Luận văn : NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY (PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ part 3 pptx

12
Ở cả hai trƣờng hợp, các phân đoạn DNA sẽ đƣợc phân tách thông qua điện di
trên gel polyacrylamide hay polymer trong các mao quản có khả năng phân tách hai
đoạn DNA chỉ chênh lệch nhau một nucleotide. Với việc sử dụng một loại nucleotide
có đánh dấu, kết quả trình tự cần xác định đƣợc đọc từ bản điện di. (Hồ Huỳnh Thùy
Dƣơng, 2002).
2.4 Những nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV trên
khoai tây
2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV
Những nghiên cứu về bệnh virus thực vật nói chung và trên khoai tây nói riêng ở
Việt Nam ngày càng phong phú và đa dạng, tuy nhiên phần lớn các nghiên cứu này chỉ
tập trung vào việc chẩn đoán và xác định bệnh.
- Năm1967 Nguyễn Hữu Thụy (Ban điều tra cơ bản côn trùng bệnh cây) đã xác
định sự có mặt của virus X khoai tây.
- Từ năm 1973 – 1985, Vũ Triệu Mân đã xác định 7 virus chính gây hại trên
khoai tây ở Việt Nam là PVY, PVX, PVA, PVS, PVM, PAMV, PLRV bằng phƣơng
pháp cây chỉ thị, phƣơng pháp ELISA, phƣơng pháp hiển vi điện tử.
- Các tác giả Nguyễn Viết Tùng, Nguyễn Văn Viết, Nguyễn Kim Oanh đã nghiên
cứu các môi giới truyền bệnh ở vùng Gia Lâm (Hà Nội) – vùng Xuân Mai (Hòa Bình)
truyền bệnh virus khoai tây.
- Từ năm 1980 – 1985, đề tài cấp nhà nƣớc chống bệnh virus, đã tổ chức phòng
trừ bằng chọn lọc vệ sinh cho nhiều vùng sản xuất khoai tây ở miền bắc (Hà Nam,
Nam Định, Hà Bắc, Hải Dƣơng, Hƣng Yên).
- 1985 – 1992, Trƣờng Đại học Nông Nghiệp 1 đã đề xuất việc sản xuất khoai tây
giống trên vùng cách li địa hình ngay ở đồng bằng sông Hồng chống bệnh virus có
hiệu quả ở vùng Hà Tây.
- Các virus PVX, PVY, PMV và một số virus khác đã đƣợc nghiên cứu và sản
xuất thử kháng huyết thanh tại trƣờng Đại học Nông Nghiệp 1 Hà Nội. Kỹ thuật
ELISA đƣợc sử dụng từ năm 1990, kỹ thuật PCR bắt đầu áp dụng từ năm 1995 để

chẩn đóan bệnh.
- Tại Trung tâm Nghiên cứu khoai tây Đà Lạt chỉ mới dừng lại ở kiểm tra ELISA
trên các giống do Trung tâm sản xuất.


13
- Các kỹ thuật RT-PCR, giải trình tự chƣa đƣợc áp dụng phổ biến trong công tác
chẩn đoán virus PLRV.
2.4.2 Nghiên cứu nƣớc ngoài về virus PVX, PVY, PLRV
- Nie và Singh (2002) đã dùng kỹ thuật RT-PCR trong việc xác định trình tự
nucleotide của PVY ở Châu Âu và Bắc Mỹ (PVY
NTN
gây đốm hoại tử ở củ ). Thông
qua nghiên cứu này, họ muốn xác định khoảng cách di truyền và phƣơng pháp phân
biệt các chủng PVY, đồng thời cũng giúp xác định những trình tự mới xuất hiện ở
những vùng địa lí khác nhau do biến chủng từ PVY
NTN
. Nghiên cứu này dựa trên sự
khác biệt ở đoạn gen P1 và 5’ - UTR.
- Nie, Xianzhou, Singh và Rudra (2003) đã dùng kỹ thuật multiplex RT-PCR để
phân biệt các chủng PVY
N
, PVY
O
và PVY
NTN
.


