Ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định các kiểu gen thụ thể prolactin trên giống heo Yorkshire

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
….  ….









KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP



NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY
(PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT
ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ





Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2001 – 2005
Sinh viên thực hiện: Vƣơng Hồ Vũ

Thành phố Hồ Chí Minh
tháng 9 / 2005



BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
….  ….









KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ VIRUS TRÊN KHOAI TÂY
(PVX, PVY, PLRV) TẠI ĐÀ LẠT BẰNG KỸ THUẬT
ELISA, RT-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ


















Thành phố Hồ Chí Minh
tháng 9 / 2005
Sinh viên thực hiện:
Vƣơng Hồ Vũ
Giáo viên hƣớng dẫn:
PGS. TS Bùi Cách Tuyến

iii
LỜI CẢM TẠ



Con xin thành kính ghi ơn cha mẹ. Cha mẹ, các em và dòng họ luôn là chỗ dựa
vững chắc về tinh thần và vật chất cho con.
Em vô cùng biết ơn Thầy Bùi Cách Tuyến đã tận tình hƣớng dẫn và truyền đạt cho
em những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian làm đề tài.
Em xin gửi lời cảm ơn đến:
Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ
Môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện thuận lợi cho em trong thời gian học tập
vừa qua.
Ban giám đốc Trung Tâm Phân Tích - Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí
Minh cùng toàn thể các anh chị tại Trung Tâm đã tạo điều kiện thuận lợi tối đa cũng
nhƣ tận tình giúp đỡ em trong thời gian thực tập tốt nghiệp.
Anh Nguyễn Văn Sơn cùng toàn thể cán bộ công nhân viên Chi cục Bảo vệ Thực
vật tỉnh Lâm Đồng đã giúp đỡ em hoàn thành tốt đề tài này.
TS. Bùi Minh Trí, ThS. Trần Nhật Phƣơng cùng Quý Thầy - Cô trong và ngoài
trƣờng đã tận tình giúp đỡ, dạy bảo và trang bị cho em những kiến thức bổ ích.
Em xin chân thành cảm ơn anh Toàn, chị Huệ, chị Phƣơng, chị Hƣng, chị Hà đã hết
lòng giúp đỡ em để em có thể hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp này.
Cảm ơn các bạn trong lớp Công Nghệ Sinh Học K27 đã luôn đồng hành, chia sẻ
vui buồn, động viên và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và làm đề tài.


Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 9 năm 2005
Vƣơng Hồ Vũ

iv
TÓM TẮT KHÓA LUẬN


VƢƠNG HỒ VŨ, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 9 / 2005. “Nghiên
cứu một số virus trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-
PCR và giải trình tự” đƣợc thực hiện từ tháng 3 đến tháng 8 năm 2005 tại Trung tâm Phân
tích Thí nghiệm Trƣờng Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh.
Hội đồng hƣớng dẫn:
PGS. TS Bùi Cách Tuyến
Đề tài thực hiện các nội dung sau:
1. Xác định tỷ lệ nhiễm các loại virus PVX, PVY và PLRV tại 5 phƣờng (5, 8, 9,
11 và 12) trên thành phố Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA.
2. Khuếch đại đoạn gene có kích thƣớc 336 bp mã hóa protein vỏ của virus PLRV
bằng kỹ thuật RT-PCR.
3. Giải trình tự đoạn gene 336 bp của virus PLRV và so sánh với ngân hàng gene
(NCBI) để đánh giá mức độ tƣơng đồng của đoạn gen này.
Kết quả đạt đƣợc
1. Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm virus PVX, PVY và PLRV tại các phƣờng nhƣ sau:
- Phƣờng 5: PVX: 56,25%, PVY: 90,91%, PLRV: 96,97%
- Phƣờng 8: PVX: 17,39%, PVY: 100%, PLRV: 100%
- Phƣờng 9: PVX: 21,21%, PVY: 96,97%, PLRV: 96,97%
- Phƣờng 11: PVX: 41,18%, PVY: 100%, PLRV: 100%
- Phƣờng 12: PVX: 72,73%, PVY:100 %, PLRV: 100%
2. Phát hiện đƣợc virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR.
3. Đã giải đƣợc trình tự đoạn gen 336 bp và cho kết quả tƣơng đồng 100% sau
khi so sánh với trình tự gen của virus PLRV trên ngân hàng gen.

v

MỤC LỤC

PHẦN TRANG
Trang tựa
Lời cảm tạ ............................................................................................................. iii
Tóm tắt .................................................................................................................. iv
Mục lục .................................................................................................................. v
Danh sách các chữ viết tắt .................................................................................... vii
Danh sách các bảng ............................................................................................. viii
Danh sách các hình và biểu đồ .............................................................................. ix

