Luận văn : Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire part 4 potx

28
 Khi chọn qui trình xử lý enzyme giới hạn không những căn cứ vào hiệu quả của
việc cắt mà còn căn cứ vào hiệu quả kinh tế của việc sử dụng enzyme và hoá
chất
Xác định sự hiện diện của gen PRLR
 Tiến hành phản ứng PCR với các mẫu DNA đã đƣợc ly trích
 Tiến hành điện di sản phẩm PCR với nồng độ gel 1,5 %, 100 V, 250 mA, trong
30 phút.
o Qui trình điện di đƣợc tiến hành nhƣ sau :
Cân 0,6 g agarose LMP (low melting agarose) cho vào bình chứa
40 ml dung dich TBE 0,5X
Tiến hành đun agarose trong bồn nhiệt (70
o
C) cho đến khi tan hết.
Để nguội ở nhiệt độ phòng cho đến khi nhiệt độ gel bằng với nhiệt độ
phòng là đƣợc
Đặt lƣợt vào khay đổ gel, tiến hành đổ gel sao cho tránh bọt khí
Để nguội khoảng 2 giờ đến khi gel cứng hoàn toàn, rút lƣợt ra
Cho gel vào bồn điện di chứa dung dịch TBE 0,5X sao cho dung
dịch này ngập miếng gel khoảng 1 – 1,5 cm
Cho DNA vào giếng : Trộn 8 l với loading dye trên giấy nhôm
hoặc giấy parafin dùng pipet bơm vào các giếng.
Điều chỉnh các thông của bồn điện di : 100 V, 250 mA, trong 30
phút.
Nhuộm gel với ethium bromide trong 30 phút
Đọc kết quả điện di sản phẩm PCR
 Thống kê kết quả phản ứng PCR thành công và kết luận tỉ lệ phần trăm xuất
hiện của gen PLRL
Xác định tần số xuất hiện của các kiểu gen PRLR

 Tiến hành phân cắt enzyme giới hạn AluI các mẫu có phản ứng PCR thành
công.
 Tiến hành điện di sản phẩm phân cắt với loại gel LMP có nồng độ cao (3,5%) để
phân tách các đoạn DNA có kích thƣớc nhỏ (60 bp đến 130 bp) , do gen PRLR sau


29
khi phân cắt tạo thành các đoạn có kích thƣớc dƣới 60 bp. Các thông số của quá
trình điện di: 50 V, 48 mA, 60 phút. Để đo kích thƣớc của các đoạn DNA sau khi xử
lý enzyme khi điện di chúng ta cho thêm ladder 25 bp vào một giếng, dùng ladder
này để đo kích thƣớc của các đoạn DNA.
 Đọc kết quả trên gel trên máy chụp gel (máy Gel doc) nối với máy vi tính sử
dụng phần mềm Quantity one
Gen thụ thể prolactin có 2 alen là A, B. Enzyme AluI cắt sản phẩm PCR thành các
băng có kích thƣớc khác nhau : 124 bp, 110 bp, 90 bp, 79 bp, 76 bp nhƣng có sự xuất
hiện của băng DNA 90 bp là alen A, 110 bp là alen B.

30
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Hiệu quả ly trích DNA từ mẫu máu và mẫu da tai
4.1.1 Mẫu máu
Việc thu thập mẫu máu bị hạn chế do các yếu tố khách quan nhƣ:
Các heo lấy mẫu là các heo nái đang mang thai
Muốn lấy mẫu máu phải dùng các dụng cụ để khớp mỏ heo lại
Thời tiết vào thời gian lấy mẫu rất nóng nực
Đây là các yếu tố rất dễ gây stress dẫn đến sảy thai, đẻ non, các heo con sinh ra
không đƣợc khỏe mạnh Do đó chỉ thu đƣợc 10 mẫu máu của 10 heo nái, còn lại là
các mẫu da tai. Việc lấy mẫu da tai tƣơng đối đơn giản. Tai heo đƣợc bôi cồn sát trùng
sau đó dùng kiềm bấm một mẫu da tai nên không gây ảnh hƣởng nhiều lên heo. Nồng
độ và độ tinh sạch của mẫu DNA thu đƣợc từ các mẫu máu.
Bảng 4.1: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu máu
Mẫu
Tỉ số OD
260 nm / 280 nm

OD

260 nm

OD
280 nm

Nồng độ (ng / µl)
1
1,41
0,17
0,12
6,37
2
1,45
0,16
0,11
6,1
3
1,16
0,12
0,06
5,39
4
1,45
0,21
0,12
8,89
5
1,52
0,09
0,06

3,5
6
1,33
0,13
0,1
4,58
7
1,5
0,15
0,10
5,84
8
1,33
0,20
0,15
7,18
9
1,45
0,12
0,06
5,39
10
1,6
0,09
0,056
3,65
Trung bình
(
X
)

