Luận văn : NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT HIỆN VI KHUẨN Leifsonia xyli subsp. xyli, TÁC NHÂN GÂY BỆNH CẰN MÍA GỐC part 3 pps

21
Chín công nghiệp là khi hàm lượng đường trong cây mía đạt mức thích hợp để
thu hoạch ép đường. Lúc cây mía đang sinh trưởng

hàm lượng đường glucose trong
cây thấp, khi cây sinh trưởng chậm lại phần lớn các sản phẩm đồng hóa do bộ lá tạo
thành chuyển sang dạng đường tích lũy trong thân, hàm lượng đường trong cây tăng
lên nhanh chóng. Quá trình tích lũy đường trong cây mía diễn ra từ dưới lên trên,
lần lượt lóng này đến lóng khác, lóng dưới chín trước lóng trên. Lúc mía sắp chín,
tốc độ tăng hàm lượng đường ở những lóng trên nhanh hơn lóng dưới; do đó, hàm
lượng đường trong ngọn "đuổi kịp" gốc cho đến lúc bằng nhau. Khi hàm lượng
đường của phần thân ngọn tương đương phần thân gốc là đúng độ chín công nghiệp.
Trổ cờ là thời kì chín sinh học của cây mía. Ở nước ta, mía thường trổ cờ từ
tháng 10 (miền Nam) đến tháng 12 (miền Bắc). Trổ cờ thường không trùng với thời
kì chín công nghiệp và có ảnh hưởng không tốt đến nguyên liệu mía cây phục vụ
cho nhà máy đường. Khi mía trổ cờ, thân ngừng sinh trưởng, tỉ lệ đường giảm, tỉ lệ
xơ tăng. Vì vậy, trong sản xuất mía thường tìm cách hạn chế sự ra hoa kết hạt.
2.1.5. Giá trị kinh tế của cây mía
Mía là nguyên liệu chủ yếu để sản xuất đường. Đường là loại thực phẩm cần
thiết trong cơ cấu bữa ăn hàng ngày của nhiều dân tộc trên thế giới. Trong cơ thể
con người, đường mía được chuyển hóa thành glucose và fructose, các loại đường
tham gia vào quá trình oxy hóa để tạo năng lượng cho cơ thể hoạt động. Trung bình
1 kg đường cung cấp năng lượng tương đương 0,5 kg mỡ hoặc 50 - 60 kg rau quả.
Ngoài sản phẩm chính là đường, những phụ phẩm của cây mía gồm:
Bã mía: chiếm 25 - 30 % trọng lượng mía đem ép. Bã mía chứa trung bình 49
% nước, 48,5 % xơ, 2,5 % chất hòa tan (đường). Bã mía có thể dùng ngay làm
nhiên liệu đốt lò hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc. Cao hơn nữa,
từ bã mía có thể làm ra furfural là nguyên liệu của ngành sợi tổng hợp.
Mật gỉ: chiếm 3 - 5 % trọng lượng mía đem ép. Thành phần mật gỉ gồm nước

(10 %), đường saccharose (35 %), đường khử (20 %), tro (15 %). Mật gỉ là nguyên
liệu để chưng cất sản xuất rượu Rhums và cồn công nghiệp (từ 1 tấn mật gỉ có thể


