Luận văn : Nhân giống lan Dendrobium bằng phương pháp gieo hạt in-vitro part 3 doc

Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 18
- Sau đấy quả lan sẽ được cắt gọt 2 đầu, và dùng dao mổ xẻ dọc
quả lan, tách làm 2.
- Dùng dao giữ phần vỏ quả, dùng kẹp lấy hết hột ra một đóa petri.
- Gieo hạt vào môi trường.
- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần, mỗi lần một quả.
d. Chỉ tiêu theo dõi.
Tỷ lệ hạt sống sau khi gieo.
Tình trạng hạt gieo: Xanh.
Trắng.
Hóa nâu.

Download»
Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 19



Hình 3.1: Quy trình khử mẫu.



Download»
Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 20
3.2 Thí nghiệm 2: Tìm môi trường thích hợp để gieo hạt.
a. Mục đích thí nghiệm.
Tìm môi trường khoáng thích hợp để gieo hạt.
b. Môi trường gieo hạt.
- Môi trường MS không bổ sung kích thích tố, ký hiệu M
o
.
- Môi trường MS bổ sung 1ppm BA, ký hiệu là M
1
.
- Môi trường Knudson’C không bổ sung kích tố ký hiệu K
o
.
- Môi trường Knudson’C bổ sung 1ppm BA, ký hiệu K

1
.
c. Bố trí thí nghiệm.
- Các quả lan đã được khử trùng từ thí nghiệm 1, sẽ được gieo
vào 4 loại môi trường thử nghiệm.
- Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 2-4 tuần
- Thí nghiệm được lặp lại 2 lần , mỗi lần 15 chai 100ml.
d. Chỉ tiêu theo dõi.
- Thời gian hạt nẩy mầm.
- Môi trường thích hợp gieo hạt Dendrobium.
















Download»
Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 21
3.3 Thí nghiệm 3: Tạo Protocorm

a. Mục đích thí nghiệm.
- So sánh sự thành lập protocorm trên hai môi trường khác nhau
và bổ sung cùng nồng độ kích thích tố.
- Tìm môi trường thích hợp cho các thí nghiệm về sau.
b. Môi trường nuôi cấy.
- Môi trường MS không bổ sung kích thích tố, ký hiệu M
o
.
- Môi trường MS bổ sung 2ppm BA, ký hiệu là M
2
.
- Môi trường Knudson’C không bổ sung kích tố ký hiệu K
o
.
- Môi trường Knudson’C bổ sung 2ppm BA, ký hiệu K
2
.
c. Bố trí thí nghiệm.
- Những mẫu hạt đã phình to ra, có màu xanh, không nhiễm từ thí
nghiệm 2.
- Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 2-4 tuần nuôi cấy.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 8 chai 100ml.
d. Chỉ tiêu theo dõi
- Thời gian tạo protocorm.
- Môi trường tạo protocorm tốt nhất.
- Tình trạng phát triển của prorocorm.

Download»
Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 22
3.4 Thí nghiệm 4: Nhân protocorm
a. Mục đích thí nghiệm.
So sánh sự nhân protocorm trên cùng một loại môi trường với nồng độ kích
thích tố thay đổi.
b. Môi trường nuôi cấy.
- Môi trường Knudson’C đối chứng không bổ sung kích thích tố
ký hiệu K
0
.
- Môi trường Knudson’C bổ sung BA với nồng độ
1ppm:2ppm:3ppm, ký hiệu là K
1
, K
2
, K
3
.

- Môi trường Knudson’C bổ sung 2ppm BA và IAA với nồng độ
0.1ppm:0.5ppm:1ppm, ký hiệu là K
4
, K
5
, K
6
.
c. Bố trí thí nghiệm.
- Sử dụng các protocorm được tạo thành từ thí nghiệm 3.
- Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 2-4 tuần nuôi cấy.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai 500ml.
d. Chỉ tiêu theo dõi.
- Nhận xét môi trường nhân nhanh protocorm bật chồi tốt nhất:
thời gian ngắn nhất cho cây có chiều cao 2-3 cm và có 2-3 lá.
- Sự tạo thành cây giữa các môi trường.
- Màu sắc và chiều dài lá.
- Thời gian xuất hiện rễ đầu tiên.

