Luận văn : Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 các nguồn nấm Beauveria basiana có tính độc cao part 1 potx

1
Phần I. MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Cuộc cách mạng khoa học kỹ thuật trong nông nghiệp đã mang lại nhiều thành
tựu to lớn trong đó quan trọng nhất là giảm tỷ lệ đói nghèo trên thế giới nhờ nâng cao
năng suất cây trồng. Mặc dù thuốc bảo vệ thực vật giúp giảm tổn thất do sâu hại (ước
tính mức độ tổn thất do sâu hại nếu không sử dụng thuốc trừ sâu là 83 % ở lúa gạo và
84 % ở bông vải (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long, 2004)) song thuốc trừ sâu cũng
mang lại những bất lợi khó giải quyết như: ô nhiễm môi trường, độc hại cho sức khỏe
con người, mất cân bằng sinh thái và gây tính kháng của côn trùng. Trong những năm
gần đây, với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các nhà khoa học tập
trung nghiên cứu tạo ra các cây trồng chuyển gen mang tính kháng, xem các giống
kháng là thành phần chủ yếu trong hệ thống phòng trừ tổng hợp. Tuy nhiên, những gen
dùng trong công nghệ chuyển gen còn ít, chuyển gen tỷ lệ thành công thấp và vẫn còn
tồn tại những tranh cãi về tính an toàn của cây chuyển gen nên thuốc trừ sâu vi sinh
được coi là giải pháp khả thi, có thể đáp ứng nhanh yêu cầu của con người về một giải
pháp phòng trừ sâu hại an toàn môi sinh và hiệu quả, giúp hạn chế sử dụng thuốc trừ
sâu hóa học. Thuốc trừ sâu vi sinh gồm các sản phẩm từ các loài thiên địch của sâu
như: các loài ăn mồi, ký sinh, nguồn bệnh, trong đó các chế phẩm tạo nên trên cơ sở
các loài nấm chiếm vị trí quan trọng, đặc biệt chế phẩm nấm diệt sâu từ nấm
Beauveria bassiana đã có hiệu lực cao tiêu diệt nhiều loài côn trùng gây hại. Để nâng
cao hiệu quả ứng dụng của nấm này, cần đẩy mạnh các nghiên cứu về sinh học, sinh
lý, sinh thái và mối quan hệ giữa nấm Beauveria bassiana với côn trùng vật chủ.
Trong đó, nhiệm vụ trung tâm của công nghệ sinh học hiện nay khi nghiên cứu các đối
tượng là đọc được chuỗi mã DNA để phân tích bộ genome nhằm tìm hiểu quan hệ di
truyền của các đối tượng nghiên cứu và mối liên hệ giữa genome với tính độc của nấm
nhằm tạo ra các chế phẩm vi nấm có hiệu quả diệt côn trùng cao. Trong phạm vi
nghiên cứu của đề tài, chúng tôi chỉ đọc trình tự vùng ITS1 - 5,8 S - ITS2 của rDNA
để so sánh sự biến đổi trong trình tự giữa các chủng nấm Beauveria bassiana.

2
1.2. Mục tiêu đề tài
Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 các nguồn nấm Beauveria basiana có
tính độc cao và đọc trình tự sản phẩm PCR của nấm làm cơ sở xác định mối liên hệ
giữa tính độc của nấm với những biến đổi trong trình tự vùng ITS - rDNA

1.3. Yêu cầu
Nắm vững nguyên tắc nuôi cấy và nhân sinh khối nấm.
Nắm vững kỹ thuật PCR
Nắm vững nguyên tắc đọc trình tự.

1.4. Nội dung thực hiện
Phân lập thêm một số dòng nấm Beauveria bassiana ký sinh trên côn trùng.
Khuếch đại vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 của các dòng nấm có tính độc cao.
Đọc trình tự vùng gen ITS1 - 5,8 S - ITS2 trực tiếp từ sản phẩm PCR và tiến
hành so sánh với cơ sở dữ liệu của NCBI.