- Nie và Singh (2000) đã sử dụng các primer ngẫu nhiên cho multiplex RT-PCR

nhằm mục đích xác định sự hiện diện của virus và viroid trong rệp, lá và củ
- Singh, Kurz, Boiteau và Moore (1997) đã dùng kỹ thuật PT-PCR để xác định sự
hiện diện của PLRV trong rệp bắt từ ruộng khoai tây. Trong nghiên cứu này 3 loại rệp
là Myzus persicae: green peach aphid; buckthorn aphid và potatoaphid Macrosiphum
euphorbiae đƣợc lấy từ ruộng cây khoai tây thƣơng mại New Brunswick (1988-1994)
đều cho kết quả dƣơng tính với PLRV.
- Singh, Nie, Sing, Coffin và Duplessis (2002) cho rằng phản ứng RT-PCR bị ức
chế bởi hợp chất phenolic từ mô cây. Nghiên cứu này xác định việc bổ sung Na
2
SO
3

trong bƣớc cho dung dịch đệm li trích RNA có thể nâng cao hiệu quả của RT-PCR.
Bởi vì Na
2
SO
3
(Sodium sulphite) có khả năng ức chế hợp chất phenolic hiện diện
trong quá trình ly trích RNA.
- Công ty Monsanto Canada Inc đã thành công trong việc tạo ra giống khoai tây
“Newleaf-plus
TM
Russet Burbank” với các dòng RBMT 21-129, RBMT21-350 và
RBMT22-082 có khả năng kháng lại PLRV. Bằng cách chuyển gen CryIIIA từ
Bacillus thuringensis và hai trình tự ORF
1
, ORF
2
từ PLRV , quá trình chuyển gen
đƣợc thực hiện nhờ Agrobacterium.

14
PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 21 tháng 03 đến ngày 15 tháng 07 năm 2005 tại
Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA để phát hiện PVX, PVY và PLRV
a. Nguồn mẫu thí nghiệm
Tất cả các mẫu thí nghiệm đƣợc lấy từ năm phƣờng (5, 8, 9, 11 và 12) tại Đà Lạt,
đƣợc bảo quản trong điều kiện -20
o
C.
b. Hóa chất:
Các loại hóa chất cần cho quá trình chẩn đoán đƣợc cung cấp đầy đủ trong các bộ
kit Potato virus X - PVX test kit 480 test, potato virus Y - PVY test kit 480 test và
potato leafroll virus - PLRV test kit 480 test (do Bio – Rad cung cấp) gồm có:
- Dịch trích mẫu (Tampon De Broyage Extraction buffer 1X)
- Dung dịch đệm để pha kháng thể (Coating buffer)
- Kháng thể
+ Đối với PVX và PVY dùng kháng thể đa dòng (Polyclonal antibody)
+ Đối với PLRV dùng kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody)
- Dịch rửa (PBS - Tween)

- Đối chứng dƣơng (Positive control)
- Đối chứng âm (Negative control)
- Dung dịch đệm để pha kháng thể có gắn enzyme (Conjugate buffer)
- Kháng thể gắn enzyme alkaline-phosphatase (Conjugate antibodies)
- Dung dịch đệm để pha chất chỉ thị màu
- Chất chỉ thị màu p-NPP
Ngoài ra cần phải chuẩn bị
- Cồn 70
o

- Nƣớc cất hai lần khử ion và hấp khử trùng



15
3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV
3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA
RNA đƣợc ly trích theo quy trình của kit ly trích (The Aurum total RNA mini kit )
do Bio-Rad sản xuất
Những loại hóa chất có sẵn trong kit:
- Dịch trích mẫu (Lysis solution) 50 ml
- Dịch rửa nhẹ 5X (Low stringency wash solution) 20 ml
- Dịch rửa mạnh (High stringency wash solution) 40 ml
- DNase I dạng bột 1 hủ
- Dịch pha loãng DNase I 10 ml
- Dịch hòa tan RNA (Elution solution) 10 ml
Bên cạnh đó ta phải chuẩn bị một số hóa chất sau :
- Polyvinylpyrolidone - 40 (PVP) 2%
- Tris-base
- β-mercaptoethanol 14,2 M