22
sản xuất được 300 lít cồn tinh và 3800 lít rượu). Ngoài ra, mật gỉ còn được sử dụng
để sản xuất các loại men và các loại acid (acid acetic, acid citric).
Bùn lọc: chiếm 1,5 – 3 % trọng lượng mía đem ép, là sản phẩm cặn bã còn lại
sau khi chế biến đường. Bùn lọc chứa 0,5 % N, 1,6 % P
2
O
5
, 0,4 % K
2
O, 3 % protein
thô và một lượng lớn chất hữu cơ. Từ bùn lọc có thể rút ra sáp mía để sản xuất nhựa
xerezin làm sơn, xi đánh giày, bản sáp roneo. Sau khi lấy sáp, bùn lọc được tận
dụng làm phân bón.
Về phương diện nông học, mía là loại cây trồng có khả năng thích ứng mạnh,
có thể trồng trên nhiều loại đất khác nhau, cho phép tận dụng, cải tạo những vùng
đất khó khăn. Tóm lại, mía là cây trồng có khả năng cho sinh khối lớn, lại có khả
năng tái sinh mạnh (trồng một năm thu hoạch được nhiều năm) nên có hiệu quả
kinh tế cao (Đoàn Thị Thanh Nhàn, 1996).
2.2. Các loại bệnh hại trên cây mía
Theo Nguyễn Huy Ước (1994), mía là loại cây trồng một lần nhưng lại có khả
năng cho thu hoạch nhiều vụ, nên đây cũng là một trong những điều kiện thuận lợi
cho nhiều loài sâu bệnh tồn tại và phát triển. Hơn nữa, khi cơ cấu giống mía phong
phú hơn, thời tiết khí hậu có nhiều biến đổi cũng góp phần làm cho dịch bệnh ngày
càng đa dạng hơn. Từ năm 1989 đến nay, thành phần bệnh hại mía trên thế giới và
các tác nhân gây bệnh chưa có gì thay đổi với 126 bệnh gồm: 9 bệnh do virus, 2

bệnh do phytoplasma, 9 bệnh do vi khuẩn, 68 bệnh do nấm, 3 bệnh do thực vật kí
sinh, 2 bệnh do tác động cơ giới và 24 bệnh chưa xác định được nguyên nhân
(Joaquin, 2001) (Trích dẫn bởi Hà Đình Tuấn, 2004). Ở Việt Nam, tình hình nghiên
cứu và khảo sát bệnh trên cây mía không nhiều. Theo kết quả nghiên cứu của Hà
Đình Tuấn (2004) cho thấy vùng nguyên liệu mía Đông Nam Bộ có 3 bệnh do
virus, 5 bệnh do vi khuẩn, 31 bệnh do nấm, 1 bệnh do phytoplasma, 4 bệnh chưa
biết tác nhân và một số bệnh khác do tuyến trùng, thực vật kí sinh, do yếu tố môi
trường và dinh dưỡng gây ra. Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến
được trình bày ở bảng 2.1



23



24
Bảng 2.1. Danh sách các bệnh hại mía quan trọng và phổ biến

Nguồn: Hà Đình Tuấn (2004)

Tên Việt Nam
Tên tiếng Anh
Tác nhân gây hại
I
Bệnh do nấm
1
Bệnh sọc nâu
Brown stripe
Cohliobalus stenospilus Drechs

2
Bệnh mốc sương
Downy mildew
Peronosclerospora sacchri T. Miyake
3
Bệnh đốm mắt én
Eye spot
Bipolaris sacchari shoemaker
4
Bệnh đốm trắng
White speck
Bipolaris sacchari T.C.Lo
5
Bệnh cháy lá
Leaf scorch
Stagonospora sacchari Lo and Ling
6
Bệnh dứa
Pinapple disease
Ceratosystis paradoxa Moreau
7
Bệnh xoắn cổ lá
Pokkah boeng
Fusarium moniliform Sheldon
8
Bệnh thối đỏ
Red rod
Colectotrichum falcatum Went
9
Bệnh rỉ sắt đỏ

Rust
Puccinia melanopcephala H. & P. Syd
10
Bệnh rỉ sắt vàng
Rust orange
P. kuehnii Butl
11
Bệnh than
Smut
Ustilago senaminea Syd
12
Bệnh đốm vàng
Yellow spot
Mycovellosiella koepket
13
Bệnh đốm vòng
Ring spot
Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan
II
Bệnh do vi khuẩn
14
Bệnh gôm
Gumming diease
Xanthomonas camestris pv. Vasculorum
15
Bệnh thân ngọn đâm
chồi
Leaf scald
Xanthomonas alibilineans
16

Bệnh cằn mía gốc
Ratoon stunting
disease
Leifsonia xyli subsp. xyli
17
Bệnh sọc đỏ
Red stripe
Pseudomonas rubrilineans
III
Bệnh do Phytoplasma
18
Bệnh chồi cỏ
Grassy shoot
Chưa rõ
19
Bệnh trắng lá
White leaf
Chưa rõ
VI
Bệnh do virus
20
Bệnh sọc vàng
Chlorotic streak
Chưa rõ
21
Bệnh Fiji
Fiji disease
Fiji disease virus
22
Bệnh khảm