Download»
Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 23
3.5 Thí nghiệm 5: Ra rễ
a. Mục đích thí nghiệm.
Khảo sát môi trường thích hợp cho sự ra rễ.
b. Môi trường nuôi cấy.
- Môi trường Knudson’C đối chứng không bổ sung kích thích tố
ký hiệu K
0
.
- Môi trường Knudson’C bổ sung NAA với nồng độ
0.1ppm:0.5ppm:1ppm, ký hiệu là KN
1
, KN
2
, KN
3
.
- Môi trường Knudson’C bổ sung IAA với nồng độ
0.1ppm:0.5ppm:1ppm, ký hiệu là KI
1
, KI
2
, KI
3
.
- Môi trường Knudson’C bổ sung IBA với nồng độ
0.1ppm:0.5ppm:1ppm, ký hiệu là KB
1

, KB
2
, KB
3
.
c. Bố trí thí nghiệm.
- Những cây con có chiều cao từ 2-3 cm và có 2-3 lá được tạo
thành từ thí nghiệm 4.
- Theo dõi và ghi nhận kết quả sau 3-4 tuần nuôi cấy.
- Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, mỗi lần 3 chai 500 ml.
d. Chỉ tiêu theo dõi
- Chiều dài rễ.
- Sự tăng trưởng chiều cao cây.





Download»
Khóa luận tốt nghiệp – 2005 Kết quả – Thảo luận
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 30

PHẦN IV: KẾT QUẢ – THẢO LUẬN

I. Thí nghiệm 1: Khử trùng mẫu.
Quả lan sau khi được khử trùng, gieo hạt vào môi trường nuôi cấy, sau 1 tuần
kết quả ghi nhận được như sau:


Bảng 1: Kết quả khử trùng mẫu bằng Ca(OCl)

2
, sau 1 tuần.

Sống và không nhiễm Chết và không nhiễm Nhiễm NT Số lần đốt
Số lượng Tỷ lệ
(%)
Số lượng Tỷ lệ
(%)
Số lượng Tỷ lệ
(%)
1 1 16 100 0 0 0 0
2 2 10 62,5 6 37,5 0 0

Bảng 2: Kết quả khử trùng mẫu bằng phương pháp đốt, sau 1 tuần.
Mẫu hạt lan được gieo vào môi trường, sau 1 tuần khử trùng, mẫu bắt
đầu có những biểu hiện khác nhau:
- Đối với những mẫu sống và không nhiễm, sau 1 tuần, hạt dần
dần thích nghi với môi trường, bắt đầu chuyển sang màu nâu
vàng mật ong.
- Còn với những mẫu hạt bò ảnh hưởng bởi Ca(OCl)
2
, và nhiệt độ
cao, hạt chuyển sang màu trắng và nâu đục, không phát triển.
Kết quả ghi nhận được ở bảng 1 cho thấy:
- Nồng độ Ca(OCl)
2
7%, thời gian khử trùng là 15 phút tỷ lệ hạt
sống và không nhiễm là 75%, mẫu không bò chết nhưng tỷ lệ
Sống và không nhiễm Chết và không nhiễm Nhiễm N
T