- Ethanol 95 - 100%
- NaOH 0,1 M
- EDTA 1M
3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR
*Giai đoạn tổng hợp cDNA
Dùng kit tổng hợp cDNA (iScript cDNA kit) do Bio - Rad cung cấp với thành
phần nhƣ sau:
- Hỗn hợp phản ứng đã pha sẵn (5X iScript Reaction Mix)100 µl. Hỗn hợp này đã
đƣợc trộn với primer poly T (oligo dT) và các hexamer ngẫu nhiên, chúng có khả năng
bắt cặp với những RNA mục tiêu khác nhau. Hỗn hợp này sẽ cho kết quả tối ƣu với
những sản phẩm < 1 kb.
- Nƣớc không nhiễm enzyme thủy phân nucleotide (Nuclease free water) 1,5 ml.
- Enzyme phiên mã ngƣợc (iScript Reverse Transcriptase) 25 µl, là enzyme
MMLV với hoạt tính RNAse H+ có độ nhạy cao hơn những enzyme có hoạt tính
RNAse H Enzyme này đƣợc bổ sung thêm chất ức chế enzyme phân hủy RNA
(RNAse). Ta chỉ cần bổ sung thêm RNA và chạy theo chu trình nhiệt của kit.
+ Giai đoạn thực hiện phản ứng PCR khuếch đại các phân tử cDNA


16
- cDNA đƣợc lấy từ quá trình tổng hợp ở trên.
- Nƣớc không chứa nuclease (Nuclease free water)
- Dung dịch đệm PCR (10X PCR buffer)
- MgCl
2
50 mM
- Hỗn hợp dNTP 10 mM
- iTaq polymerase 5 U / µl
- Primer với trình tự nhƣ sau :
Sense primer: 5’CGC GCT AAC AGA GTT CAG CC 3’

Antisense primer: 5’GCA ATG GGG GTC CAA CTC AT 3’
Bên cạnh đó cần phải chuẩn bị một số hóa chất khác nhƣ:
- Agarose (Promega - Mỹ)
- Loading dye 6X
- Thang chuẩn (ladder) 100bp (Bio – Rad)
- TAE 0,5X
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Nội dung nghiên cứu
- Điều tra tình hình nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV trên khoai tây tại
thành phố Đà Lạt thông qua việc thực hiện phản ứng ELISA trên các mẫu thu thập tại
các phƣờng.
- Kiểm tra các mẫu có phản ứng ELISA dƣơng tính với virus PLRV bằng kỹ
thuật RT-PCR.
- Giải trình tự đoạn DNA có đƣợc từ sản phẩm RT-PCR để khẳng định nguồn
gốc của đoạn gen đó, đánh giá mức độ tƣơng đồng với gen của virus PLRV có trên
ngân hàng gen.
3.3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu
Công tác điều tra tình hình bệnh virus trên khoai tây ở thành phố Đà Lạt đƣợc
tiến hành nhƣ sau
- Liên hệ Phòng Nông nghiệp, Chi cục Bảo vệ Thực vật và Trạm Khuyến nông
thành phố để điều tra tình hình phân bố diện tích, chủng loại giống, vùng tập trung và
các yếu tố liên quan đến bệnh virus trên khoai tây từ đó xác định địa bàn tiêu biểu cần
điều tra.