3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana
2.1.1. Vị trí phân loại
Lớp: Deuteromycetes.
Bộ: Moniliales.
Họ: Moniliaceae.
Giống: Beauveria.
Giống Beauveria thường được chia thành 3 loài: Beauveria bassiana,
Beauveria brongniarti, Beauveria alba, trong đó 2 loài đầu là tác nhân gây bệnh côn
trùng (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.2. Đặc điểm hình thái
Theo Nguyễn Ngọc Tú - Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), “Nấm
Beauveria bassiana có bào tử trần hình cầu (đường kính 1 - 4 m) đến hình trứng (1,5-
5,5 x 1,3 m). Sợi nấm có chiều ngang khoảng 3 - 5 m phát triển dày đặt trên môi
trường, mang nhiều cuống sinh bào tử và bào tử. Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng.”
Nấm khi mọc trên côn trùng thường có màu trắng hoặc vàng nhạt, đôi khi hơi sẫm, bề
mặt trơn và có nhiều bột, hiếm khi tập hợp thành bó sợi.
Khi mọc trên môi trường thạch, nấm Beauveria bassiana nhìn chung có màu
trắng, viền khuẩn lạc thường có màu kem hoặc vàng nhạt, thỉnh thoảng có màu đỏ nhạt
(Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Beauveria bassiana tạo rất nhiều bào tử, bào tử thường có hình cầu, hình trứng,
có khi chiều dài lên tới 20 m với 1 m chiều rộng. Các sợi nấm khí sinh mang các giá
bào tử trần ngắn, phồng to 3 - 5 x 3 - 6 m. Các giá bào tử này hoặc tạo thành các

nhánh ở phần ngọn, hoặc trực tiếp tạo thành các tế bào sinh bào tử trần. Các tế bào
sinh bào tử trần thành cụm, được tạo thành từ giá hoặc từ nhánh của giá, hoặc được tạo
thành trực tiếp từ sợi nấm khí sinh hay từ nhánh ngang và ngắn của các sợi nấm này.
Phần gốc của tế bào sinh bào tử trần hình cầu, hình chai 2,5 - 3,5 x 3 - 6 m, phần
ngọn của tế bào dạng cuống hẹp, ngoằn ngoèo hình chữ chi, hoặc ngoằn ngoèo không

4
đều, có răng cưa 1 x 5 - 20 m. Bào tử trần không có vách ngăn, hình cầu hoặc elip,
đôi khi có gốc nhọn, nhẵn 2 – 3 x 2 – 4 m, màu trắng hay vàng nhạt (Nguyễn Ngọc
Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.3. Đặc điểm nuôi cấy
2.1.3.1. Môi trƣờng nuôi cấy
Do có hệ enzyme phong phú (lipase, protease, urease, aspatainase, amylase)
nên nấm này có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường dinh dưỡng với các
thành phần khác nhau. Trong đó môi trường thạch khoai tây hay được sử dụng và khả
năng phát triển của nấm trên môi trường này là tốt nhất (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn
Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.3.2. Điều kiện nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng, hầu như ảnh hưởng tới toàn bộ hoạt động
sống của nấm, mỗi loại nấm chỉ có khả năng phát triển trong một giới hạn nhiệt độ
nhất định. Nhiệt độ thích hợp nhất cho sự nảy mầm, phát triển và tạo bào tử của nấm
Beauveria bassiana là 25 – 30
o
C (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang,
1997).