1,42
0,14
0,09
5,51
Độ lệch
chuẩn
± 0,12
± 0,04
± 0,03
± 1,75

Tỉ số OD của các mẫu máu thu đƣợc tƣơng đối thấp, OD
260 nm
/
280 nm
trung bình là
1,42. Mẫu DNA ly trích đƣợc xem là sạch, không tạp nhiễm protein nằm trong khoảng
1,8 – 2 (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1998). Theo nghiên cứu của Lê Thị Thu Phƣơng
(2003) thì độ tinh sạch của mẫu máu cao hơn mẫu da tai. Kết quả này ngƣợc với kết


31
quả do chúng tôi tiến hành. Điều này có thể lý giải do việc ly trích DNA từ máu rất
phức tạp, để thu đƣợc mẫu máu tinh sạch cần tốn rất nhiều thời gian ly tâm với dung
dịch TE 1X để tách các phân tử hemolobin từ máu, các tế bào máu có thể theo dung
dịch tẩy rửa ra ngoài qua quá trình hút rửa. Nồng độ DNA ly trích cao hay thấp phụ
thuộc vào việc pha loãng DNA mẫu bằng dung dịch đệm. Để có mẫu DNA có độ tinh
sạch cao, nồng độ cao trong quá trình ly trích chúng ta cho vào một thể tích dung dịch
đệm tƣơng đối ít. Ví dụ ta có mẫu DNA có tỉ số OD
260 nm / 280 nm

= 1,85 muốn mẫu này có
nồng độ DNA trong mẫu cao thay vì cho vào 200 µl dung dịch đệm TE 1X chúng ta
chỉ cho vào từ 50 – 100 µl dung dịch TE 1X thì nồng độ DNA trong mẫu tăng lên đáng
kể phù hợp với các yêu cầu nghiên cứu.
4.1.1 Mẫu da tai
Độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA của các mẫu da tai tƣơng đối cao, tỉ số OD
260 nm /
280 nm
đạt mức trung bình là 1,82, nồng độ DNA trung bình trên một mẫu là 8,98 ng / µl
tƣơng đối phù hợp với yêu cầu thực hiện phản ứng PCR. Mẫu da tai sau khi giã
nhuyễn đƣợc xử lý proteinase K không cần phải qua các thao tác tẩy rửa phức tạp,
proteinase K phân cắt các phân tử protein có cấu trúc phức tạp thành các đoạn acid
amin ngắn. Các đoạn acid amin này dể dàng bị loại bỏ qua quá trình rửa phenol /
chloroform / isoamyl alcohol. Sau khi ly tâm thì toàn bộ DNA nhân của các mô liên
kết đƣợc giữ lại ở phần nƣớc nổi bên trên, protein và cặn chìm xuống phía dƣới, lấy
nƣớc nổi này và tiến hành thu DNA Đây chính là lý do mà mẫu da tai sau khi ly trích
có độ tinh sạch và hàm lƣợng DNA cao.









32
Bảng 4.2: Tỉ số OD và hàm lƣợng DNA thu đƣợc từ các mẫu da tai
Mẫu
Tỉ số OD

260 nm / 280 nm

OD
260 nm

OD
280 nm

Nồng độ DNA
(ng / µl)
1
1,83
0,11
0,06
4,76
2
1,89
0,15
0,07
6,92
3
1,73
0,92
0,53
38,79
4
1,8
0,64
0,35
27,66

5
1,71
0,12
0,07
5,03
6
1,75
0,21
0,12
8,89
7
1,85
0,17
0,09
7,45
8
1,83
0,25
0,14
10,69
9
1,94
0,21
0,11
9,25
10
1,86
0,26
0,14
11,31

11
1,85
0,15
0,08
6,56
12
1,84
0,08
0,04
3,59
13
1,88
0,12
0,06
5,39
14
1,95
0,22
0,11
9,88
15
1,7
0,16
0,09
6,82
16
1,75
0,21
0,12
8,89

17
1,90
0,12
0,068
5,1
18
1,8
0,09
0,05
3,86
19
1,96
0,10
0,06
4,13
20
1,73
0,15
0,08
6,56
21
1,84
0,16
0,09
6,82
22
1,85
0,16
0,09
6,82

23
1,83
0,08
0,044
3,45
24
1,90
0,37
0,19
16,43
25
1,78
0,10
0,056
4,27
26
1,84
0,17
0,092
7,38
27
1,7
0,09
0,052
3,79
28
1,85
0,16
0,086
6,97

29
1,71
0,13
0,076
5,44
30
1,85
0,07
0,037
3,07
Trung bình
(
X
)
1,82
0,198
0,12
8,47
Độ lệch
chuẩn
± 0,074
±0,174
±0,11
±7,46