17
- Điều tra tại các hộ nông dân có trồng khoai tây theo mẫu điều tra đã chuẩn bị
sẵn gồm các chỉ tiêu nhƣ: Đặc điểm vƣờn trồng, chủng loại giống, kỹ thuật canh tác,
tình hình sâu bệnh.
Khâu lấy mẫu đƣợc thực hiện nhƣ sau:

- Tùy theo diện tích có thể lấy từ 5 - 10 mẫu /vƣờn theo đƣờng chéo. Mẫu là toàn
bộ thân cây, đƣợc cho vào bao nylon có ghi nhãn cẩn thận về thời gian, địa điểm, chủ
vƣờn, loại cây, tuổi cây, triệu chứng, điều kiện canh tác. Mẫu đƣợc cho vào thùng xốp
và đƣợc giữ lạnh cho đến khi kết thúc đợt lấy mẫu.
- Mẫu đƣợc đem về phòng thí nghiệm trong điều kiện đƣợc giữ lạnh và bảo quản
trong tủ lạnh ở nhiệt độ -20
o
C cho đến khi phân tích.
Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ 5 phƣờng thuộc tp.Đà Lạt
STT
Địa điểm
Lấy mẫu
Tổng số
mẫu
Giống
Tuổi cây
Thế hệ
06
07
1T
1.5T
2T
2.5T
3T
F1
F2
F3
1
2
3

4
5
Phƣờng 5
Phƣờng 8
Phƣờng 9
Phƣờng 11
Phƣờng 12
32
24
54
18
23
22
0
0
0
0
10
24
54
18
23
5
0
15
0
0
6
0
10

8
0
6
0
12
0
13
10
0
0
0
0
5
24
17
10
10
16
11
32
0
11
0
13
22
10
12
16
0
0

8
0
Tổng cộng
150
22
128
20
24
31
10
66
70
57
24
T: tháng
3.3.3 Phƣơng pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV
3.3.3.1 Phát hiện PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA
Sử dụng phƣơng pháp dDAS-ELISA (direct Double Antibody Sandwich Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay) theo sự hƣớng dẫn thực hiện của bộ kit và đƣợc tiến
hành qua 2 giai đoạn. Giai đoạn 1: Thực hiện 1 lần ly trích virus để kiểm tra cả virus
PVX, PVY và PLRV. Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng ELISA.
Giai đoạn 1: Ly trích mẫu
Trƣớc tiên ta phải dùng nƣớc cất vô trùng (chuẩn bị trƣớc) để pha dịch ly trích
mẫu từ 20X xuống còn 1X. Dịch trích đƣợc pha loãng để dùng ly trích cả PVX, PVY
và PLRV.
Tổng số mẫu cần nghiền là 135 mẫu
Các mẫu đƣợc lấy ra từ tủ lạnh -20
o
C, cắt lấy phần thân, chồi non hoặc gân chính
của lá (có cả phiến lá) và cân khoảng 0,5 gam cho vào cối.

18
Hút 2,5 ml dung dịch trích mẫu, dùng chày nghiền mẫu cho đến khi các thành
phần đều nát vụn.
Đổ dịch mẫu vừa nghiền xong vào eppendoff 1,5 ml. Sau đó ta đem li tâm với tốc
độ 5000 vòng / phút trong 5 phút ở 4
o
C. Đem mẫu cất vào tủ mát (2 - 8
o
C) để dùng
sau.
Giai đoạn 2: Thực hiện phản ứng ELISA
Bƣớc 1
Chuẩn bị đĩa và sơ đồ bố trí mẫu. Theo chỉ dẫn của kit, ta bỏ hàng A và H; bỏ cột
12. Do đó đĩa ELISA 96 giếng chỉ kiểm tra đƣợc 27 mẫu, mỗi mẫu đƣợc cho vào 2
giếng. Mỗi đĩa đều đƣợc ghi số thứ tự từ 1 đến 5 và tên của virus đang thực hiện chẩn
đoán.
Sơ đồ bố trí trên đĩa ELISA