2.1.3.3. Điều kiện pH
Theo Veliska (1967), giá trị pH môi trường từ 3 - 9 không ảnh hưởng tới sự

phát triển tạo sinh khối của nấm Beauveria bassiana và theo Goral (1970) nấm
Beauveria bassiana thuộc vi sinh vật có khả năng điều chỉnh pH môi trường, pH thuận
lợi cho sự phát triển là 5,7 - 6,0. Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu cho rằng khả năng phát
triển tốt nhất của nấm Beauveria bassiana là 6,2 - 6,3 (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú
và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.4. Điều kiện phân bố
Nấm Beauveria bassiana phân bố rộng khắp. Giống như hầu hết các loại nấm
diệt sâu khác, khi rơi vào một nơi nào đó, chúng đều có khả năng trở thành thành viên
trong sinh quần nơi đó và tự sinh sôi nảy nở tăng lên. Vì là vật ký sinh chuyên hóa

5
rộng nên nấm này có khả năng tồn tại khi thiếu vật chủ chính. Khả năng nhiễm thành
công của nấm với côn trùng là khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm nhiễm khác nhau:
qua lớp cutin, qua đường tiêu hóa, qua đường hô hấp và qua lỗ của thân. Ngoài ra, nấm
Beauveria bassiana còn có khả năng tồn tại trong điều kiện môi trường không thuận
lợi dưới dạng giả hạch nấm (các sợi nấm dinh dưỡng kết lại thành một thể rắn chắc).
Có thể sử dụng rộng rãi nấm Beauveria bassiana trong thực tiễn nông nghiệp vì:
chúng có thể phát triển trên môi trường dinh dưỡng, có thể được chế tạo ở dạng chế
phẩm sinh học, và tiêu diệt một lượng không nhiều các côn trùng có ích (Nguyễn Ngọc
Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Nấm Beauveria bassiana có khả năng phát tán rộng trong thiên nhiên thông qua
các hoạt động phóng bào tử bằng cơ học (chúng có có khả năng bắn bào tử tới khoảng
cách gấp hàng nghìn lần lớn hơn kích thước của chúng), lan truyền nhờ dòng nước,
không khí và côn trùng (một số loài của bộ Collembola, như Lepidocyrtus giúp nấm
Beauveria bassiana di chuyển khá xa) (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương
Giang, 1997).

2.1.5. Độc tố của nấm Beauveria bassiana
Chất diệt côn trùng của nấm Beauveria bassiana là chất chúng tiết ra khi bào tử

nảy mầm. Tên thông thường của độc tố là beauverixin, công thức hóa học C
45
H
57
O
9
N
3
- ciclo (N - metyl - L - phenylalanin - D - - hydroxyizovalery)
3
. Đó là một loại
depxipeptit vòng có điểm sôi 93 - 94
o
C (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương
Giang, 1997).

6

Hình 2.1 Cấu trúc phân tử của beauvericin (F. R. Champlin, 1979)
Tiến trình cấy chuyền Beauveria bassiana qua côn trùng vật chủ sống thì nồng
độ độc tố tạo thành tăng hơn so với Beauveria bassiana phân lập giữ trên môi trường
tổng hợp. Ngoài ra, nồng độ độc tố cao nhất với sâu được tạo thành khi nấm được nuôi
cấy trên chính sâu này. Như vậy, nguồn dinh dưỡng của nấm có ý nghĩa đối với sự
hình thành độc tố chuyên hóa (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang,
1997).
Ngoài ra, mô côn trùng bị nhiễm nấm thì bền vững dưới tác dụng của vi sinh
vật gây thối rữa chứng tỏ nấm này có khả năng tạo ra một số chất trao đổi giống kháng
sinh. Evlachova (1970) đã nghiên cứu tính chất kháng khuẩn của một số nòi nấm
Beauveria bassiana và kết luận rằng phổ diệt khuẩn của chúng khá rộng. Tính chất này
rất có ý nghĩa trong thực tiễn sản xuất (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị

Hương Giang, 1997).

2.1.6. Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng
2.1.6.1. Sự xâm nhập
Các nấm diệt sâu xâm nhập vào cơ thể côn trùng qua toàn bộ vỏ cutincun ngoài
nhờ enzyme phân hủy lớp chitin của cutincun (Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị
Hương Giang, 1997).
Theo Robinson R.K. (1996), sự xâm nhập của nấm diệt sâu qua lớp cutincun
ngoài được thực hiện bằng lực cơ học, còn sự tiến sâu vào lớp cutincun trong thì được
thực hiện nhờ họat động của enzyme do chính nấm tiết ra. Ngoài ra, Robinson R.K.