1. MỞ ĐẦU ................................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề ........................................................................................................... 1
1.2 Mục đích ............................................................................................................. 2
1.3 Yêu cầu ............................................................................................................... 2
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................ 3
2.1 Sơ lƣợc về khoai tây và bệnh trên khoai tây ....................................................... 3
2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây ..................... 4
2.2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X) ...................................................... 4
2.2.2 Sơ lƣợc về virus PVY (Potato virus Y) ...................................................... 5
2.2.3 Sơ lƣợc về virus PLRV (Potato leafroll virus) ........................................... 6
2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây ............................................................... 8
2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bên ngoài ............................................................ 8
2.3.2 Phƣơng pháp sinh học ................................................................................ 8
2.3.3 Phƣơng pháp quang phổ ............................................................................. 8
2.3.4 Phƣơng pháp so sánh độ đục của dịch cây ................................................. 8
2.3.5 Phƣơng pháp chiết quang kép .................................................................... 9
2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử .................................... 9
2.3.7 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) ............. 9
2.3.7.1 Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich ............................... 10

2.3.7.2 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA) ............................ 10

vi
2.3.8 Phƣơng pháp RT-PCR ............................................................................. 10
2.3.9 Phƣơng pháp giải trình tự gen .................................................................. 11
2.4 Nghiên cứu trong và ngoài nƣớc về PVX, PVY và PLRV trên khoai tây ....... 12
2.4.1 Nghiên cứu trong nƣớc về virus PVX, PVY và PLRV ............................ 12
2.4.2 Nghiên cứu nƣớc ngoài về virus PVX, PVY, PLRV ............................... 13
3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .............................................. 14
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ................................................................. 14
3.2 Vật liệu nghiên cứu ........................................................................................ 14
3.2.1 Vật liệu dùng trong kỹ thuật ELISA phát hiện PVX, PVY và PLRV .. 14
3.2.2 Vật liệu dùng trong kỹ thuật RT-PCR để phát hiện PLRV ................... 15
3.2.2.1 Vật liệu dùng trong ly trích RNA ................................................. 15
3.2.2.2 Vật liệu dùng trong phản ứng RT-PCR ........................................ 15
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu ............................................................................... 16
3.3.1 Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 16
3.3.2 Phƣơng pháp điều tra và lấy mẫu .......................................................... 16
3.3.3 Phƣơng pháp phát hiện PVX, PVY và PLRV ....................................... 17
3.3.3.1 Phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kĩ thuật ELISA ......... 17
3.3.3.2 Phát hiện virus PLRV bằng phƣơng pháp RT-PCR .................... 20
3.3.3.3 Giải trình tự trực tiếp đoạn gen của virus PLRV .......................... 25
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................... 27
4.1 Tình hình canh tác khoai tây tại Thành phố Đà Lạt ...................................... 27
4.2 Kết quả phát hiện virus PVX, PVY và PLRV bằng kỹ thuật ELISA ............ 27
4.2.1 Kết quả kiểm tra ELISA tại các phƣờng ............................................... 27
4.2.2 Kết quả ELISA theo từng giống ............................................................ 29
4.2.3 Kết quả ELISA theo từng thế hệ ........................................................... 30
4.2.4 Kết quả ELISA theo tháng tuổi ............................................................. 30
4.3 Kết quả RT-PCR ............................................................................................ 31

4.4 Kết quả giải trình tự ....................................................................................... 34
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................................... 37
6. TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 40


vii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT



- cDNA: Complementary Deoxyribonucleotide acid
- ctv: Cộng tác viên
-ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate
- DEPC: Diethyl pyrocarbonate
-dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate
- M-MLV: Moloney murine leukemia virus
- PBS-T: Phosphate – buffered saline with tween 20
- PLRV: Potato leafroll virus
- p-NPP: p - nitrophenol phosphate
- PVP: Polyvinylpyrrolidone
- RNA: Ribonucleic acid
- RT-PCR: Reverse transcriptase – Polymerase chain reaction
- PVX: Potato virus X
- PVY: Potato virus Y
- VPg: Protein linked genome

viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG


TRANG
Bảng 3.1 Số mẫu thu thập từ 5 phƣờng thuộc TP.Đà Lạt ....................................... 17
Bảng 3.2 Tỷ lệ pha loãng kháng thể ....................................................................... 18
Bảng 3.3 Tỷ lệ pha loãng kháng thể gắn enzyme ................................................... 19
Bảng 3.4 Tỷ lệ pha loãng cơ chất tạo màu .............................................................. 20
Bảng 3.5 Thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA ....................... 23
Bảng 3.6 Thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA ................. 24
Bảng 4.1 Tỷ lệ nhiễm PVX ,PVY, PLRV tại các phƣờng ...................................... 28
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm kép các virus PVX ,PVY, PLRV ........................................ 29
Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo giống ......................................... 29
....
Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng thế hệ ................................ 30
Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng tháng tuổi ......................... 30
....
Bảng 4.6 Kết qủa thành phần hóa chất cho một phản ứng tổng hợp cDNA ........... 31
Bảng 4.7 Kết qủa thành phần hóa chất trong một phản ứng khuếch đại cDNA ..... 32

ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ


TRANG
Hình 2.1 Hình thái của virus PVX ............................................................................... 5
Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX...................................................................... 5
Hình 2.3 Hình thái virus PVY ................................................................................................ 6
Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY...................................................................... 6
Hình 2.5 Hình thái virus PLRV .............................................................................................. 7
Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá ............................................................................ 7
Hình 2.7 Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR .................................................................. 11
Hình 4.1 Kết quả điện di ............................................................................................ 33
Hình 4.2 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Sense primer ............................................... 34
Hình 4.3 Kết quả giải trình tự dạng peak bằng Antisense primer ........................................ 34
Hình 4.4 So sánh kết quả giải trình tự từ 2 primer ............................................................... 35
Hình 4.5 Trình tự sợi Sense của đoạn cDNA mã hóa cho protein vỏ của PLRV ..... 36
Hình 4.6 Kết quả so sánh trình tự sản phẩm RT-PCR của PLRV trên ngân hàng gen .... 36

Biểu đồ 4.1 So sánh tỷ lệ nhiễm PVX, PVY và PLRV theo từng phƣờng ................ 28
Biểu đồ 4.2 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa hai giống 06 và 07 ................................ 29
Biểu đồ 4.3 So sánh tỷ lệ nhiễm bệnh giữa các thế hệ ............................................. 29
Biểu đồ 4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm giữa các lứa tuổi .................................................... 31





1
PHẦN 1. MỞ ĐẦU


1.1 Đặt vấn đề
Khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong những nguồn thực phẩm quan
trọng nhất của con ngƣời (xếp thứ năm trong các loại thực phẩm chính trên thế giới
sau lúa mì, gạo, bắp và đại mạch ).
Tuy nhiên trở ngại lớn nhất trong việc phát triển cây khoai tây là bệnh hại trong
đó bệnh do virus là vô cùng nghiêm trọng. Khoai tây có thể bị nhiễm hơn 30 loại virus
khác nhau, phổ biến nhất và nguy hại nhất là các loại virus PVX (Potato virus X),
PVY (Potato virus Y) và PLRV (Potato leafroll virus) với các triệu chứng khảm, cuốn,
đốm, nhăn nheo và hoại tử trên lá. Sản lƣợng khoai tây bị thiệt hại nghiêm trọng khi bị
tạp nhiễm cùng lúc nhiều loại virus. Năng suất khoai tây có thể giảm tới 80% khi bị
nhiễm tổ hợp PVX, PVS và PLRV (Salazar 1982).
Ở nƣớc ta, khoai tây đƣợc trồng chủ yếu vào vụ đông ở đồng bằng Sông Hồng,
các tỉnh phía Bắc (sản xuất 85% khoai tây của Việt Nam) và trồng quanh năm ở Đà
Lạt (chiếm 15% sản lƣợng) với các loại giống chủ yếu nhƣ 06 và 07. Mặc dù vậy,

nhận thức của nông dân cũng nhƣ những nghiên cứu về bệnh virus và thiệt hại do bệnh
virus trên khoai tây còn rất hạn chế. Do đó việc chẩn đoán nhanh, chính xác nhằm đƣa
ra những biện pháp phòng trừ thích hợp để hạn chế tối đa những thiệt hại do bệnh gây
ra là hết sức cần thiết.
Do đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn, đòi
hỏi nhiều dụng cụ và trang thiết bị hiện đại mới thực hiện đƣợc. Ngày nay cùng với sự
phát triển nhanh chóng và hỗ trợ đắc lực của công nghệ sinh học đặc biệt là sinh học
phân tử với các kỹ thuật chẩn đoán nhƣ ELISA, RT-PCR, Sequencing, đã tạo điều kiện
thuận lợi cho công tác nghiên cứu, chẩn đoán cũng nhƣ phòng trừ bệnh virus trên
khoai tây.
Xuất phát từ thực tế trên chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số virus
trên khoai tây (PVX, PVY, PLRV) tại Đà Lạt bằng kỹ thuật ELISA, RT-PCR
và giải trình tự”




2
1.2 Mục đích
- Phát hiện các loại virus (PVX, PVY, PLRV) trên khoai tây tại thành phố Đà Lạt
bằng kỹ thuật ELISA.
- Phát hiện virus PLRV bằng kỹ thuật RT-PCR.
- Giải trình tự đoạn gen có đƣợc sau khi thực hiện phản ứng RT-PCR để xác định
nguồn gốc của đoạn gen này.
1.3 Yêu cầu
- Thực hiện phản ứng ELISA để kiểm tra các mẫu thu thập từ năm phƣờng trên
địa bàn thành phố Đà Lạt.
- Thực hiện phản ứng RT-PCR với mẫu có kết quả dƣơng tính với virus PLRV.
- Lấy sản phẩm RT-PCR của virus PLRV đi giải trình tự và so sánh với ngân
hàng gen.