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
A












B
Substrate
BF
1
4
7
10
13
16
19
22
25

C
Substrate

BF
1
4
7
10
13
16
19
22
25

D
Substrate
PC
2
5
8
11
14
17
20
23
26

E
Substrate
PC
2
5
8

11
14
17
20
23
26

F
Substrate
NC
3
6
9
12
15
18
21
24
27

G
Substrate
NC
3
6
9
12
15
18
21

24
27

H












BF: Buffer 1; 2…; 27: Số thứ tự của mẫu
PC (Positive control) : Đối chứng dƣơng
NC (Negative control): Đối chứng âm
Substrate: Cơ chất
Bƣớc 2
Pha loãng kháng thể (kháng thể 1) bằng dung dịch đệm (tỷ lệ pha theo bảng dƣới đây).
Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể
Hóa chất
PVX
PVY
PLRV
Dung dịch đệm
Kháng thể
10ml

100µl
10ml
100µl
10ml
20µl


19
Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất vào cột số 1. Cũng với pipet trên ta hút kháng thể
cho vào các giếng từ cột số 2 đến số 11 (100 µl / giếng). Dùng băng keo trong dán kín
mặt đĩa và đem ủ ở 37
o
C trong 2 giờ. Sau đó rửa 3 lần với PBS-Tween bằng máy rửa
đĩa ELISA.
Bƣớc 3
- Trƣớc tiên ta phải hòa tan đối chứng dƣơng và đối chứng âm với cùng một thể
tích nƣớc là 1ml
- Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất (100 µl / giếng) cho vào cột số 1 (substrate).
- Cho 100 µl đối chứng dƣơng vào 2 ô PC (Positive control).
- Cho 100 µl đối chứng âm vào 2 ô NC (Negative control).
- Cho dịch trích mẫu vào (100 µl / giếng). Tổng cộng 135 mẫu sẽ đƣợc cho vào 5
đĩa, mỗi đĩa 27 mẫu, mỗi mẫu 2 giếng theo bố trí ở bảng 3.1.
- Dùng keo trong dán kín mặt đĩa, đem ủ qua đêm trong tủ mát 2 - 8
o
C. Sau đó
đem rửa 3 lần với PBS - Tween.
Trong bƣớc này cần chú ý các điểm sau đây.
- Cần ghi lại chính xác kí hiệu của mẫu tƣơng ứng với số thứ tự của mẫu trên đĩa.
- Thao tác cẩn thận tránh hiện tƣợng nhiễm chéo.
Bƣớc 4

- Pha loãng kháng thể gắn enzyme (Conjugate antibodies) (kháng thể 2) trong
dung dịch đệm theo tỉ lệ cho trong bảng dƣới đây. Kháng thể này đƣợc pha trong đĩa
petri.
Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme
Hóa chất
PVX
PVY
PLRV
Dung dịch đệm 1X
Kháng thể gắn enzyme
10ml
100µl
10ml
100µl
10ml
20µl

- Dùng pipet 8 đầu hút nƣớc cất (100 µl / giếng) cho vào cột số 1 (Substrate).
- Dùng pipet 8 đầu hút kháng thể đã pha loãng vào mỗi giếng từ cột số 2 đến số
11 (100 µl / giếng). Dùng keo trong dán kín mặt đĩa và đem ủ 37
o
C trong 2 giờ. Sau đó
rữa 3 lần với PBS - Tween.



20
Bƣớc 5
Chuẩn bị cơ chất tạo màu: p-NPP (p - nitrophenyl phosphate) có trong kit ở dạng
viên rắn. Ta phải xác định lƣợng cơ chất cần thiết cho sự hiển thị màu. Sau đó đem