Mosaic
Sugarcane mosaic virus
23
Bệnh đốm sọc
Streak
Sugarcane streak virus
24
Bệnh vàng gân lá
Yellow leaf disease
Sugarcane yellow leaf virus


25
2.3. Sơ lƣợc về bệnh cằn mía gốc
2.3.1. Tác nhân gây bệnh
Bệnh cằn mía gốc xảy ra ở hầu hết các khu vực trồng mía trên thế giới:
Antigua, Argentina, Australia, Bangladesh, Barbados, Belize, Bolivia, Brazil,
Burkina Faso, Cameron, Trung Quốc, Colombia, Congo, Costa Rica, Cuba, Ấn Độ,
Indonesia, Nhật, Malaisia, Mali, Mexico, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam,
(Gillaspie và Teakle, 1989; Davis và Bailey, 2000). Đây được xem là bệnh gây hại
nghiêm trọng nhất tác động đến sản lượng mía trên thế giới, bệnh có thể gây thiệt
hại từ 5 - 15 % sản lượng (Comstock và Lentini, 2005), đôi khi tổn thất lên đến 30 -
50 % tổng sản lượng mía thu được đối với các giống mía nhạy cảm và không có khả
năng kháng (Bailey và Bechet, 1995; Pan và ctv., 1998, Brumbley và ctv., 2006).
Bệnh cằn mía gốc được phát hiện đầu
tiên ở Australia từ năm 1944 - 1945 nhưng
vào thời điểm đó người ta vẫn chưa tìm ra
nguyên nhân. Hughes và Steindl (1955) đã
tìm ra tác nhân gây bệnh và cho rằng đó là
do virus. Năm 1973, một loại vi khuẩn nhỏ

được phát hiện là có liên kết với bệnh cằn
mía gốc (Gillaspie và Teakle, 1989; Teakle
và ctv., 1978) (Trích dẫn bởi Claudia B.
Monteiro-Vitorello và ctv., 2004). Đến năm
1980, Davis và ctv. đã phân lập thành công loại vi khuẩn này từ dịch chiết của cây
bị bệnh trên môi trường nhân tạo.
Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx) là một loại vi khuẩn có kích thước
nhỏ (0,25 - 0,35 x 1 - 4 m, đôi khi dài đến 10 m) (Davis và ctv., 1980), dạng
coryne, hiếu khí và rất khó nuôi cấy do cần nguồn dinh dưỡng phức tạp. Chúng
sống ở các bó mạch gỗ của cây mía gây tắc bó mạch và lây truyền sang cây khác
thông qua vật liệu trồng bị nhiễm bệnh hay các dụng cụ trồng và thu hoạch (Taylor
và ctv., 2003). Ban đầu, loại vi khuẩn này được xếp vào loài Clavibacter do các đặc
Hình 2.3. Vi khuẩn Lxx - tác
nhân gây bệnh cằn mía gốc
(Nguồn: www.leifsonia.lncc.br/
lxxsite/index.php)


26
tính kiểu hình nhưng gần đây đã được thay đổi thành Leifsonia dựa vào các kết quả
phân tích gen rRNA. Cách phân loại này đã được xác nhận bởi Young và ctv.
(2006) (Trích dẫn bởi Brumbley và ctv., 2006).