7
cũng xác nhận rằng các nấm diệt sâu chuyên hóa cao tạo nên trên bề mặt cutincun một
kiểu giác bám phồng lên dạng kim xuyên vào bên trong cuticun của côn trùng. Sự xâm
nhập vào xoang thân côn trùng xảy ra khá nhanh chóng, qua 32 - 48 giờ đã làm đầy cơ
thể côn trùng với những đoạn sợi nấm đơn bào tự do bơi trong huyết tương dẫn đến sự
phá hủy tiếp theo mô thân côn trùng (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị
Hương Giang, 1997).

2.1.6.2. Sự phát triển của nấm tới khi côn trùng chết
Theo Sekhurina J. A. (1964), khi các bào tử chồi của nấm Beauveria bassiana
bắt đầu sinh sôi nảy nở trong huyết tương của bọ rùa thì bọ rùa bắt đầu tê liệt, và sau
khi vật chủ chết thì nấm mọc thành sợi nấm chui vào trong các bắp cơ và khí quản của
côn trùng; các chế phẩm mô bệnh lý nhuộm cho thấy hạch thần kinh bị biến đổi màu
do ảnh hưởng của độc tố (ở giai đoạn đầu của bệnh tê liệt các hạch thần kinh có màu
xanh tím, khi bị nấm ký sinh có màu xanh đỏ đậm trong khi đó màu của hạch thần
kinh ở côn trùng khỏe có màu xanh lá cây) (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn
Cửu Thị Hương Giang, 1997).

Hình 2.2 Quá trình nhiễm nấm vào côn trùng (Scholte E-J, 2004)

2.1.7. Triệu chứng của côn trùng nhiễm nấm
A: sự xâm nhập.
B: lớp cutin.
C: sợi nấm phát triển.
D: sợi nấm hình thành
vách ngăn.
E: túi bào tử hình thành.
F: bào tử động.
G: bào tử noãn.


8
Nhiều công trình nghiên cứu ảnh hưởng của nấm có lợi lên các đối tượng côn
trùng khác nhau đã đưa ra các kết quả mô tả triệu chứng khác nhau:
Làm biến đổi thành phần, hình dạng các nguyên tố enzyme và phản ứng huyết
tương, làm giảm khả năng sinh sản, làm giảm trọng lượng, phá hủy sự hô hấp và phá
hủy chức năng hệ thống nội tiết của côn trùng. Khi nghiên cứu về ảnh hưởng của nấm
Beauveria bassiana lên độ mắn đẻ của bướm Torticidae hại táo, Kondria V.S (1966)
đã đưa ra kết luận rằng việc xử lý nhộng bởi nấm này làm giảm độ mắn đẻ của bướm
rất nhiều. Trong các thí nghiệm nhiễm 5000, 15000, 45000 bào tử nấm Beauveria
bassiana lên các con cái thì số lượng trứng trung bình còn lại không bị hư lần lượt là
59, 47 và 29 so với đối chứng là 71 trứng. Zagae (1963) cho biết độ mắn đẻ của các
con cái bọ cánh cứng nhiễm Beauveria bassiana đã giảm tới 48 % so với đối chứng và
nếu kết hợp với DDT sẽ giảm tới 83 % (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn
Cửu Thị Hương Giang).
Phá hủy chức năng sinh lý của côn trùng. Theo Ferron P. (1967) thì sự nhiễm
nấm trắng và nấm xanh trên sâu Melolontha melolontha sẽ gây ra hiện tượng biến đổi
sinh hóa và giảm lực oxy hóa khử dẫn tới tình trạng hóa melanin trong huyết tương.
Ngoài ra, công trình nghiên cứu của Codaira (1967) cho thấy sự nhiễm nấm vào côn