những viên này đi nghiền nát ra và cho vào dung dịch đệm với tỷ lệ cho dƣới đây.
Dùng một hủ nhựa nhỏ để hòa tan chất tạo màu và sau đó đổ ra đĩa petri. Dùng pipet 8
đầu, hút 100 µl p-NPP vào mỗi giếng từ cột số 1 đến số 11. Dùng băng keo trong dán
kín mặt đĩa và đem ủ 37
o
C và đọc kết quả.
Bảng 3.4. Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu
Hóa chất
PVX
PVY
PLRV
Dung dịch đệm 1X
p - NPP (2 viên 5 mg)
10 ml
5 mg
10 ml
5 mg
10 ml
5 mg
Bƣớc 6
Đọc kết quả bằng máy đọc của hãng Bio - Rad với bƣớc sóng 405 nm tại các thời
điểm 30 phút, 1giờ sau khi ủ với chất tạo màu.
OD mẫu = OD đọc (thô) – OD trung bình của các giếng có cơ chất (Substrate).
OD mẫu so với ngƣỡng (ngƣỡng = hai lần trung bình OD của đối chứng âm).
POS: Kết quả dƣơng tính-nhiễm bệnh khi OD của mẫu vƣợt quá ngƣỡng.
NEG: Kết quả âm tính – Không nhiễm bệnh khi OD của mẫu dƣới ngƣỡng.
Bên cạnh đó kết quả cũng có thể đƣợc đánh giá bằng mắt thƣờng thông qua sự
đổi màu của các giếng:
- Nếu màu đậm tƣơng đƣơng hoặc cao hơn so với đối chứng dƣơng: Đánh giá
nhiễm bệnh

- Nếu giếng không màu tƣơng đƣơng hoặc thấp hơn so với đối chứng âm: Đánh
giá không nhiễm bệnh.
3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR
Các mẫu sau khi đƣợc kiểm tra bằng kỹ thuật ELISA sẽ đƣợc chọn ra để thực
hiện tiếp phản ứng RT-PCR. Trong đề tài này chúng tôi chỉ thực hiện phản ứng RT-
PCR trên đối tƣợng virus PLRV.
Tiêu chuẩn chọn mẫu để thực hiện RT-PCR
- Dƣơng tính.
- Trị số dƣơng tính từ máy đọc phải cao.


21
- Triệu chứng đƣợc quan sát phải đặc trƣng và biểu hiện ra ngoài.
- Mẫu đƣợc bảo quản tốt (còn tƣơi).
Dựa trên những tiêu chí trên, ta chọn ra đƣợc 5 mẫu đại diện cho 5 phƣờng tại
thành phố Đà Lạt
- Phƣờng 5: Mẫu 148
- Phƣờng 8: Mẫu 97
- Phƣờng 9: Mẫu 45
- Phƣờng 11: Mẫu 92
- Phƣờng 12: Mẫu 10
Kỹ thuật RT-PCR đƣợc sử dụng là 2 bƣớc (two steps), tức là gồm giai đoạn tổng
hợp cDNA (Reverse) và giai đoạn khuếch đại cDNA (PCR). Virus PLRV đƣợc phát
hiện dựa trên một đoạn gen có kích thƣớc 336 bp, mã hóa cho phân tử protein vỏ. Quá
trình thực hiện phải qua 2 giai đoạn: Ly trích RNA, tổng hợp và khuếch đại cDNA nhờ
phản ứng RT-PCR.
Giai đoạn 1: Ly trích RNA
Quá trình ly trích RNA đƣợc thực hiện theo hƣớng dẫn của bộ kit ly trích RNA
(The Aurum total RNA kit). Tuy nhiên để thực hiện đúng yêu cầu ta phải chuẩn bị
trƣớc một số dụng cụ và hóa chất sau:

- Nƣớc phải đƣợc xử lý với DEPC để khử RNase. Cối chày phải đƣợc hấp khử
trùng sau khi đã đƣợc tráng nƣớc chƣa khử DEPC.
- Đầu tip, eppendoff phải đƣợc xử lý sao cho đảm bảo vô trùng và không còn sự
hiện diện của enzyme phân hủy RNA. Tất cả phải đƣợc chuẩn bị trƣớc khi ly trích một
ngày.
*Quy trình ly trích
Thực hiện theo chỉ dẫn của bộ kit. Lƣu ý, một số hóa chất không đƣợc cung cấp
cùng với kit nên ta phải chuẩn bị riêng. Ta phải chuẩn bị
- Polyvinyl pyrolidone (PVP) 2%
-Tris base pH = 7,5
- Ethanol 70%, 100%
- β - mercaptoethanol
- Pha DNase I từ dạng bột thành dạng lỏng
- Pha low stringency