Vi khuẩn Lxx có dạng thẳng hay gậy mảnh nhưng một vài tế bào lại căng

phình ra ở ngoại biên hay ở giữa tế bào, sinh sản theo hình thức nhân đôi (hình 2.3).
Mesosome thường hiện diện và thỉnh thoảng xuất hiện khi hình thành vách ngăn
(hình 2.4). Cho đến nay, người ta nhận thấy cây mía là kí chủ tự nhiên duy nhất của
Lxx, loại vi khuẩn này kí sinh chuyên tính trên cây mía nhưng không tạo ra các triệu
chứng bệnh đặc trưng (Davis và Bailey, 2000).
2.3.2. Triệu chứng
Thông thường, triệu chứng cằn cỗi và khả năng mọc chồi kém được cho là
hậu quả của sự tắc mạch. Tuy nhiên, Leifsonia xyli subsp. xyli không tạo ra các
triệu chứng bên trong hoặc bên ngoài đáng tin cậy (Brumbley và ctv., 2006). Triệu
chứng nghi ngờ là cây bị cằn cỗi, thấp, đường kính nhỏ, lóng ngắn, số lượng cây
(bụi) ít hơn bình thường. Trong các vụ gốc, cây bệnh sinh trưởng chậm và có thể
chết đối với các giống mẫn cảm cao. Ở các giống mẫn cảm cao, cây bị rũ xuống
Hình 2.4. Sự phân chia của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli đƣợc
phân lập từ dịch chiết nƣớc mía (Nguồn: Brumbley và ctv., 2006)
Chú thích: Có 4 mesosome rõ ràng (3 trong tế bào dài và 1 trong tế bào ngắn).
Đường kính của các tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli đo được là 195 - 220 nm, chiều
dài của hai tế bào gắn với nhau là 2610 nm. Tế bào Leifsonia xyli subsp. xyli không
xuyên qua màng lọc 0,22 m nhưng có thể xuyên qua màng lọc 0,4 m. Các vi khuẩn
hình que này có thể phồng ra ở một đầu làm cho chúng có dạng hình chùy.



27
trong điều kiện thiếu ẩm độ, bị thối ở đỉnh và mép lá. Hệ thống rễ của cây bị bệnh
phát triển kém hơn so với cây khỏe mạnh bình thường.
Bệnh gây ra làm cho các bó mạch ở phía dưới đốt mía bị đổi màu, nhưng triệu
chứng này thường chỉ xuất hiện trong thời gian rất ngắn. Khi chẻ dọc thân mía của
cây bị bệnh có các đốm nhỏ từ màu vàng đến nâu đỏ, dạng dấu phẩy, ngắn và sự đổi
màu này không kéo dài khắp lóng mía như triệu chứng của các bệnh khác (Davis và
Bailey, 2000) (Hình 2.5). Ở một số giống, cây mía non cũng có sự đổi màu từ vàng

đến nâu đỏ của tế bào mạch dẫn ngay dưới mô phân sinh ngọn; triệu chứng có thể
có là làm cho 1 phần thân bị chuyển thành màu hồng ngay tại các đỉnh sinh trưởng
của chồi non hay hóa đỏ cam tại các bó mạch ở giữa đốt của những thân mía đã
trưởng thành (Brumbley và ctv., 2006).
2.3.3. Sự phát triển, lan truyền dịch bệnh
Vi khuẩn Lxx kí sinh chuyên tính trong cây mía và không có môi giới lan
truyền bệnh; bệnh lây nhiễm trong cánh đồng do sử dụng hom giống đã bị nhiễm
bệnh. Bởi vì triệu chứng của bệnh không thể quan sát được bằng mắt nên vi khuẩn
có thể lan truyền từ vùng này sang vùng khác một cách "âm thầm" mà người nông
dân vẫn không biết cánh đồng mía của họ đang bị bệnh. Thậm chí, khi thấy ruộng
Hình 2.5. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc
(Nguồn: www.pakissan.com/english/allabout/crop/sugarcane.shtml)
a) Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; b) Đốt thân ngắn; c) Vết đổi màu trong thân cây mía bệnh