3
PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lƣợc về khoai tây và bệnh trên khoai tây
Khoai tây vừa là lƣơng thực vừa là thực phẩm có giá trị. Ở nhiều nƣớc Âu, Mỹ,
khoai tây đƣợc sử dụng nhƣ là một lƣơng thực chính sau lúa mì: 23 - 30% sản lƣợng
khoai tây đƣợc dùng để ăn; còn ở những nƣớc khác nhƣ châu Á thì khoai tây đƣợc sử
dụng nhƣ là một loại thực phẩm hoặc là lƣơng thực phụ.
Khoai tây có nguồn gốc ở Nam Mỹ thuộc các nƣớc Chi Lê, Pêru, Braxin, Bôlivia,
trên các miền núi có khí hậu mát và ẩm. Hiện nay, ở những nƣớc này vẫn còn tìm thấy
những loài khoai tây hoang dại. Tuy nhiên khoai tây đƣợc trồng đầu tiên ở các nƣớc
thuộc Châu Âu. Năm 1561, khoai tây đƣợc trồng sớm nhất tại Tây Ban Nha, giống lấy

từ Pêru.
Ở Việt Nam, khoai tây đƣợc trồng khoảng 100 năm nay (cùng với bắp cải, cà
chua, cải bông). Những nơi trồng khoai tây sớm nhất là Thƣờng Tín (Hà Đông), Từ
Sơn (Hà Bắc), Tú Sơn (Hải Phòng), ngoại thành Hà Nội với sản lƣợng chiếm 85% sản
lƣợng khoai tây của Việt Nam. Ở Đà Lạt khoai tây đƣợc trồng quanh năm và chiếm
15% sản lƣợng. Vấn đề quan trọng cần lƣu ý trong việc phát triển cây khoai tây là
bệnh hại, đặc biệt là những bệnh do virus gây ra.
Khoai tây có thể bị đơn nhiễm hoặc tạp nhiễm khoảng 30 loại virus, chủ yếu là
Luteoviruses (PLRV), Potyviruses (PVY, PVA, PVV), Potexviruses (PVX) và
Carlaviruses (PVM, PVS). Khoảng 50% số virus này sống kí sinh bắt buộc trên khoai
tây, số còn lại thì có thể sống trên các loại cây khác. Các virus này có tính thích nghi
cao và lây nhiễm dễ dàng thông qua củ bị nhiễm cũng nhƣ các yếu tố lan truyền khác.
Virus và bệnh virus là một trong những nguyên nhân ức chế sự phát triển của
khoai tây dẫn đến sự giảm sút về năng suất và chất lƣợng. Những bệnh do virus
thƣờng khó phát hiện hơn các bệnh do vi khuẩn và nấm. Khi cây bị bệnh sẽ có các
triệu chứng khác nhau nhƣ dạng khảm, đốm, xoắn lá, lá nhăn nheo và hoại tử.
Bệnh thƣờng gây thiệt hại nặng khi bị nhiễm nhiều loại virus cùng lúc (ví dụ
năng suất có thể giảm 80% khi nhiễm cùng lúc virus PVX và PLRV (Salaza, 1982) và
chịu ảnh hƣởng của môi trƣờng canh tác. Một nghiên cứu tại Nigeria cho biết có
khoảng 50% số mẫu nghiên cứu bị nhiễm cùng lúc PVX, PVY, PLRV và PVS.


4
Khi nhiễm nhiều virus thì bên cạnh việc các virus tác động tổng hợp còn ảnh
hƣởng đến khả năng đề kháng với mầm bệnh khác. Ví dụ: Khi đã bị nhiễm PVX và
PVY trƣớc đó thì tính kháng với PLRV giảm (Jayasinghe và ctv, 1989), tăng tính mẫn
cảm với bệnh thối (Karla và ctv, 1989).
Các kết quả nghiên cứu cho thấy có khoảng trên 20 loài rệp và côn trùng có thể là
vectơ truyền bệnh virus trên khoai tây, trong đó chủ yếu là loại rệp Myzus persicae
(Watson, 1956).

2.2 Giới thiệu về virus PVX, PVY và PLRV gây bệnh trên khoai tây
2.2.1 Sơ lƣợc về virus PVX (Potato virus X)
- Virus PVX thuộc họ Flexiviridae, giống Potexvirus, là loại virus không có vỏ
bọc, có cấu trúc xoắn đối xứng, sợi virus ngoằn ngoèo, dài 515 nm, đƣờng kính 13 nm
(Brandes, 1964). Virus này có acid nucleic là một phân tử RNA (
+
ssRNA: +single
strand RNA) trọng lƣợng phân tử là 2,1*10
6
, chiếm 6% trọng lƣợng virus (Huisman và
ctv, 1988), chứa khoảng 6435 base, có đuôi 3’ là poly A (Huisman và ctv, 1988), phần
trăm về số mole tƣơng ứng giữa các nucleotide G, A, C và U là 22%, 32%, 24% và
22% (Knight, 1963).
- PVX có vỏ protein có trọng lƣợng 30.000 dalton, chiếm gần 94% trọng lƣợng
virus (Shaw và Larson, 1962). Trọng lƣợng phân tử của virus là 35*10
6
Da
(Reichmann, 1959), thể tích của hạt virus là 0,73 cm
3
/g, hệ số lắng 117,7 S, điểm đẳng
điện PI = 4,4, thời gian sống: 40 - 60 ngày, nhiệt độ bất hoạt trong khoảng 68 - 76
o
C
tùy từng dòng virus. PVX duy trì hoạt lực ở 20
o
C trong vài tuần và trong glycerol hơn
một năm, bị tiêu diệt khi xử lý bằng protease, phenol hay thuốc tẩy, hiệu giá virus: 10
-5
- 10
-6

.