trùng còn làm thay đổi độ nhớt của huyết tương. Một số các nhà nghiên cứu khác
(Dieuzeide R. 1926, Cordon T.C và Schwartz J.H. 1962) còn thấy các tinh thể được
tạo thành trong huyết tương khi côn trùng bị nhiễm nấm (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc
Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang).
Phá hủy quá trình biến thái và phát triển của côn trùng, cụ thể là các ấu trùng bị
nhiễm nấm không lột xác được (Benz G., 1963). Theo Gosswald K. (1938), nấm
Beauveria bassiana có thể nhiễm tất cả các pha phát triển của Bombyx mori. Theo
Prasertphon (1967), khi nấm B. bassiana nhiễm vào ấu trùng tuổi 4 và 5 của bọ rùa
gây hại thì biểu hiện của ấu trùng bị phá hủy như sau: ấu trùng và rệp non không thể
thoát ra khỏi tầng cutincun cứng và ở mức độ cao hơn thì côn trùng có dạng gù quái dị
(trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).

2.1.8. Các chể phẩm sinh học từ nấm Beauveria bassiana

9
Theo danh mục thuốc bảo vệ thực vật được phép sử dụng ở Việt Nam (quyết
định số 15/2004/QD – BNN ngày 14 tháng 4 năm 2004, các loại chế phẩm nấm
Beauveria bassiana được phép sử dụng gồm có:
Boverit 5,0 x 10
8
bào tử/g (Viện Bảo vệ Thực vật) trừ rầy nâu hại lúa, sâu đo
xanh hại đay, sâu róm hại thông, sâu kèn hại tai tượng.
Biovip 1,5 x 10
9
bào tử/g (Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long) trừ rầy và bọ xít
hại lúa.
Beauverine (Công ty Thanh Sơn Hóa Nông) trừ sâu tơ hại bắp cải, sâu đục quả
hại xoài.
Muskardin (Công ty cổ phần thuốc trừ sâu Cần Thơ) trừ sâu đục thân hại lúa và
ngô.

Bermetent (Công ty hợp danh sinh học nông nghiệp Sinh Thành, Thành phố Hồ
Chí Minh), trừ bọ cánh cứng hại dừa, sâu đục thân, rệp sáp, rầy đen hại mía.
2.2. Tổng quan về ITS - rDNA
2.2.1. Giới thiệu về rDNA và vùng ITS
rDNA là nhóm gen mã hóa rRNA của ribosom, đóng vai trò quan trọng trong
các nghiên cứu quan hệ phát sinh loài. rDNA được quan tâm nghiên cứu vì nó là một
gen có nhiều bản sao và đặc biệt không mã hóa cho protein nào. Các bản sao của gen
nằm liên tiếp trên một locus và liên quan mật thiết tới quá trình tiến hóa. Hơn nữa,
ribosom hầu như tồn tại trong mọi sinh vật và có cùng nguồn gốc tiến hóa. Phần lớn
phân tử rDNA tương đối bảo tồn nên được xem là cơ sở để tìm ra sự tương đồng và
các khác biệt khi so sánh các sinh vật khác nhau. Các primer thiết kế dựa trên những
oligonucleotide có tính bảo tồn cao được sử dụng cho tất cả sinh vật nhằm khuếch đại
các vùng tương đương dùng trong so sánh. Ngoài ra, nhiều primer và probe cũng được
thiết kế dựa trên các vùng không bảo tồn dùng trong phát hiện và định danh vi sinh vật
(Van de Peer và cộng sự, 1996).
Các rDNA 5,8 S, 18 S, và 25 S phiên mã thành các tiền rRNA riêng rẽ, nằm xen
kẽ với các vùng phiên mã bên trong (ITS) và các vùng phiên mã bên ngoài (ETS).
Giữa các nhóm gen gồm nhiều bản sao lập lại là vùng không phiên mã. Có một rDNA
5 S thường không có vị trí cố định và có chiều sao mã ngược với các gen còn lại,
rDNA 5 S thường chỉ có ở nhân, không có ở ty thể của một số loài nấm. Kích thước
của mỗi vùng lập lại nằm trong khoảng 7,7 – 24 kbp (Guarro, 1999).