28
mía có dấu hiệu chậm phát triển, người ta thường quy cho các nguyên nhân khác
như: điều kiện canh tác nghèo nàn, thiếu độ ẩm hoặc chất dinh dưỡng.
Vi khuẩn Lxx phát tán, lây lan trong đồng ruộng một cách nhanh chóng thông
qua các dụng cụ thu hoạch cơ giới hay thủ công, trong đó sự lây nhiễm do máy móc
khi thu hoạch cơ giới rất đáng kể. Các loài động vật ăn mía cũng có thể là tác nhân
truyền bệnh khi chúng gặm một thân mía bị bệnh sau đó lại tiếp tục gặm sang một
thân mía khỏe khác. Ngoài ra, có một vài báo cáo mới đây cho rằng vi khuẩn Lxx
vẫn tiếp tục sống sót trong đất sau khi thu hoạch và tái nhiễm vào rễ cây khỏe mạnh
thông qua vết thương; tuy nhiên, quy mô của sự lây nhiễm này vẫn chưa được biết
(Comstock và Lentini, 2005; Davis và Bailey, 2000).
Theo Bailey và Tough (1992); Damann (1992); Comstock và ctv. (1996), tùy
thuộc vào tính mẫn cảm của từng giống mía đối với bệnh mà mức độ lây nhiễm
cũng như mức thiệt hại khác nhau trong các cánh đồng. Thêm vào đó, các yếu tố bất
lợi về nhiệt độ, ẩm độ, ánh sáng, ngập lụt hay khô hạn cũng góp phần làm gia tăng

tỉ lệ bệnh. Bệnh gây thiệt hại nặng nề hơn trong các vụ mía gốc, mía tái sinh từ gốc
sót lại cũng dễ dàng lây bệnh sang mía tơ (Westphal và Mirkov, 2003).
2.3.4. Biện pháp ngăn chặn và kiểm soát dịch bệnh
Bệnh cằn mía gốc được xem là bệnh gây hại nghiêm trọng nhất tác động đến
sản lượng mía trên thế giới. Vi khuẩn Lxx chủ yếu làm cản trở sự vận chuyển nước
và chất dinh dưỡng của cây (Kao và Damann, 1978; 1980). Bởi vì cây mía có thể
phát triển thành 4 - 5 vụ mía gốc từ một vụ mía tơ nên phải thận trọng, tránh sự xâm
nhiễm của loại vi khuẩn này lên toàn bộ cánh đồng (Westphal và Mirkov, 2003).
Để tiêu diệt hay ngăn cản sự xâm nhiễm của mầm bệnh nên ngâm mía trong
nước nóng (50 C) trong hai giờ trước khi đem trồng. Các dụng cụ thu hoạch phải
được rửa sạch và sát trùng bằng hóa chất trước khi thu hoạch sang ruộng khác. Các
chất diệt trùng hóa học có thể sử dụng đối với dụng cụ cắt mía bao gồm: lysol,
dettol, ethanol, mirrol and roccal. Nên cho hóa chất tiếp xúc với bề mặt cắt ít nhất 5
phút để đảm bảo chắc chắn vô trùng. Ngoài ra, sử dụng giống kháng cũng là một
biện pháp hiệu quả để kiểm soát bệnh; mặc dù không có giống nào được tìm thấy là


29
miễn dịch hoàn toàn đối với sự xâm nhiễm của Lxx nhưng CP 78-1628 và CP 80-
1743 là 2 giống đã được chứng minh là có khả năng kháng đối với bệnh cằn mía
gốc (Comstock và Lentini, 2005).
2.4. Các phƣơng pháp chẩn đoán phát hiện vi khuẩn Lxx
2.4.1. Phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống
Phương pháp chẩn đoán truyền thống dựa vào các triệu chứng biểu hiện bên
ngoài như sự cằn cỗi của cây, sự chuyển thành màu hồng tại mô mạch ở các mắt của
cây mía trưởng thành và màu hồng nhạt ở các lóng cây non (Hughes và Steindl,
1955). Tuy nhiên cường độ biểu hiện có sự khác nhau rất lớn giữa các giống cây
cũng như giữa các cây trong cùng một giống. Thêm vào đó, triệu chứng biểu hiện
của bệnh không khác gì mấy so với bệnh do các tác nhân thông thường gây ra trên
mía như côn trùng, các nhân tố môi trường và sự hủy hoại cơ học (Gillaspie và

Teakle, 1989) (Trích dẫn bởi Taylor và ctv., 2003). Do đó, bệnh cằn mía gốc
thường được xác định thông qua các kĩ thuật phòng thí nghiệm.
2.4.2. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi
Kiểm tra trực tiếp dịch chiết nước mía bằng kính hiển vi đối pha hoặc kính
hiển vi nền tối ở độ phóng đại X-1000 để phát hiện vi khuẩn nhưng phương pháp
này có độ nhạy thấp (khoảng 1 x 10
6
tế bào/ml) và chậm khi chọn lọc một số lượng
mẫu lớn (Taylor và ctv., 2003). Việc phát hiện vi khuẩn dưới kính hiển vi đặc biệt
khó khăn đối với cây bị nhiễm Lxx ở giai đoạn đầu, sau khi tưới hoặc trong mùa
mưa; bởi vào các thời điểm này, nồng độ vi khuẩn Lxx ở trong dịch chiết nước mía
rất thấp (Davis và Bailey, 2000). Do đó, hiệu quả của phương pháp này phụ thuộc
rất nhiều vào kinh nghiệm của người quan sát.
2.4.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (Staining by Transpiration Method )
Sự kí sinh của các tế bào vi khuẩn Lxx làm ngăn cản sự hấp thu nước và chất
dinh dưỡng của cây; sự tạo gel và chất gôm trong bó mạch mộc là dấu hiệu sinh lý
quan trọng liên quan đến sự giảm sản lượng ở cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Giglioti
và ctv., 1999). Dựa vào các đặc điểm trên, phương pháp nhuộm STM đã được phát
triển nhằm chẩn đoán, phát hiện cây mía bị bệnh.


30
2.4.4. Phƣơng pháp huyết thanh học
Kĩ thuật huyết thanh bao gồm nhuộm kháng thể huỳnh quang (fluorescent-
antibody staining - FAT), kĩ thuật miễn dịch dot blot (dot blot immunoassay) và kĩ
thuật ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbant Assay). Gần đây, người ta đã cải tiến
kĩ thuật miễn dịch dot blot thành kĩ thuật phân tích miễn dịch học enzyme liên kết
với mô mẫu (Tissue Blot Immunoassay - TBIA) để chẩn đoán bệnh và đánh giá
mức độ nghiêm trọng của bệnh. Ưu điểm của kĩ thuật này là có thể phát hiện Lxx
trong một số lượng lớn mẫu mía một cách nhanh chóng; ngoài ra, kĩ thuật này còn

được sử dụng để chọn lọc dòng kháng bệnh và xác định mức độ tác động của bệnh
đối với cây giống (Comstock và Lentini, 2005).
Nhuộm kháng thể huỳnh quang: Harris và Gillaspie (1978) là những người
đầu tiên đưa ra phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp (FAT) sử dụng kháng
huyết thanh đặc hiệu với Lxx để chẩn đoán bệnh cằn mía gốc. Brlansky và ctv.
(1982) đã phát hiện Lxx trực tiếp trên mẫu mía bằng cách dùng kháng thể IgG đặc
hiệu để gắn kết Lxx với tetramethylrhodamine isothiocyanate (TRITC) (Trích dẫn
bởi Nguyễn Anh Khoa, 2006). Năm 1985, Davis phát triển kỹ thuật đếm trực tiếp
kháng thể gắn huỳnh quang trên màng lọc (FADCF) cho độ nhạy gấp 100 lần FAT.
Màng lọc được kiểm tra có vi khuẩn gắn huỳnh quang hay không bởi kính hiển vi
huỳnh quang ở độ phóng đại 1200 lần (Trích dẫn bởi Westphal and Mirkov, 2003).
Kĩ thuật miễn dịch dot blot: dịch chiết nước mía (50 μl) được trộn với 10 mM
PBS, pH 7,2 theo tỉ lệ 1:1 (v:v). 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS được lọc qua
màng NCM 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở
80°C trong 60 phút trước khi đem nhuộm bằng phương pháp EIA/TBIA. Các phản
ứng dương tính được nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng.
Phân tích miễn dịch học enzym liên kết với mô mẫu: vi khuẩn được tách ra
khỏi mô bị bệnh nhờ ly tâm, được dính lên màng nitrocellulose (NCM) và được
nhuộm kháng thể. Những giếng màu xanh xuất hiện trên màng NCM là mẫu dương
tính đối với vi khuẩn Lxx khi đem phân tích miễn dịch học.