- Với những đặc điểm trên, virus PVX có ký chủ giới hạn trong những cây thuộc
họ cà (Solanaceae) và một số loại cây có quan hệ thân thuộc nhƣ Amaranthaceae và
Chenopodiaceae.
- Khi bị nhiễm virus PVX thì thƣờng biểu hiện triệu chứng nhẹ, ngầm, không
thấy biểu hiện trên lá hoặc không tác động rõ ràng trên cây khỏe, tạo ra những đƣờng
vằn hoặc là vết hoại tử nhăn nheo ở giữa các gân lá, có thể làm thiệt hại năng suất từ
10 – 20% tùy theo giống và phƣơng thức lây nhiễm (chỉ nhiễm PVX hoặc tạp nhiễm
các loại virus khác). Bệnh chủ yếu lây nhiễm qua tiếp xúc với cây bệnh hoặc qua củ
giống chứ không do rệp. Đây là điểm khác biệt giữa virus PVX với PVY và PLRV.


5
- Các biện pháp phòng trừ nhƣ dùng củ giống sạch bệnh, đốt cây bị nhiễm, giới
hạn di chuyển trong phạm vi ruộng bị nhiễm thƣờng đƣợc sử dụng để hạn chế sự lây
nhiễm của virus PVX.








2.2.2 Sơ lƣợc về virus PVY (Potato virus Y)
- Virus PVY thuộc họ Potyviridae, giống Potyvirus, gồm có ba dòng chính là
PVY
O

(phổ biến nhất), PVY
N
(gây hoại tử gân lá thuốc lá) và PVY
C
(gồm cả potato
virus C, gây vết sần sùi trên lá), là nhóm virus hại thực vật lớn nhất, dạng sợi, xoắn
ngoằn ngoèo, không có vỏ bọc, dài 730 nm, rộng 11 nm, đƣờng kính 3,3 nm (Varma và
ctv. 1968).
- Cấu trúc acid nucleic của virus PVY là sợi đơn RNA (
+
ssRNA : + single strand
RNA) có trọng lƣợng phân tử là 3,1*10
6
chiếm 5,4 - 6,4% trọng lƣợng virus (Stace-
Smith và Tremaine, 1970), có đuôi 3’ là poly A, đầu 5’ có một VPg (protein liên kết
với genome). Kích thƣớc genome là 10,4 kb (Makkouk và Gumpf, 1974).
- Vỏ protein của virus PVY có trọng lƣợng 34.000 dalton chiếm 93,6 - 94% trọng
lƣợng virus, hệ số lắng của virus là 145 S (Huttinga, 1975), nhiệt độ bất hoạt: 50 -
62
o
C, thời gian tồn tại trong ống nghiệm là 7 - 50 ngày ở nhiệt độ 18 - 22
o
C, hiệu giá
virus từ 10
-2
- 10
-6
.
- Với các đặc điểm trên PVY có thể gây nhiễm khoảng 120 loài. Trong đó có
thuốc lá, cà độc dƣợc (Datura stramonium) và Tinantia erecta với các triệu chứng từ

nhẹ đến hoại tử lá nặng. Thông thƣờng PVY
O
, PVY
C
gây bệnh nặng hơn PVY
N

- Dòng PVY
N
phân bố chủ yếu ở Châu Âu, Châu Phi, và Nam Mỹ. gây ra các
triệu chứng chủ yếu nhƣ hoại tử dạng điểm hay lan rộng ở mức độ nhẹ có thể không
phát hiện đƣợc, thƣờng xuất hiện ở giai đoạn muộn của giai đoạn phát triển (ở vụ đầu).

Hình 2.2 Khoai tây bị nhiễm virus PVX

Hình 2.1 Hình thái của virus PVX


6
Những triệu chứng thứ cấp có thể xuất hiện ở vụ sau khi đó triệu chứng chấm lốm đốm
có thể quan sát đƣợc và thƣờng xuất hiện sớm trong mùa.
- Dòng PVY
O
phân bố rộng khắp trên thế giới. Tùy từng loại khoai tây có thể gây
ra hoại tử, chấm lốm đốm hoặc làm vàng lá non, rụng lá và chết trƣớc khi trƣởng
thành. Khởi đầu, hoại tử là điểm hoặc lan tỏa trên lá non, có thể làm cong lá hoặc rụng
lá. Triệu chứng thứ phát là cây lùn, giòn, lá nhăn nheo, nhàu nát. Đôi khi hoại tử xuất
hiện ở tán lá hoặc đỉnh.Virus PVY
O
kết hợp với PVX gây ra hiện tƣợng khảm và nhăn.

