69,57

Từ bảng ta có biểu đồ dƣới đây

- Qua bảng và biểu đồ ta thấy có sự khác biệt về mức độ nhiễm bệnh của hai
giống khoai tây 06 và 07. Giống 06 cho tỷ lệ nhiễm với PVX cao hơn so với giống 07.
Còn đối với PVY và PLRV thì giống 07 lại cho kết quả nhiễm cao hơn giống 06. Hai
giống 06 và 07 là giống nhập nội nên có tỷ lệ nhiễm PLRV ở mức độ cao (Lê Lƣơng
Tề - Vũ Triệu Mân, 1999).
- Giống 07 đƣợc cho là có khả năng kháng bệnh cao. Tuy nhiên qua kết quả trên
ta thấy giống 07 không tỏ ra ƣu thế trong việc kháng lại các loại virus trên so với giống
06. Vấn đề ở đây là yếu tố môi trƣờng và cách chăm sóc cũng tác động rất lớn đến khả
năng nhiễm virus của các giống khoai tây. Tuy nhiên cũng có thể do lƣợng mẫu kiểm
tra không đủ để phản ánh tỷ lệ nhiễm thực sự của giống 06. Do đó tùy từng điều kiện
cụ thể mà ta nên trồng giống 06 hay 07 tuy nhiên dù trồng giống 06 hay 07 thì khâu
sản xuất giống sạch bệnh hay kháng bệnh là quan trọng nhất. Giống 06 và 07 đƣợc
trồng bằng cây nuôi cấy mô. Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1999), những cây
con giống có thể bị nhiễm bệnh từ 90 đến 100% ở các mức độ khác nhau nếu nhƣ tế
bào ban đầu đem nuôi cấy đã bị nhiễm virus.
Biểu đồ 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa hai giống 06 và 07
0
20
40
60
80

100
PVX PVY PLRV
Virus
Tỷ lệ (%)
07
06



30
4.2.3 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ
Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ của giống 07
Thế
hệ
PVX
PVY
PLRV
Tổn
g số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ
lệ
(%)
Tổn
g số
mẫu
Số

mẫu
nhiễm
Tỷ
lệ
(%)
Tổn
g số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ
lệ
(%)
F1
F2
F3
53
45
6
22
12
5
41,5
1
26,6
7
83,3
3
51

44
28
50
44
28
98,0
4
100
100
54
44
6
53
44
6
98,1
5
100
100

Từ bảng ta có biểu đồ

Kết quả cho thấy, ở thế hệ sau tỷ lệ nhiễm virus cao hơn ở thế hệ trƣớc. Điều này
hoàn toàn chính xác, đặc biệt với virus PLRV sự tái nhiễm ở vụ thứ hai hoặc thứ ba từ
69 – 90% (Vander Zang, 1983). Riêng đối với PVX thì thế hệ sau nhiễm ít hơn thế hệ
trƣớc, có thể lý giải dựa vào điều kiện canh tác tốt đồng thời khí hậu khắc nghiệt của
mùa nắng không thuận lợi cho sự phát triển và lây truyền của virus PVX.
- Đối với PVY – virus gây hại quan trọng ở Việt Nam và PLRV cho tỷ lệ nhiễm
rất cao ngay ở thế hệ F1. Điều này chứng tỏ nguồn cây giống (nuôi cấy mô) đã bị
nhiễm bệnh từ đầu chứ không phải sạch bệnh nhƣ lời công bố của các nhà cung cấp
giống.
Qua đây ta rút ra kinh nghiệm là không nên để giống quá dài, bởi vì giống dễ bị
thoái hóa và khả năng nhiễm các loại virus trên là rất cao ảnh hƣởng đến năng suất và
chất lƣợng khoai tây.

0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
PVX PVY PLRV
Virus
Tỷ lệ (%)
F1
F2
F3

Biểu đồ 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các thế hệ của giống 07


31

4.2.4 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo tháng tuổi
Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV theo từng tháng tuổi
Tuổi
PVX
PVY
PLRV
Tổng
Số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ lệ
(%)
Tổng
Số
mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ lệ
(%)
Tổng
Số

mẫu
Số
mẫu
nhiễm
Tỷ lệ
(%)
1T
1,5T
2T
2,5T
3T
5
10
19
5
65
1
9
8
3
18
20
90
42,11
60
27,69
5
10
18
5

65
5
10
17
5
65
100
100
94,44
100
100
5
9
7
5
66
5
9
7
5
66
100
100
100
100
100
Từ bảng ta có biểu đồ

Nhận xét
- Không có sự khác biệt giữa các độ tuổi về tỷ lệ nhiễm PVY và PLRV. Từ 1
tháng đến 3 tháng tỷ lệ nhiễm luôn ở mức cao. Điều này chứng tỏ các giống đƣợc
trồng có thể đã bị thoái hóa và nguồn cung cấp giống đã bị nhiễm từ ban đầu.
- Đối với PVX, có sự thay đổi bất thƣờng, thời điểm 1,5 tháng cho tỷ lệ nhiễm cao
nhất (90%), thấp nhất là lúc 1 tháng.
- Sự hiện diện tƣơng đối nhiều các loại côn trùng nhƣ ruồi, rệp ở các ruộng khoai
tây đƣợc khảo sát cũng là một nguyên nhân dẫn đến sự nhiễm các loại virus ở mức độ
cao.
4.3 Kết quả RT-PCR
- Dùng kit ly trích RNA do Bio - Rad cung cấp ta thu đƣợc 80 µl RNA tổng số.
- Ta sẽ thu đƣợc 20 µl cDNA sau khi thực hiện phản ứng tổng hợp cDNA. Thành
phần và quy trình nhiệt của phản ứng tổng hợp cDNA (theo hƣớng dẫn của kit tổng hợp
0
20
40
60
80
100
PVX PVY PLRV
Virus
Tỷ lệ (%)
1T
1,5T
2T

2,5T
3T

Biểu đồ 4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi