Luận văn : Nhân giống lan Dendrobium bằng phương pháp gieo hạt in-vitro part 2 pptx

Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 9


Hình 2.4: Một số dạng hoa đẹp của giống Dendrobium.



Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 10
III. Các phương pháp nhân giống.
3.1 Nhân giống ngoài thiên nhiên.
3.1.1 Nhân giống vô tính.
a. Tách bụi: đây là phương pháp đã được các nghệ nhân sử dụng đối
với các giống lan đa thân như Cattleya, Dendrobium, Cymbidium,
Paphiopelium…ở Cattleya, Dendrobium, và những giống tương tự: ở
mỗi gốc của giả hành thường có ít nhất một mắt ngủ nên có thể tách
mỗi hành giả thành một đơn vò để trồng.
b. Chiết cành: ở Dendrobium thường tạo ra cây con trên giả hành
(Keiki) một cách tự nhiên. Khi các cây con này khá mạnh, có rễ tốt,
có thể tách ra khỏi giả hành để trồng.
3.1.2 Nhân giống hữu tính.
a. Sự thụ phấn: Trong thiên nhiên sự thụ phấn ở lan do côn trùng thực
hiện. Cấu trúc của hoa lan là hoàn toàn để thích ứng cho sự thụ phấn
ấy.
Có hai phương pháp thụ phấn:
- Sự tự thụ phấn: Khi phấn hoa của bông hoa này được rơi vào
nuốm của chính hoa ấy. Điều này hiếm khi xảy ra trong tự
nhiên ở hoa lan vì cấu trúc của bộ phận sinh dục đực và cái ở
hoa lan.
- Sự thụ phấn chéo: Khi phấn hoa ở hoa này được để vào nuốm

của hoa khác của cùng cây hay cùng loài (thường xảy ra trong
thiên nhiên do côn trùng thực hiện), hoặc khác loài, khác giống
(thường do con người thực hiện).
b. Quả lan: Nếu sự thụ phấn có kết quả, thì có thể ngay trong ngày hay
sang ngày hôm sau, các phiến hoa xụ lại nhưng không rụng. Và để
trành sự thụ phấn khác do côn trùng người ta dùng bao nilong trùm
hoa lại, nhưng không buộc kín miệng vì hầm hơi sẽ làm hư trái.
Sau khi thụ phấn, bầu noãn từ từ trương phù to ra thành trái. Mỗi trái
có thể chứa hàng ngàn hay đến cả triệu hột. Khi tr từ màu xanh lục
chuyển sang màu vàng lục thì nên hái trái.
c. Gieo hạt:
Trong thiên nhiên muốn hạt lan nẩy mầm thì hạt lan phải được
nhiễm một loại nấm kí sinh. Người ta đã khám phá ra một số loài
nấm giúp nẩy mầm ở hạt lan, mỗi loài chỉ giúp nẩy mầm một số
giống lan mà thôi.
- Rhizoctonia repens giúp nảy mầm ở Cattleya, Laelia,
Angraecum, Cypripedium (Paphiopedilum).
Download»
Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 11
- Rhizoctonia mucoroides giúp nẩy mầm ở Vanda, Phalaenopsis.
- Rhizoctonia lanugiosa giúp cho hột nẩy mầm ở Oncidium,
Odontoglossum và Miltonoa [16].
3.2 Nhân giống trong phòng thí nghiệm.
Trong phòng thí nghiệm lan Dendrobium được chúng tôi nhân giống bằng
phương pháp gieo hạt in-vitro. Trong thiên nhiên, vì hột lan quá nhỏ, không chứa
chất dự trữ và chỉ có một phôi chưa phân hóa, nên không thể phát triển theo một
phương cách bình thường được và vì vậy mà việc cho hột lan nẩy mầm và phát
triển thành cây lan trưởng thành là vấn đề khó khăn. Người trồng lan đã tìm nhiều
cách gieo hạt nhưng không thành công. Năm 1922, Knudson ở Mỹ, thành công