- Dòng PVY
C
gây triệu chứng sơ cấp nhƣ hoại tử, lốm đốm, nhăn nheo (hoại tử
thƣờng ở cuống lá, lá, đỉnh), biểu hiện thứ cấp thƣờng xuất hiện vệt chấm, nhăn nheo
hoặc lốm đốm. Hoại tử có thể xảy ra ở củ.
- Để hạn chế sự thiệt hại do virus PVY gây ra, ngƣời ta đƣa ra các biện pháp quản
lý nhƣ sử dụng giống sạch bệnh, sử dụng giống kháng, trồng sớm và loại bỏ cây bệnh.








2.2.3 Sơ lƣợc về virus PLRV (Potato leafroll virus)
- Virus PLRV thuộc họ Luteoviridae, giống luteovirus, có dạng cầu, đƣờng kính
24 nm, phân tử protein vỏ có trọng lƣợng 26 kDa (Smith và Harris, 1990). PLRV là
virus RNA có mang một sợi RNA dƣơng (+) (+ssRNA: + single strand RNA), trọng
lƣợng 6 kDa (Rowhani và Stace Smith, 1979), có mang 1 VPg (protein liên kết với
genome), không có đuôi poly A và chứa sáu khung đọc mở (ORF – Open Reading
Frame) (Van Der Wilk và ctv, 1997). Những khung đọc nằm ở đầu 5’ thì mã hóa cho
các protein trực tiếp từ RNA genome (Matthews, 1991). Protein VPg và một protein
70 kDa (Van Der Wilk và ctv, 1997) đƣợc mã hóa bởi khung đọc đầu tiên (ORF1)
(Gorbalenya và ctv, 1989). Khung đọc thứ hai (ORF0) mã hóa cho một protein 28 kDa
chƣa rõ chức năng nhƣng khung đọc thứ ba (ORF1/2) đƣợc cho là mã hóa cho protein
108 kDa liên quan đến sự sao chép của virus (Koonin, 1991; Mayo và Ziegler – Graff,

Hình 2.4 Khoai tây bị nhiễm virus PVY

Hình 2.3 Hình thái virus PVY


7
1996). Ba trong số sáu khung đọc này nằm ở đuôi 3’ và mã hóa cho phân tử protein vỏ
(CP: coat protein) 23 kDa (ORF3), protein di chuyển 17 kDa (MP (P4) - Movement
protein) (ORF4 nằm trong gen mã hóa protein vỏ nhƣng có khung đọc khác)
(Sokolova và ctv, 1997) và một protein 56 kDa liên quan đến sự tƣơng tác giữa virus
và vectơ rệp (ORF5) (Chay và ctv, 1996). Còn hai khung đọc khác ở đuôi 3’ là ORF6
và ORF7 đã đƣợc phát hiện nhƣng chƣa hiểu đƣợc chức năng của chúng (Ashoub và
ctv, 1998).
- Virus PLRV bị bất hoạt ở 70
o
C trong 10 phút, hiệu giá virus: 10
-4
, thời gian tồn
tại trong nhựa cây khoảng 4 ngày ở 2
o
C và trong dịch trích từ rệp là 12 đến 24 giờ ở
25
o
C (Murayama), là loại virus chỉ giới hạn ở mô libe của cây (Peter và ctv, 1981;
Bagnall, 1988; Lobenstein và ctv, 1997; Singh và Sing, 1997). Virus PLRV có phổ ký
chủ hẹp, không lây nhiễm qua nhựa cây nhƣng có thể lây nhiễm thông qua khoảng 10
loài rệp nhờ phƣơng thức liên kết bền vững giữa virus và rệp, tồn tại trong nhựa cây
khoảng 4 ngày ở 2
o
C, trong rệp 12 - 24 giờ ở 25
o
C.

- Virus PLRV là tác nhân gây bệnh quan trọng nhất của khoai tây, có ở hầu hết
các nƣớc trên thế giới làm giảm năng suất tới 90%. Những biểu hiện triệu chứng sơ
cấp gây nên bởi sự lây nhiễm ở vụ đầu trên lá nhƣ lá bị cuốn lại ở đỉnh lá đặc biệt
những lá ở gốc có xu hƣớng ở thế thẳng đứng và chuyển màu vàng nhạt, với các giống
khác lá có màu hồng, đỏ hoặc tía. Sự lây nhiễm muộn có thể không rõ triệu chứng,
những giống có độ nhạy cao củ bị thối ở hệ thống mạch. Triệu chứng thứ cấp ở cây
trồng từ củ bị nhiễm bệnh làm lá gốc cuốn tròn, thẳng đứng, cây không phát triển và lá
cuốn tròn trở nên cứng. Ngoài ra các biểu hiện nhƣ xoắn lá, còi cọc, hoại tử mạch libe
và ảnh hƣởng đến sự tích lũy carbonhydrate trong lá cũng hiện diện trên khoai tây bị
nhiễm virus PLRV. Virus PLRV có thể ảnh hƣởng đến chất lƣợng thực phẩm (khẩu vị),
đây là một trƣờng hợp ngoại lệ vì rất ít virus ảnh hƣởng đến chất lƣợng thức ăn.
- Để hạn chế những thiệt hại do nhiễm virus PLRV cần chọn cây khỏe, giống
không bị nhiễm virus PLRV, nhổ bỏ cây nhiễm bệnh, phun thuốc trừ rệp, dùng giống
kháng với virus PLRV.