33
4.2 Kết quả việc thực hiện phản ứng PCR

4.2.1 Kết quả thực hiện phản ứng PCR theo các qui trình khác nhau
4.2.1.1 Qui trình phản ứng PCR theo nhiệt độ bắt cặp khác nhau
Để tiến hành xác định nhiệt độ bắt cặp nào là tối hảo cho cặp primer đang tiến hành
thí nghiệm chúng tôi tiến hành thực hiện 15 phản ứng trên mẫu da tai cho mỗi qui
trình. Mẫu da tai đƣợc chọn do hàm lƣợng DNA cao, độ tinh sạch tƣơng đối chuẩn,
phù hợp với yêu cầu của phản ứng PCR. Kết quả của hai qui trình phản ứng đƣợc trình
bày ở (Bảng 4.3)
Bảng 4.3: So sánh tỉ lệ thành công giữa hai qui trình nhiệt độ khác nhau
Qui trình PCR
Số mẫu thực hiện
Số mẫu thành công
Tỉ lệ thành công (%)
1
15
10
66,7
2
15
10
66,7
Với kết quả này thì hai qui trình nhiệt độ đều phát hiện tốt sự hiện diện của gen
PRLR. Ở qui trình 1, nhiệt độ bắt cặp thấp hơn, các primer không hoàn toàn bắt cặp
đặc hiệu với trình tự đích, có một số lƣợng nhỏ primer bắt cặp không đặc hiệu, tạo
thành các sản phẩm phụ chuỗi dài và ngắn hơn sản phẩm PCR. Sản phẩm PCR sau khi
chạy điện di xuất hiện những vệt dài sáng (giống nhƣ hiện tƣợng sao chổi) kèm theo
đó là các băng phụ của các đoạn DNA kích thƣớc nhỏ. Ở qui trình 2 nhiệt độ bắt cặp
cao hơn 2
o
C, các sản phẩm PCR thu đƣợc rất đặc hiệu, không xuất hiện vệt dài sáng
nhƣ ở qui trình 1. Nhƣ vậy, qui trình của Vincent khi tiến hành tại điều kiện phòng thí

nghiệm của chúng ta không phù hợp và phải điều chỉnh nhiệt độ bắt cặp tăng lên
khoảng 2
o
C.




34

Hình 4.1: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 1 với nồng độ gel 1,5 %
1, 3, 5, 7: Các giếng có hiện diện sản phẩm PCR, cả 4 giếng này đều
xuất hiện các vệt sáng dài
2, 4, 6, 8: Các giếng không có sự hiện diện sản phẩm PCR

Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình nhiệt 2 với nồng độ gel LMP 1,5 %
Giếng 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR thực hiện theo qui trình 2


1 2 3 4 5 6 7 8
Các vệt dài
sáng
Sản phẩm
PCR
1’ 1 2’ 2 3’ 3 4’ 4
Sản phẩm
PCR
Các băng phụ kích
thƣớc nhỏ (hiện tƣợng
dimer – primer)

35
4.2.1.2 Qui trình phản ứng PCR theo nồng độ primer khác nhau
Để tiến hành xác định nồng độ primer thích hợp nhất cho phản ứng PCR phát hiện
gen thụ thể prolactin, chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR trên mẫu da tai.
Mỗi qui trình tiến hành 15 phản ứng. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau (Bảng 4.4):
Bảng 4.4: So sánh tỉ lệ thành công giữa ba qui trình phản ứng PCR theo nồng độ
primer khác nhau
Qui trình PCR
Số mẫu thực hiện
Số mẫu thành công
Tỉ lệ thành công (%)
1
15
0
0
2
15
9
60
3
15
9
60
Qua kết quả ở Bảng 4.4 thì qui trình 2, 3 phát hiện tốt sự hiện diện của gen PRLR.
Qui trình 1 không phát hiện đƣợc sự hiện diện của gen PRLR. Sản phẩm PCR sau khi
điện di và nhuộm gel thì không thấy xuất hiện các băng DNA. Ở qui trình 3 nồng độ
primer cao, primer sau khi bắt cặp vào DNA khuôn còn thừa tạo ra các băng phụ kích
thƣớc nhỏ (hiện tƣợng dimer – primer). Qui trình 2 cho kết quả hoàn toàn nhƣ mong

muốn, các băng DNA xuất hiện rõ ràng, các băng DNA hiện diện rõ ràng. Sản phẩm
PCR của qui trình này có thể dùng xử lý enzyme giới hạn.



36

Hình 4.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 1 với nồng độ gel LMP 1,5 %
Các giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: Không có sự hiện diện sản phẩm PCR

Hình 4.4: Kết quả điện di sản phẩm PCR theo qui trình 2 với nồng độ gel LMP 1,5 %
Giếng 1’, 2’, 3’, 4’: sản phẩm PCR đƣợc thực hiện bởi cặp primer của
Drogemuller đƣợc thực hiện bởi Bùi Thị Trà Mi lớp Chăn Nuôi – Thú Y 27
Giếng 1, 2, 3, 4: Sản phẩm PCR thực hiện theo qui trình 2
1 2 3 4 5 6 7 8
1’ 1 2’ 2 3’ 3 4’ 4
Sản phẩm
PCR theo
qui trình 2