trong việc thay thế nấm bằng đường ở môi trường thạch để gieo hạt [16]. Phương
pháp này có nhiều ưu điểm như:
- Kết hợp với kỹ thuật lai giống tạo ra nhiều giống lan mới
cung cấp cho thò trường.
- Giúp bảo tồn các loài lan quý, và nhân nhanh số lượng giúp
cho công tác bảo tồn.
IV. Sơ lược về kỹ thuật nuôi cấy mô thực vật.
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác đònh ở
điều kiện vô trùng [5]. Kỹ thuật in vitro dựa trên nguyên lý là tế bào thực vật có
tính toàn thể, nghóa là từ một mô, một cơ quan hoặc một tế bào của bất kỳ bộ phận
nào của cây đều có thể phát triển thành một cây hoàn chỉnh nếu được nuôi trong
môi trường thích hợp [6].
4.1 Điều kiện nuôi cấy tế bào thực vật.
a. Yêu cầu cơ bản nhất của phòng nuôi cấy mô là phải đảm bảo vô
trùng. Khái niệm vô trùng này bao gồm vô trùng môi trường nuôi cấy
và cả sự bảo đảm sao cho mẫu nuôi cấy được hoàn toàn vô trùng.
b. Các yêu cầu cơ bản của kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật:
- Khi thiết lập phòng nuôi cấy mô thực vật phải đảm bảo được
tính liên tục thuận lợi cho các thao tác, các giai đoạn trong
suốt quá trình nuôi cấy mô.
- Đảm bảo được vệ sinh (tính vô trùng) của sản phẩm cuối
cùng.
- Chuẩn bò môi trường đúng cách, chọn đúng môi trường cho
từng loại thực vật và từng giai đoạn nuôi cấy.
- Chọn và xử lý mô thích hợp trước khi cấy [7].
Download»
Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 12
c. Các thành phần cơ bản của môi trường nuôi cấy bao gồm: nước,

muối khoáng (đa lượng và vi lượng), nguồn cacbon, vitamin, chất
điều hòa sinh trưởng, agar (đối với môi trường rắn) [14].
- Nước: nước dùng trong môi trường nuôi cấy là nước cất, hoặc
nước khử ion, tốt nhất là nước cất hai lần từ các máy cất nước
hoàn toàn bằng thủy tinh.
- Đường: tạo nguồn cacbon giúp mô tổng hợp nên cacbohydrat
cho cây mà không phải do quanh hợp của mô cây tạo nên;
đường sử dụng phổ biến là saccarose (1-6%
w
/
v
), glucose (2%

w
/
v
).
- Các muối khoáng đa lượng: nuôi cấy mô thực vật đòi hỏi một
lượng nhất đònh các nguyên tố đa lượng như N, P, K, Ca, Mg,
S, Fe, …
- Các muối khoáng vi lượng có vai trò quan trọng trong đời
sống thực vật. Chúng tham gia vào các quá trình sinh hóa
trong tế bào, tham gia vào trung tâm hoạt tính của enzyme và
vitamin, tăng tính chống chòu của thực vật với các điều kiện
môi trường bất lợi. Các vi lượng thông dụng là Mn, B, Zn, Cu,
Co, I, nồng độ sử dụng trong môi trường rất thấp.
- Vitamins: chủ yếu myo-inositol, acid nicotinic, puridoxin HCl
(B
6
), thiamin HCl (B

1
)…Các vitamin dễ bò hỏng do nhiễm tạo
nên cần giữ ở t
0
< 0
0
C [9].
- Chất điều hòa tăng trưởng: tùy theo từng mục đích nuôi cấy
có thể chọn các nồng độ và tổ hợp các nồng độ và tổ hợp các
chất điêu hòa sinh trưởng phù hợp. Các chất điều hòa sinh
trưởng thường dùng là IAA, NAA, 2,4D, Kinetin, BAP,
IBA…[14]
- Agar(đối với môi trường đặc): là một polisacarit làm từ rong
biển. Agar tan ở 100
0
C và khi nguội sẽ đông đặc lại. Hàm
lượng sử dụng từ 8-10g/l tùy hãng chế tạo[10].
d. Nhiệt độ, ánh sáng và pH ảnh hưởng đến quá trình cấy:
- Nhiệt độ: nhiệt độ của phòng nuôi cấy thường được điều
chỉnh ổn đònh từ 22-25
0
C. ở mỗi tế bào thực vật khác nhau thì
nhiệt độ nuôi cấy cũng khác nhau [5].
- nh sáng: có ảnh hưởng đến quá trình phát sinh hình thái cây
nuôi cấy. Các yếu tố ảnh hưởng bao gồm: cường độ, chu kỳ,
thành phần quang phổ ánh sáng. Cường độ ánh sáng từ: 1000-
2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiều loại mô [5].
- pH: là một yếu tố quan trọng. Sự ổn đònh pH môi trường là
yếu tố duy trì trao đổi các chất trong tế bào. Để điều chỉnh
Download»

Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 13
pH môi trường có thể dùng dung dòch 10% hoặc 1N NaOH
hoặc 1N HCl [14].
4.2 Kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm.
a. Đặc điểm của hạt lan.
Không giống những loại hạt khác, hạt lan rất nhỏ, như hạt bụi và
không chứa nguồn dự trữ thức ăn. Trong tự nhiên, hạt có thể nẩy
mầm nhưng sẽ không phát triển nếu không có sự tác động của nấm
mycorrhizal [22]. Loại nấm này tiêu hóa các vật chất hữu cơ trên cây
chủ hoặc trong đất, chuyển hóa thành các đường đơn giản giúp hạt
lan nẩy mầm và giúp phôi phát triển [23]. Khi hạt lan đã nẩy mầm,
nó sẽ tạo ra một lượng lớn các tế bào không phân hóa được gọi là
protocorm. Nếu tất cả đều tốt, protocorm sẽ tiếp tục trong vài tuần,
vài tháng, thậm chí cả năm tùy loài, cho đến khi đủ lớn để tạo thân
và rễ. các loài lan đất, duy trì mối quan hệ cộng sinh này rất quan
trọng trong suốt giai đoạn đầu tiên của cây, vì protocorm nằm dưới
đất nên không thể tự tổng hợp thức ăn. các loài lan phụ sinh,
protocorm thường xanh, và vì thế nó có thể tự tổng hợp được một ít
thức ăn [22].
b. Khử trùng trái lan.
Việc khử rùng trái lan có thể thực hiện theo hai phương pháp:
- Quả lan sau khi mổ ra, hạt thu được trước khi đem gieo cần
tuyển chọn các hạt chắc, các hạt lép không thụ tinh cần phải
loại bỏ đi bằng cách đem ly tâm trong nước cất; các hạt lan
tốt sẽ lắng phía dưới ống nghiệm, hạt lép nổi lên trên, được
gạn bỏ đi. Các hạt tốt được tiếp tục khử trùng bằng
Hypochlorite de calcium 10%.
Sau đấy, cho hạt lan và nước khử trùng vào ống nghiệm, vừa
đủ phủ kín hạt lan, lắc mạnh, đều và để yên trong vòng 10

phút, sau đó đổ nước khử trùng ra bằng ống hút, và tiếp tục
rửa hạt lan 3 lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng hạt lan đã
khử trùng sẽ được gieo vào các bình chứa môi trường.
- Khi quả lan đã được cắt trên cây, mang vào phòng thí nghiệm,
cần để nơi sạch sẽ, thoáng mát. Nếu chưa gieo hạt ngay thì có
thể giữ quả trong tủ lạnh, trong vòng 3-4 ngày.
Khi gieo hạt, trước tiên quả lan cần cắt bỏ các cuống dài,
đuôi còn sót lại các lá đài, cánh hoa…Dùng bông gòn có tẩm
alcol 70
0
để lau toàn bộ mặt ngoài của quả.
Một khi vào tủ cấy vô trùng, quả lan sẽ được:
- Nhúng vào alcol 90-96
0
, trong 1 phút, hơ nhanh qua ngọn lửa.
- Nhúng vào Hypochlorite de calcium 10%, trong 10 phút, rửa
lại 3 lần bằng nước cất vô trùng.
Download»
Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 14
Sau đấy quả lan sẽ được cắt gọt hai đầu, và dùng dao mổ xẻ dọc quả
lan (mổ hai đường đối diện nhau), tách làm hai quả lan, kế đến dùng
pince và dao mổ để giữ lấy tất cả các hạt có trong hai nửa quả lan,
bằng cách gõ nhẹ lên phần ngoài của vỏ quả. Nếu sự thụ tinh tốt, tất
cả các hạt sẽ có màu vàng và đều rơi xuống một đóa petri dùng để
hứng lấy hạt. Sau đó người ta sẽ dùng muỗng hoặc một dụng cụ inox
dùng để gieo hạt vào các bình chứa môi trường [8].
c. Kỹ thuật gieo hạt trong ống nghiệm: hạt sẽ nẩy mầm trong ống
nghiệm bằng thủy tinh hay bằng nhựa trên môi trường rắn có chứa
đường và các loại chất khoáng cần thiết để hạt nẩy mầm và phát