Hình 2.6 Khoai tây bị bệnh cuốn lá




Hình 2.5 Hình thái virus PLRV


8
2.3 Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cây
Với đặc điểm phức tạp của bệnh virus nên việc chẩn đoán gặp nhiều khó khăn và
đòi hỏi những dụng cụ máy móc hiện đại mới thực hiện đƣợc. Những phƣơng pháp

chẩn đoán bệnh virus hiện nay thƣờng dùng là:
2.3.1 Phƣơng pháp chẩn đoán bên ngoài
* Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh
Phƣơng pháp này đơn giản và nhanh chóng nhƣng không phải lúc nào cũng chính
xác, vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết bệnh không phát ra ngoài,
hoặc thời kỳ tiềm phục của bệnh quá dài nên khó phát hiện ngay đƣợc. Một số trƣờng
hợp vết bệnh không rõ ràng.
*Ngoài ra cũng có thể xem tế bào bị bệnh dƣới kính hiển vi để chẩn đoán một số
bệnh virus nhƣ hoa lá thuốc lá có thể nhìn dƣới kính hiển vi thấy trong tế bào lông tơ
lá có những tinh thể virus kết tinh hình lục giác.
2.3.2 Phƣơng pháp sinh học
* Gieo hạt để chờ khi cây mọc có phát bệnh hay không. Phƣơng pháp này thƣờng
dùng trong kiểm dịch thực vật và để kiểm tra bệnh ở hạt giống. Là một phƣơng pháp
tuy đơn giản, dễ làm nhƣng mất thời gian.
* Dùng cây chỉ thị và lây bệnh nhân tạo
Những cây chỉ thị là những cây cùng loại hay khác loại với cây ký chủ nhƣng rất
nhạy cảm đối với bệnh virus và khi lây bệnh nhân tạo virus, trên cây chỉ thị tạo ra vết
bệnh điển hình nhất. Có thể lây bệnh nhân tạo bằng dịch cây muốn chẩn đoán lên cây
chỉ thị, hoặc ghép cành, ghép mắt cây chỉ thị lên cây bệnh. Để chẩn đoán bệnh virus X
và virus Y hại khoai tây ngƣời ta dùng cây chỉ thị Nicotiana glutinosa, Nicotiana
tabacum, Datura tatula, Gomphrena globosa hoặc dùng cà độc dƣợc (Datura
stramomium) làm cây chỉ thị để chẩn đoán bệnh virus hoa lá thuốc lá.
2.3.3 Phƣơng pháp quang phổ
Chủ yếu dựa vào đặc điểm của virus có khả năng hấp thụ tia cực tím do virus có
chứa acid nucleic.
2.3.4 Phƣơng pháp so sánh độ đục của dịch cây
So sánh độ đục của dịch cây bằng máy đo độ đục, hoặc so sánh độ nhớt của dịch
cây bằng bình đo độ nhớt. Phƣơng pháp này chỉ chẩn đoán bệnh virus nói chung, và
chẩn đoán tƣơng đối đúng khi nồng độ virus trong dịch cây khá cao.