Nồng độ
Ca(OCl)
2

(%)
Thời
gian
(phút)
Số lượng Tỷ lệ
(%)
Số lượng Tỷ lệ
(%)
Số lượng Tỷ lệ
(%)
1 7 15 12 75 0 0 4 25
2 7 20 15 93,75 1 6,25 0 0
3 9 15 16 100 0 0 0 0
4 9 20 10 62,5 6 37,5 0 0
Download»
Khóa luận tốt nghiệp – 2005 Kết quả – Thảo luận
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 31
nhiễm cao (25%). Còn với thời gian khử trùng 20 phút, tỷ lệ hạt
sống khá cao (93,75%), mẫu hoàn toàn không bò nhiễm, nhưng
bò chết (6,25%).
- Khi khử trùng ở nồng độ tăng thì tỷ lệ mẫu bò chết tăng theo và
số mẫu nhiễm giảm dần. nồng độ 9%, thời gian khử trùng là
15 phút, tỷ lệ hạt sống rất cao (100%), mẫu hạt gieo hoàn toàn
không bò nhiễm, không chết. Khi kéo dài thời gian khử trùng 20
phút, thì tỷ lệ mẫu chết tăng cao (37,5%).
Khi ngâm quả lan trong dung dòch Ca(OCl)

2
, phần vỏ bên ngoài tiếp
xúc trực tiếp với dung dòch khử trùng, còn phần hạt bên trong không
bò ảnh hưởng. Khi gieo hạt vào môi trường, hạt có khả năng phục hồi
nhanh và nẩy mầm. Tuy nhiên, nếu tăng nồng độ và kéo dài thời
gian khử trùng, dung dòch sẽ ngấm vào bên trong vỏ quả, nên sau khi
gieo vào môi trường, hạt phục hồi rất chậm và có thể sẽ bò chết (hóa
trắng).
Như vậy, với các nồng độ Ca(OCl)
2
đã được sử dụng trong loạt thí
nghiệm, thì nồng độ 9% trong thời gian 15 phút là thích hợp nhất.
Kết quả ghi nhận được ở bảng 2 cho thấy:
- Khử trùng quả lan bằng phương pháp đốt cồn thì mẫu hạt gieo
hoàn toàn không bò nhiễm. Nhưng nếu tiến hành đốt 2 lần thì tỷ
lệ mẫu chết cao (37,5%), tương đương với phương pháp khử
trùng bằng Ca(OCl)
2
9%, trong thời gian 20 phút.
- Khi đốt một lần tỷ lệ mẫu sống là 100%, tương ứng với khi khử
trùng bằng Ca(OCl)
2
9% trong thời gian 15phút.
Khi nhúng quả lan vào cồn 90
0
và đốt, thì phần vỏ quả bên ngoài sẽ
bò ảnh hưởng trực tiếp của nhiệt độ cao, đồng thời sẽ loại bỏ hoàn
toàn các tác nhân gây nhiễm bên ngoài vỏ. Nhưng nếu tiến hành đốt
2 lần, nhiệt độ cao cùng với thời gian kéo dài sẽ gây ảnh hưởng đến
hạt bên trong, nên khi gieo vào môi trường, mẫu hạt phục hồi rất

chậm, hoặc có thể hóa nâu, không nảy mầm được.
 Như vậy, khi khử trùng quả lan bằng Ca(OCl)
2
9% trong thời gian 15
phút và đốt cồn một lần, tỷ lệ sống, không nhiễm là như nhau. Tuy nhiên,
dùng phương pháp đốt cồn thì hạt gieo phục hồi và nẩy mầm nhanh hơn.
Ngoài ra, phương pháp này còn tiết kiệm nhiều thời gian khử trùng mẫu,
thao tác đơn giản hơn, kinh tế hơn.
Tóm lại: mẫu khử trùng là quả lan Dendrobium còn xanh. Vì mẫu hạt gieo nằm
bên trong, nên nếu tiến hành rửa mẫu kỹ và đốt bằng cồn 1 lần thì có thể loại bỏ
hoàn toàn các tác nhân gây nhiễm. Hạt không bò ảnh hưởng và khi gieo vào môi
trường sẽ phục hồi rất nhanh.

Download»
Khóa luận tốt nghiệp – 2005 Kết quả – Thảo luận
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 32





Download»