triển. Đối với lan có hai kiểu nẩy mầm cơ bản: nẩy mầm cần nấm
cộng sinh và nẩy mầm không cộng sinh.
- Trong kiểu nẩy mầm cộng sinh, hạt được gieo với một lượng
nhỏ nấm mycorrhizal thích hợp. Nấm này sẽ phát triển trên
môi trường, bao phủ các hạt nẩy mầm và mối quan hệ cộng
sinh xuất hiện sẽ duy trì sức sống của protocorm cho đến khi
nó tạo ra lá và có khả năng tự dưỡng. Kỹ thuật này được sử
dụng rộng rãi để nhân giống các loại lan đất ở vùng ôn đới.
Kỹ thuật này có lợi thế là môi trường sử dụng rất đơn giản
(một trong những dạng phổ biến chỉ bao gồm bột yến mạch
và một ít dòch chiết nấm men), và cây sinh ra thường khỏe
hơn và có khả năng để kháng với các tác động của nấm tốt
hơn cây đối chứng nẩy mầm không cần nấm. Kỹ thuật này có
một nhược điểm là cần phải có một chủng nấm mycorrhizal
thuần khiết, hoặc quan hệ cộng sinh không phát triển, hoặc
trở thành ký sinh và hạt gieo sẽ chết. Có rất ít nghiên cứu
thực hiện về các loài nấm mycorrhizal ở các loài lan nhiệt đới,
nên kỹ thuật này ít được áp dụng.
- Kiểu nẩy mầm không cộng sinh thường được sử dụng để nhân
giống các loài lan nhiệt đới. Môi trường sử dụng phức tạp
hơn bao gồm các muối khoáng, các chất hữu cơ và đường với
một lượng thích hợp để hạt lan nẩy mầm mà không cần nấm
[22].
d. ng dụng của việc gieo hạt.
- Gia tăng lượng hoa lan trên thò trường
- Nhân giống các loài lan hiếm nhằn nhân nhanh số lượng cả
trong tự nhiên và trong các chương trình bảo tồn.
- Cung cấp cây con để bán, giúp hạn chế sự khai thác cây
hoang dại, kích thích sự quan tâm của công chúng và tạo
nguồn thu ngân sách.

- Kết hợp với kỹ thuật lai giống tạo ra những cây lan khỏe
mạnh có màu sắc đặc biệt [22].
Download»
Khoá luận tốt nghiệp - 2005 Tổng quan tài liệu
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 15
V. Các công trình ngiên cứu gieo hạt lan trong ống nghiệm.
5.1 Trong nước:
Dương Công Kiên và cộng sự nghiên cứu lai tạo và gieo hạt lan
Dendrobium trong ống nghiệm [8].
5.2 Ngoài nước:
Năm 1844, Neumann, một người Pháp làm vườn, đã làm nẩy mầm một số hột
lan bằng cách rải đại các hột lan trên các cục đất ở quanh gốc của các cây lan lớn.
Năm 1899, Noel Bernard, nhà thực vật người Pháp, đã khám phá ra bí mật của
việc nẩy mầm ở hột lan khi ông khảo sát các hột Neottia nidus-avis nẩy mầm tự
nhiên trong rừng. Năm 1904, ông cộng tác với Burgeff để đưa ra phương pháp gieo
hột lan có nhiễm nấm trong chai thạch [16].
Năm 1909, Hans Burgeff đã làm nẩy mầm được Laeliocattleya trên môi trường
dinh dưỡng gồm 0,33% saccarose (đường mía).
Năm 1922, Lewis Knudson đã làm nẩy mầm Cattleya mossiae trên môi trường
Pfefferds 1% saccarose (đường mía) [11].
VI. Mục đích gieo hạt lan Dendrobium trong ống nghiệm.

Hình 2.5: Quả lan Dendrobium.
Các nhà trồng lan không ngừng tìm kiếm các giống lan mới để thõa mãn
sự hiếu kì của mình hoặc có thể đem bán. Có hai cách để có được giống
lan mới. Một là, sưu tập những giống lan hoang dại trong rừng đem về
thuần hóa, tạo các điều kiện nhân tạo giống tự nhiên để cây lan có thể ra
hóa. Phương pháp này gặp nhiều rủi ro do điều kiện môi trường không
thuận lợi cho cây lan phát triển. Hai là, tạo ra những giống lan lai mới,
cây lan lai sẽ mang những đặc tính tốt vựơt trội của cả bố mẹ, có thể

thỏa mãn được nhu cầu của người thưởng thức lan. Tuy nhiên khi hai cây
lan lai với nhau đạt kết quả và tạo trái cần phải kết hợp với phương pháp
gieo hạt trong ống nghiệm để hạt lan có thể nẩy mầm dễ dàng. Có như
vậy mới có thể kiểm tra kết quả của việc lai hai cây lan.
Đối với một số giống lan quý cần phải bảo vệ thì phương pháp gieo hạt
trong ống nghiệm giúp bảo tồn giống, nhân nhanh số lượng cây mà vẫn
đảm bảo được tính ổn đònh di truyền.
Download»
Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 16

PHẦN III: VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP

I. Vật liệu và điều kiện gieo hạt trong ống nghiệm.
1.1 Mẫu quả gieo hạt.
Vật liệu là quả lan Dendrobium lai dài từ 4-5 cm lấy từ cây ngoài thiên nhiên,
tại vườn thầy Dương Công Kiên, quận 12, thành phố Hồ Chí Minh.
1.2 Môi trường nuôi cấy.
Môi trường Knudson C (1946), bổ sung thêm:
- Nước dừa 15%.
- Than hoạt tính 0.5g/l, tùy theo mục đích thí nghiệm.
- Đường 30g/l.
- Agar 8,5 g/l.
- pH = 5.7 – 6.
Môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962), bổ sung thêm:
- Nước dừa 15%.
- Than hoạt tính 0.5g/l, tùy theo mục đích thí nghiệm.
- Glycin 0.5g/l
- myo-Inositol 0.1mg/l
- Đường 30g/l.

- Agar 8,5 g/l.
- pH = 5.5 – 5.7.
Sử dụng chai thủy tinh 100 ml và 500 ml để nuôi cấy.
Tất cả môi trường được hấp khử trùng ở 1atm, 121
0
C trong thời gian 20
phút.
1.3 Điều kiện nuôi cấy.
Thí nghiệm được thực hiện từ ngày 20/01/2005 đến ngày 26/05/2005, tại công
ty Văn Thành Tài, 114 Hồng Hà, Quận Tân Bình, Thành phố Hồ Chí Minh, với các
điều kiện nuôi cấy như sau:
- Nhiệt độ phòng nuôi: 24-28
0
C.
- Cường độ chiếu sáng: 2000-3000 lux.
- Thời gian chiếu sáng: 8 giờ/ngày.
- Ẩm độ trung bình: 60-70%.

Download»
Khoá luận tốt nghiệp – 2005 Vật liệu – Phương pháp
SVTH: Nguyễn Vũ thò Hoàng Uyên Trang 17
II. Hướng đi của đề tài.
Đối với đề tài, chúng tôi hướng mục đích nhân giống lan Dendrobium lai bằng
phương pháp gieo hạt in-vitro nhằm:
- Cung cấp giống lan mới cho các phòng nuôi cấy mô.
- Tạo ra cây con khỏe, sạch bệnh, để trồng ra vườn ươm.
- Kiểm tra kết quả lai.
Với thời gian quá ngắn, từ nguyên liệu ban đầu là quả lan, chúng tôi chỉ có thể
thực hiện được các giai đoạn:
- Khử trùng quả.

- Nhân protocorm.
- Ra rễ.
III. Bố trí thí nghiệm:
3.1 Thí nghiệm 1: Khử trùng quả
a. Mục đích thí nghiệm:
- Tìm phương pháp khử trùng thích hợp.
- Tìm nồng độ Hypochloride calcium Ca(OCl)
2
và thời gian khử
trùng thích hợp đối với quả lan.
- Theo dõi biểu hiện của hạt.
b. Phương pháp và hóa chất sử dụng:
- Phương pháp đốt cồn.
- Phương pháp hóa chất: dùng Ca(OCl)
2
.
c. Bố trí thí nghiệm:
- Mẫu lấy từ thiên nhiên.
- Rữa mẫu dưới nước chảy khoảng 10 phút.
- Rửa mẫu bằng xà phòng pha loãng.
- Rửa lại nhiều lần bằng nước cất.
Chuyển mẫu vào tủ cấy vô trùng.
- Rửa mẫu bằng cồn 70
0
trong 1-2 phút.
- Rửa mẫu lại bằng nước cất vô trùng khoảng 2-3 lần.
- Ngâm mẫu trong Ca(OCl)
2

và thường xuyên lắc mẫu.

- Rửa lại mẫu nhiều lần
bằng nước cất vô trùng
khoảng 3-4 lần cho thật
sạch.
- Nhúng vào cồn 90
0
và hơ nhanh
qua ngọn lửa.
- Nhanh chóng đặt quả lan vào
đóa petri vào đậy nắp lại.
Download»