9
2.3.5 Phƣơng pháp chiết quang kép
Dùng kính hiển vi phân quang khảo sát dịch cây đang chảy. Phƣơng pháp này chỉ
dùng đối với các virus có hình gậy, còn virus hình cầu không dùng đƣợc.
2.3.6 Phƣơng pháp chẩn đoán bằng kính hiển vi điện tử
Trong nghiên cứu virus, kính hiển vi điện tử tia xuyên đƣợc sử dụng nhƣ một
công cụ rất tích cực để tìm hiểu hình thái và cấu trúc của virus thực vật cũng nhƣ mô
thực vật bị nhiễm bệnh. Ngƣời ta dùng kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 2 - 3 chục
ngàn lần trở lên.
Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dung dịch chứa virus chiết từ lá cây bệnh hay
thông qua làm tinh khiết và cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát trên kính
hiển vi điện tử. Đây là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản nhất.
Có thể dùng kháng huyết thanh khi dùng phƣơng pháp xem trực tiếp để phân biệt
trong trƣờng hợp nghi là mẫu bị lẫn virus khác. Phƣơng pháp này giúp ta xác định
đƣợc hai virus khác nhau trong một mẫu.
Ngƣời ta còn dùng lát cắt cực mỏng bằng máy cắt tiêu bản hiển vi và nhuộm mẫu
đƣợc cắt, sau đó quan sát sự hiện diện của virus trong các tế bào thực vật bị nhiễm
bệnh.
2.3.7 Phƣơng pháp ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Đây là kỹ thuật khá nhạy và đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên hoặc
kháng thể ở nồng độ rất thấp (0,1 ng / ml). So với với các kỹ thuật miễn dịch khác thì
kỹ thuật này rẻ tiền và an toàn hơn mà vẫn đảm bảo độ chính xác. ELISA đƣợc dùng
để xác định nhiều tác nhân gây bệnh nhƣ virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh.
Nguyên tắc của kỹ thuật này dựa trên sự gắn kết đặc hiệu giữa kháng nguyên và
kháng thể, trong đó kháng thể đƣợc gắn với một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích
hợp (thƣờng là nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme sẽ thủy phân cơ chất
thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu giữa
kháng thể với kháng nguyên và thông qua cƣờng độ màu mà biết đƣợc nồng độ kháng
nguyên hay kháng thể cần phát hiện.

Hai kỹ thuật ELISA đƣợc dùng nhiều là kỹ thuật ELISA trực tiếp (direct Double
Antibody Sandwich - ELISA) và ELISA gián tiếp (Indirect ELISA). Các enzyme
thƣờng dùng là β-galactosidaze, glucosidaze, peroxidaze và phosphataze kiềm (Vũ
Triệu Mân, 2003).


10
2.3.7.1 Phƣơng pháp ELISA trực tiếp kiểu Sandwich
Gồm các bƣớc sau
Bƣớc 1: Cố định kháng thể đặc hiệu của virus vào đĩa ELISA.
Bƣớc 2: Cố định dịch cây (có chứa virus cần xác định) vào đĩa ELISA.
Bƣớc 3: Cố định kháng thể có gắn enzyme.
Bƣớc 4: Cho cơ chất nền là cơ chất của enzyme vào đĩa ELISA
Kết quả đƣợc đọc trên máy đọc ELISA (ELISA reader) ở bƣớc sóng 405 nm.
Để cố định màu sắc của đĩa ELISA, bảo quản trong tủ lạnh 4
o
C và cần xem vào
khi khác có thể dùng dung dịch NaOH 3M nhỏ vào mỗi giếng 25 – 30 µl.
2.3.7.2 Phƣơng pháp ELISA gián tiếp (Indirect ELISA)
Kỹ thuật này thƣờng đƣợc dùng để định tính và định lƣợng kháng thể hiện diện
trong mẫu cần xác định. Gồm các bƣớc:
Bƣớc 1: Cố định kháng nguyên lên thành giếng.
Bƣớc 2: Cho tiếp kháng huyết thanh (chứa kháng thể cần kiểm tra) vào.
Bƣớc 3: Thêm cộng hợp kháng kháng thể có gắn enzyme vào.
Bƣớc 4: Thêm cơ chất của enzyme vào để đọc kết quả (Vũ Triệu Mân, 2003).
2.3.8 Phƣơng pháp RT-PCR (reverse transcriptase - polymerase chain reaction)
RT-PCR là một ứng dụng của PCR (Polymerase Chain Reaction) dùng để khuếch
đại các phân tử RNA. Do Taq polymerase không hoạt động trên RNA nên ngƣời ta sử
dụng kỹ thuật phối hợp RT-PCR (Reverse Transcriptase - PCR). Trƣớc hết RNA đƣợc
chuyển thành cDNA (Complement Deoxyribonucleotic Acid) nhờ enzyme phiên mã

ngƣợc từ Mo-MLV (murine leukemia virus) hoặc AMV (avian myeloblastosis virus).
Primer sử dụng trong giai đoạn này có thể là primer ngƣợc của PCR giai đoạn sau
(Antisense primer), có thể là Oligonucleotic dT (để bắt cặp với đuôi poly A của các
phân tử RNA), mà cũng có thể là các hexanucleotide (trình tự gồm 6 nucleotide) bắt
cặp ngẫu nhiên với một trình tự ngắn trên RNA. Sau đó cDNA đƣợc khuếch đại nhờ
Taq polymerase. Ngƣời ta cũng có thể sử dụng Tth DNA polymerase cho cả hai giai
đoạn. Kỹ thuật RT-PCR cho phép nghiên cứu các mRNA tồn tại với hàm lƣợng thấp,
RNA của virus, không thể phát hiện bằng các phƣơng pháp khác nhƣ Northern blot.
Một kỹ thuật mới phát triển - kỹ thuật in situ RT-PCR cho phép khuếch đại các
RNA ngay trên mô và tế bào. Kỹ thuật này có nguyên tắc nhƣ trên, đƣợc tiến hành trên lát
cắt mô, tế bào cố định trên lame, trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt chuyên cho lame.